مقالة منهجية

غرسة محرك خفيفة الوزن لتسجيلات Tetrode المزمنة في الفئران اليافعة

4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65228

⸱

يونيو 2, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Neuroscience Graduate Program, UT Southwestern Medical Center, 3O’Donnell Brain Institute, UT Southwestern Medical Center, 4Department of Psychiatry, UT Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف تصميم محرك الأقراص الصغير ، وإجراء الزرع الجراحي ، واستراتيجية التعافي بعد الجراحة التي تسمح بتسجيلات الحقل المزمن والوحدة الواحدة من مناطق الدماغ المتعددة في وقت واحد في الفئران الأحداث والمراهقين عبر نافذة تنموية حرجة من يوم ما بعد الولادة 20 (p20) إلى يوم ما بعد الولادة 60 (p60) وما بعده.

الملخص

يوفر الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي نظرة ثاقبة لا مثيل لها في ديناميكيات الدوائر دون المستوى الثاني للدماغ السليم ويمثل طريقة ذات أهمية خاصة لدراسة نماذج الفئران للاضطرابات العصبية والنفسية البشرية. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب غرسات جمجمية كبيرة ، والتي لا يمكن استخدامها في الفئران في نقاط زمنية مبكرة من النمو. على هذا النحو ، لم يتم إجراء أي دراسات تقريبا لعلم وظائف الأعضاء في الجسم الحي على الفئران الرضع أو الأحداث التي تتصرف بحرية ، على الرغم من حقيقة أن الفهم الأفضل للتطور العصبي في هذه النافذة الحرجة من المرجح أن يوفر رؤى فريدة حول اضطرابات النمو المعتمدة على العمر مثل التوحد أو الفصام. هنا ، يتم وصف تصميم محرك الأقراص الصغير ، وإجراء الزرع الجراحي ، واستراتيجية التعافي بعد الجراحة التي تسمح بتسجيلات المجال المزمن والوحدة الواحدة من مناطق الدماغ المتعددة في وقت واحد في الفئران مع تقدمهم في العمر من يوم ما بعد الولادة 20 (p20) إلى يوم ما بعد الولادة 60 (p60) وما بعده ، نافذة زمنية تتوافق تقريبا مع الأعمار البشرية من عامين حتى مرحلة البلوغ. يمكن تعديل وتوسيع عدد أقطاب التسجيل ومواقع التسجيل النهائية بسهولة ، مما يسمح بالتحكم التجريبي المرن في المراقبة في الجسم الحي لمناطق الدماغ ذات الصلة بالسلوك أو المرض عبر النمو.

المقدمة

يخضع الدماغ لتغييرات واسعة النطاق خلال النوافذ التنموية الحرجة للطفولة والمراهقة1،2،3. تظهر العديد من الأمراض العصبية والنفسية ، بما في ذلك التوحد والفصام ، لأول مرة سلوكيا وبيولوجيا خلال هذه الفترة من نمو دماغ الأحداث والمراهقين4،5،6. في حين أن الكثير معروف فيما يتعلق بالتغيرات الخلوية والمشبكية والجينية التي تحدث عبر التطور المبكر ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل نسبيا فيما يتعلق بكيفية تغير العمليات على مستوى الدائرة أو الشبكة خلال هذه النافذة الزمنية. الأهم من ذلك ، أن وظيفة الدماغ على مستوى الدائرة ، والتي تكمن في النهاية وراء السلوكيات المعقدة والذاكرة والإدراك ، هي خاصية ناشئة لا يمكن التنبؤ بها للوظيفة الخلوية والمشبكية7،8،9،10. وبالتالي ، لفهم وظائف الدماغ على مستوى الشبكة بشكل كامل ، من الضروري دراسة النشاط العصبي مباشرة على مستوى الدائرة العصبية السليمة. بالإضافة إلى ذلك ، لتحديد كيفية تغيير نشاط الدماغ طوال تطور الاضطرابات العصبية والنفسية ، من الأهمية بمكان فحص نشاط الشبكة في نموذج مرض صالح خلال النافذة الزمنية المحددة عندما تظهر الأنماط الظاهرية السلوكية للمرض وتتبع التغييرات الملحوظة أثناء استمرارها في مرحلة البلوغ.

يعد الفأر أحد أكثر الكائنات النموذجية العلمية شيوعا وقوة ، مع وجود أعداد كبيرة من السلالات الجينية الفريدة التي تمثل اضطرابات النمو العصبي مع بداية تعتمد على العمر للأنماط الظاهرية السلوكية و / أو ذاكري 11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21. في حين أنه من الصعب ربط النقاط الزمنية التنموية الدقيقة بين أدمغة البشر والفئران ، تشير المقارنات المورفولوجية والسلوكية إلى أن الفئران p20-p21 تمثل الأعمار البشرية من 2-3 سنوات ، وتمثل الفئران p25-p35 الأعمار البشرية من 11-14 سنة ، مع احتمال وصول الفئران إلى المكافئ التنموي لشخص بالغ يبلغ من العمر 20 عاما بواسطة p603 ، 22. وبالتالي ، لفهم كيفية تطور دماغ الأحداث بشكل أفضل وتحديد كيف تصبح الشبكات العصبية للدماغ مختلة وظيفيا في أمراض مثل التوحد أو الفصام ، سيكون من المثالي مراقبة نشاط الدماغ مباشرة في الجسم الحي في الفئران عبر الأعمار من 20 يوما إلى 60 يوما.

ومع ذلك ، فإن التحدي الأساسي في مراقبة نشاط الدماغ عبر التطور المبكر في الفئران هو صغر حجم الفئران اليافعة وضعفها النسبي. عادة ما يتطلب الزرع المزمن للأنقيب الكهربائية ، وهو أمر ضروري للدراسات الطولية لنمو الدماغ ، غلافا كبيرا وضخما لحماية أسلاك القطب الدقيقة ولوحات الواجهة23،24 ، ويجب أن تكون الغرسات متصلة بإحكام بجمجمة الفأر ، وهي أرق وأقل صلابة في الفئران الصغيرة بسبب انخفاض التعظم. وهكذا ، تم إجراء جميع الدراسات تقريبا لفسيولوجيا القوارض في الجسم الحي في الأشخاص البالغين بسبب حجمها النسبي وقوتها وسمك جمجمتها. حتى الآن ، تم إجراء معظم الدراسات التي تستكشف فسيولوجيا دماغ القوارض اليافعة في الجسم الحي في الفئران اليافعة من النوع البري ، مما يحد بالضرورة من القدرة على مراقبة وظائف دماغ الأحداث تجريبيا في نموذج يتصرف بحرية لاضطراب بشري 25،26،27،28،29،30.

تصف هذه المخطوطة السكن الجديد للزرع ، وإجراء الزرع الجراحي ، واستراتيجية التعافي بعد الجراحة لدراسة وظائف الدماغ طويلة المدى (حتى 4 أسابيع أو أكثر) في الجسم الحي للفئران اليافعة عبر نافذة زمنية حرجة من الناحية التنموية (p20 إلى p60 وما بعدها). يسمح إجراء الزرع بالتثبيت الموثوق والدائم للأقطاب الكهربائية على جماجم الفئران اليافعة. علاوة على ذلك ، فإن تصميم محرك الأقراص الصغير خفيف الوزن ، حيث يزن هذا المحرك الصغير ~ 4-6 جم عند تجميعه بالكامل ، وبسبب الحد الأدنى من الموازنة المطلوبة لتعويض وزن الغرسة ، فإنه لا يؤثر على الأداء السلوكي للفئران اليافعة خلال النماذج السلوكية النموذجية.

البروتوكول

تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة للمركز الطبي بجامعة تكساس الجنوبية الغربية (البروتوكول 2015-100867) وتم إجراؤها وفقا لكل من المبادئ التوجيهية المؤسسية والمعهد الوطني للصحة. تم زرع الفئران الذكور والإناث C57 / Bl6 المستخدمة في الدراسة الحالية في p20 (الوزن 8.3-11.1 جم في وقت الزرع).

1. تصميم وبناء محرك الأقراص الصغيرة

  1. تصميم وطباعة محرك الأقراص الصغير رقميا (الشكل 1)
    1. قم بتنزيل قوالب طراز محرك الأقراص الصغير (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
    2. تحديد المواقع التجسيمية لمنطقة (مناطق) الدماغ المستهدفة في أطلس تجسيمي مناسب.
    3. باستخدام برنامج التصميم ثلاثي الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر (3D CAD) ، قم بتحميل قالب قنية محرك الأقراص الصغير (الشكل 1B).
    4. إذا لزم الأمر ، قم بتعديل مواقع إخراج قنية الإخراج على نموذج قنية محرك الأقراص الصغير لاستهداف منطقة (مناطق) الدماغ المطلوبة.
      ملاحظة: يجب أن يكون طول كل قذف ثقب قنية 2 مم على الأقل لضمان خروج رباعي القنية من فتحة القنية التي تستهدف الهدف مباشرة. تم تصميم قالب قنية محرك الأقراص الصغير لاستهداف القشرة الحزامية الأمامية بشكل ثنائي (رباعي واحد لكل نصف كرة) ، ومنطقة الحصين CA1 (أربعة رباعيات لكل نصف كرة) ، ومنطقة الحصين CA3 (رباعيان لكل نصف كرة) ، مع رباعي مرجعي واحد لكل نصف كرة موضوعة في المادة البيضاء فوق منطقة الحصين CA1.
    5. إذا لزم الأمر ، قم بتعديل جسم محرك الأقراص الصغير (الشكل 1A) لاستيعاب ملحق لوحة الواجهة الإلكترونية (EIB).
    6. اطبع جسم محرك الأقراص الصغير والقنية والمخروط والغطاء بدقة عالية على طابعة 3D (من الناحية المثالية بدقة أفضل من 25 ميكرومتر) ، وقم بإعداد المواد المطبوعة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. استخدم راتنجات الطابعة ذات الصلابة العالية.
  2. تجميع البراغي والمرفقات المخصصة (الشكل 2 أ ، ب)
    1. باستخدام برنامج 3D CAD ، قم بتحميل نماذج المرفقات اللولبية (الشكل 1E).
    2. اطبع المرفقات اللولبية بدقة عالية على طابعة 3D (من الناحية المثالية بدقة لا تقل عن 25 ميكرومتر) ، وقم بإعداد المواد المطبوعة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. استخدم راتنجات الطابعة ذات الصلابة العالية.
    3. قم بتثبيت المرفقات اللولبية على كل برغي متقدم رباعي (الشكل 1F) (يتم تصنيع البراغي المتقدمة رباعي الرؤوس خصيصا في ورشة الآلات قبل بناء محرك الأقراص الصغير).
      1. قم بتثبيت مرفقين لولبيين على كل برغي ، أحدهما أعلى والآخر أسفل التلال. تأكد من أن الجزء السفلي من كل ملحق لولبي يلامس التلال. امسك ملحقات المسمار مع هلام cyanoacrylate.
      2. بمجرد التثبيت ، تأكد من أن ملحقات المسمار لا تتحرك في المحور الطولي للبرغي ولكنها تدور بحرية بأقل مقاومة.
  3. تجميع جسم محرك الأقراص الصغير (الشكل 2C ، D)
    1. باستخدام مقص ناعم وحاد ، قم بقطع أنابيب بوليميد كبيرة (القطر الخارجي: 0.2921 مم ، القطر الداخلي: 0.1803 مم) إلى أقسام بطول ~ 6 سم.
    2. مرر أقسام البوليميد الكبيرة من خلال فتحات الإخراج الموجودة على قنية محرك الأقراص الصغير بحيث يمتد كل أنبوب إلى ما وراء قاع القنية ببضعة ملليمترات.
    3. باستخدام إبرة نظيفة 30 جم ، قم بتثبيت البوليميد على القنية عن طريق وضع كميات صغيرة من cyanoacrylate السائل. احرص على عدم السماح للسيانواكريلات بالدخول إلى داخل أنبوب البوليميد.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي تقطير السائل cyanoacrylate إلى أسفل في القنية من خلال الجزء العلوي من جسم محرك الأقراص إلى تسريع هذه العملية ولكنه سيتطلب إعادة تنظيف ثقوب التوجيه لاحقا باستخدام مثقاب ذو رأس دقيق.
    4. مرر أنابيب البوليميد الكبيرة من أعلى قنية محرك الأقراص الصغير من خلال فتحات البوليميد الكبيرة المناسبة في جسم محرك الأقراص الصغير.
    5. ادفع ببطء قنية محرك الأقراص الصغير وجسم محرك الأقراص الصغير معا حتى يصبحا متجاورين وتتشابك علامات تبويب مرفق القنية / الجسم. احرص على عدم التواء أو إتلاف أنابيب البوليميد في هذه العملية.
      ملاحظة: يجب أن يمر كل أنبوب بوليميد بسلاسة من أسفل القنية إلى خارج الجزء العلوي من جسم محرك الأقراص الصغير. الانحناء الطفيف أمر طبيعي ، لكن الانحناء المفرط لأنبوب البوليميد يمكن أن يشوه رباعي ويمنعه من المرور مباشرة إلى الدماغ.
    6. قم بتثبيت جسم محرك الأقراص الصغير وقنية محرك الأقراص الصغير معا باستخدام cyanoacrylate.
    7. باستخدام شفرة حلاقة حادة جديدة ، اقطع نهايات أنبوب البوليميد الكبيرة التي تنبثق من قاع فتحات إخراج القنية. تأكد من أن القطع موجود بالضبط في قاعدة القنية ، مما يجعل الأنابيب وقاع القنية يتدفقان مع بعضهما البعض.
    8. باستخدام مقص حاد ، قم بقطع أنبوب البوليميد الكبير فوق حافة الحافة الداخلية لجسم محرك الأقراص بزاوية ~ 45 درجة.
  4. تحميل البراغي المخصصة المجمعة (الشكل 2E)
    1. قم بربط كل برغي مخصص مجمع في الثقوب الخارجية لجسم محرك الأقراص الصغير. تأكد من مرور الدليل اللولبي عبر الفتحة الكبيرة في ملحقات المسمار. تقدم كل برغي بالكامل حتى لا يتقدم أكثر. يوصى بالتشحيم المسبق للبراغي بالزيت المعدني أو شحم المحور.
    2. باستخدام مقص حاد للغاية ، قم بقطع أنابيب بوليميد صغيرة (القطر الخارجي: 0.1397 مم ، القطر الداخلي: 0.1016) إلى أقسام بطول ~ 4 سم.
    3. مرر أقسام البوليميد الصغيرة عبر أنبوب بوليميد الكبير المثبت بالفعل في محرك الأقراص الصغير. تأكد من أن أنابيب البولي ميد الصغيرة الزائدة تبرز من أعلى وأسفل كل أنبوب بوليميد كبير.
    4. قم بتثبيت أنابيب البولي ميد الصغيرة على المرفقات اللولبية عبر cyanoacrylate ، مع الحرص على عدم السماح لأي cyanoacrylate بالدخول إلى أنابيب البولي imide الكبيرة أو الصغيرة.
    5. باستخدام شفرة حلاقة جديدة وحادة ، اقطع نهايات أنبوب البوليميد الصغيرة التي تنبثق من قاع ثقوب الكانيولا. تأكد من أن القطع موجود بالضبط في قاعدة القنية وأن القطع نظيف ، مع عدم وجود أي شيء يسد فتحة أنبوب البوليميد.
    6. باستخدام مقص حاد ، قم بقص الجزء العلوي من البوليميد الصغير بضعة ملليمترات فوق الجزء العلوي من ملحق المسمار بزاوية ~ 45 درجة. تأكد من أن القطع نظيف ، مع عدم وجود أي شيء يسد فتحة أنبوب البوليميد.
  5. تحميل رباعيات
    1. تحضير tetrodes (~ 6 سم في الطول) باستخدام الطرق الموصوفة سابقا31.
    2. باستخدام ملقط من السيراميك أو المطاط ، قم بتمرير رباعي بعناية عبر أحد أنابيب البوليميد الصغيرة ، تاركا ~ 2 سم بارزا من أعلى أنبوب البوليميد الصغير.
    3. قم بتثبيت رباعي الرباعيات في الجزء العلوي من أنبوب بوليميد الصغير عبر سيانواكريلات سائلة ، مع الحرص على عدم تثبيت أنابيب البوليميد الصغيرة والكبيرة معا في هذه العملية.
    4. اسحب المسمار حتى يقترب من الجزء العلوي من محرك الأقراص.
    5. أمسك بسلك رباعي البروز من أسفل محرك الأقراص ، وقم بتثبيته برفق عند النقطة التي يخرج فيها من القنية.
    6. ادفع المسمار بالكامل إلى محرك الأقراص.
    7. باستخدام مقص حاد جدا ، قم بقطع سلك tetrode فوق التواء مباشرة. تحت المجهر ، تأكد من أن القطع نظيف وأن المعدن من جميع رباعيات رباعي مكشوف.
    8. اسحب المسمار حتى يتم تثبيت tetrode فقط داخل القنية.
    9. كرر الخطوات 1.5.2-1.5.8 لجميع البراغي.
    10. قم بتوصيل بنك الاستثمار الأوروبي بمنصة دعم بنك الاستثمار الأوروبي عبر مسامير المجوهرات الصغيرة.
    11. قم بتوصيل كل قطب كهربائي لكل رباعي بالمنفذ المناسب في بنك الاستثمار الأوروبي.
  6. تحضير محرك الأقراص الصغير للجراحة
    1. صفيحة رباعية كهربائيا لتقليل المعاوقة الكهربائية باستخدام الطرق الموصوفة مسبقا31.
    2. بعد الطلاء ، تأكد من وضع كل رباعي في القنية بحيث يكون طرف tetrode متدفقا مع قاع كل فتحة قنية.
    3. حرك مخروط محرك الأقراص الصغير حول محرك الأقراص الصغير المكتمل. قم بتوصيل غطاء محرك الأقراص الصغير بمخروط محرك الأقراص الصغير عن طريق تحريك عمود التثبيت المخروطي في منفذ الغطاء.
    4. قم بتوجيه المخروط بحيث تمر موصلات بنك الاستثمار الأوروبي بحرية عبر فتحات تمرير اتصال بنك الاستثمار الأوروبي عند إغلاق الغطاء ، وقم بلصق المخروط في مكانه باستخدام cyanoacrylate الموضوعة حول قاعدة المخروط ، مع الحرص على عدم السماح لأي cyanoacrylate بالدخول إلى أي من فتحات إخراج القنية. انزع الغطاء.
    5. ردم بعناية كل ثقب قنية بزيت معدني معقم لمنع سوائل الجسم من دخول ثقوب البوليميد بعد الزرع الجراحي.
    6. معطف بعناية قاعدة القنية مع هلام البترول معقمة. سيكون هذا بمثابة حاجز لمنع العوامل الكيميائية (مثل الأسمنت السني) من دخول الدماغ المكشوف أثناء الجراحة.
    7. قم بوزن محرك الأقراص الصغير المجمع بالكامل والغطاء وأربعة براغي عظمية لتحضير موازنة متساوية الوزن.
    8. اختياريا ، قبل الجراحة ، قم ببثق tetrodes على مسافة مناسبة للوصول إلى مناطق الدماغ المستهدفة بمجرد تدفق محرك الأقراص مع الجمجمة.
      ملاحظة: قبل الزرع الجراحي ، قم بتعقيم الغرسة عن طريق التعقيم بالغاز في أكسيد الإيثيلين (500-1200 مجم / لتر ، 2-4 ساعات).  يجب تعقيم جميع مسامير العظام والأدوات الجراحية عن طريق الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 30 دقيقة).

2. الزرع الجراحي

  1. تخدير الماوس وتركيبه في الجهاز التجسيمي
    1. ضع الماوس في صندوق صغير به مساحة كافية للتحرك ، وقم بتخدير الماوس باستخدام 3٪ -4٪ إيزوفلوران.
      ملاحظة: يمكن استخدام عوامل مخدرة أخرى ، ولكن يجب توخي الحذر بسبب عمر وحجم ووزن موضوع الفأر اليافع.
    2. بمجرد عدم استجابة الماوس (لا توجد استجابة لقرص الذيل ، معدل تهوية ~ 60 نفسا في الدقيقة) ، قم بإزالته من الصندوق ، وقم بتثبيته بسرعة على جهاز التجسيم.
    3. بسرعة ، ضع قناع التجسيم على خطم الماوس وحافظ على التخدير بنسبة 1-3٪ إيزوفلوران. ضع أي مسكن للألم معتمد من الطبيب البيطري ، مثل البوبرينورفين ذو الإطلاق المستدام (0.05-0.5 مجم / كجم تحت الجلد) ، أو العوامل المضادة للالتهابات ، مثل كاربروفين (5-10 مجم / كجم تحت الجلد) ، قبل الشق الجراحي الأولي.
    4. تأمين رأس الماوس بالكامل في الجهاز التجسيمي باستخدام قضبان الأذن. تأكد من أن الجمجمة مستوية وغير متحركة دون الضغط غير الضروري على قنوات أذن الماوس. بسبب التعظم المحدود لعظام جمجمة الأحداث ، من الممكن التسبب في ضرر دائم أثناء تثبيت الرأس.
  2. تحضير الفأر للجراحة وكشف الجمجمة
    1. حماية عيون الماوس عن طريق وضع كمية صغيرة من هلام المسيل للدموع الاصطناعية على كل عين وتغطية كل عين مع رقعة معقمة من رقائق معدنية.
      ملاحظة: ستحافظ الدموع الاصطناعية على رطوبة العينين ، بينما تمنع الرقاقة أي مصدر ضوء من التسبب في ضرر طويل المدى. يفضل استخدام محاليل التمزق الاصطناعية السميكة لأنها يمكن أن تكون أيضا بمثابة حاجز أمام الإدخال غير المقصود للحلول الجراحية الأخرى التي يحتمل أن تكون سامة (الإيثانول ، أكريليك الأسنان ، إلخ) في العينين.
    2. باستخدام مسحات معقمة ذات رؤوس قطنية ، ضعي كريم إزالة الشعر على المنطقة الجراحية لإزالة الشعر من فروة الرأس. احرص على عدم وضع الكريم بالقرب من العينين. بعد إزالة الشعر ، ضع ستارة معقمة على فروة الرأس لتأمين المنطقة الجراحية.
    3. باستخدام مسحات معقمة ذات رؤوس قطنية ، قم بتنظيف فروة الرأس عن طريق ثلاث غسلات متتالية من محلول البوفيدون واليود (10٪) متبوعا بكحول الأيزوبروبيل (100٪).
    4. باستخدام مشرط معقم أو مقص ناعم ، قم بإزالة فروة الرأس.
    5. باستخدام مسحات معقمة ذات رؤوس قطنية ومحاليل معقمة من محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) وبيروكسيد الهيدروجين ، قم بتنظيف الجمجمة تماما.
    6. حدد bregma ، وباستخدام الجهاز التجسيمي ، حدد بعناية مواقع التسجيل المستهدفة على الجمجمة بعلامة دائمة.
  3. فتح فتحة القنية وربط المراسي العظمية
    1. قم بإزالة الجمجمة التي تغطي مواقع التسجيل. # بسبب نحافة الجمجمة في هذا العمر ، قم بقطع الجمجمة بشفرة مشرط ؛ هذا يزيل ضرورة استخدام المثقاب ، والذي قد يتلف الجافية الأساسية. حافظ على رطوبة الجافية المكشوفة باستخدام محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) أو زيت معدني معقم. لا تقم بإزالة أو ثقب الجافية في هذه المرحلة ، لأنها رقيقة بما فيه الكفاية في الفئران الأحداث لمرور tetrodes في الخطوات المستقبلية.
    2. حفر بعناية ثقوب تجريبية لأربعة مسامير العظام.
      1. ضع البراغي العظمية في الأجزاء الجانبية والمنضدية أو الذيلية القصوى من الجمجمة ، حيث يكون العظم أكثر سمكا وتكون مسامير العظام بعيدة بما فيه الكفاية عن غرسة محرك الأقراص الدقيقة. بالنسبة لمسامير العظام ، استخدم مسامير مجوهرات معقمة ودقيقة (على سبيل المثال ، خيط UNM 120 ، رأس 1.5 مم).
      2. قم بلف برغي عظمي واحد بإحكام بسلك رفيع عالي التوصيل يعمل كأرضية ويتم توصيله ببنك الاستثمار الأوروبي في الخطوة 2.4.6.
    3. باستخدام شفرة مشرط أو باستخدام مثقاب بعناية ، قم بتسجيل الجمجمة بالقرب من مواقع ثقب المسمار العظمي. التسجيل مهم لتوفير سطح خشن بما فيه الكفاية لربط cyanoacrylate السائل في الخطوة 2.3.5.
    4. باستخدام مفك براغي معقم ومشبك لولبي معقم ، قم بربط كل برغي عظمي معقم في مكانه ، مع الحرص على عدم اختراق الجافية الأساسية.
    5. باستخدام إبرة معقمة 30 جم ، ضع cyanoacrylate السائل حول كل برغي عظمي. هذا يثخن الجمجمة بشكل فعال حيث تم ربط مسامير العظام. احرص على عدم السماح لأي سيانواكريلات بالدخول إلى الجافية المكشوفة فوق مواقع التسجيل.
  4. خفض وتوصيل محرك الأقراص الصغير (الشكل 2G)
    1. قم بتركيب محرك الأقراص الصغير المكتمل على جهاز التجسيم ليتم إنزاله بعناية على جمجمة الفأر. تأكد من أن قنية محرك الأقراص الصغير ستكون عند الإحداثيات المناسبة عند خفضها.
    2. اخفض محرك الأقراص الصغير ببطء ، وتحرك فقط في الاتجاه الظهري / البطني. خفض محرك الأقراص الصغير مع تقدم tetrodes بالفعل من ثقوب القنية (الخطوة 1.6.6) من أجل تصور دخولها إلى الدماغ ؛ يمكن لأي حركة وسطية / جانبية أو منضدية / ذيلية عندما تلمس رباعيات الماوس أن تنحني الرباعيات وتتسبب في تفويت وجهتها النهائية.
    3. بمجرد خفض محرك الأقراص الصغير بالكامل ، تأكد من أن قاعدة القنية تتلامس فقط مع الجمجمة / الجافية. ستكون طبقة الفازلين و / أو الزيت المعدني بمثابة حاجز لتغطية الجافية المكشوفة. إذا لزم الأمر ، أضف هلام البترول المعقم أو شمع العظام المعقم لتغطية الجافية المكشوفة الزائدة.
    4. أثناء تثبيت محرك الأقراص الصغير في مكانه باستخدام الجهاز التجسيمي ، قم بتغطية الجمجمة بأسمنت الأسنان لتثبيت قاعدة محرك الأقراص الصغير على مسامير العظام المزروعة.
      ملاحظة: يجب أن يغلف الأسمنت السني جميع البراغي العظمية بالكامل ويجب أن يغطي حافة تثبيت الأسمنت السني على قنية محرك الأقراص الصغير.
    5. أثناء تثبيت الأسمنت السني ، قم بتشكيله بعناية لمنع الزوايا أو الحواف الحادة التي قد تضر الماوس أو تتلف محرك الأقراص الصغير. تأكد من وجود أسمنت أسنان كاف لتثبيت محرك الأقراص الصغير ، ولكن تخلص من الأسمنت السني المفرط الذي سيضيف وزنا غير ضروري.
    6. قم بربط السلك الأرضي بعناية من خلال محرك الأقراص الصغير ، وقم بتوصيله بالفتحة المناسبة في بنك الاستثمار الأوروبي.
    7. بمجرد ضبط الأسمنت السني بالكامل ، افصل محرك الأقراص الصغير بعناية عن الجهاز المجسم. ضع الغطاء على محرك الأقراص الصغير.
    8. باستخدام مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية ومحلول ملحي معقم ، قم بتنظيف الماوس.
    9. باستخدام مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية ، ضع طبقة رقيقة من مرهم مضاد حيوي على أي فروة رأس مكشوفة بالقرب من موقع الزرع.
    10. قم بإزالة الرقاقة من عيون الماوس.
    11. قم بإزالة الماوس من جهاز التجسيم ، مع الحرص على دعم الوزن الإضافي لمحرك الأقراص الصغير أثناء نقل الماوس إلى قفص نظيف.

3. التعافي بعد الجراحة

  1. انتعاش فوري
    1. قبل الجراحة ، قم بإعداد نظام الموازنة عن طريق توصيل أنبوب PVC بقطر 0.75 ، كما هو موضح في الشكل 2G. يمر ذراع واحد من النظام عبر ثقوب محفورة في غطاء القفص ، ويستقر الذراع الثاني أعلى غطاء القفص ، ويمتد الذراع الثالث فوق القفص وخارجه. الذراع العلوي متوج.
    2. قم بتوصيل محرك الأقراص الصغير بعناية بنظام الموازنة (الشكل 2G-I) ، واستخدم وزنا موازنا مطابقا لوزن محرك الأقراص الصغير ومسامير العظام. قم بتشغيل خيط قوي أو خيط صيد من موصل متصل ببنك الاستثمار الأوروبي على الأذرع الثلاثة لنظام الموازنة إلى وزن الموازنة ، الذي يتدلى فوق الذراع العلوي.
    3. تأكد من أن الموازنة متصلة بقوة بمحرك الأقراص الصغير EIB وأن هناك خطا كافيا لمنح الماوس وصولا كاملا إلى القفص بالكامل.
    4. توفير هلام غني بالمغذيات في القفص جنبا إلى جنب مع تشاو القوارض العادية المبللة لضمان الإماهة والتعافي.
    5. راقب الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير الجراحي.
  2. الانتعاش على المدى الطويل
    1. في جميع الأوقات ، عندما لا يتم توصيله بجهاز التسجيل ، تأكد من أن محرك الأقراص الصغير مدعوم بنظام الموازنة. قلل ثقل الموازنة بمرور الوقت ، ولكن لا تقم أبدا بإزالته تماما لتجنب الضغط غير المتوقع على الماوس أو عزم الدوران على مسامير العظام.
    2. لمنع تلف نظام الزرع والموازنة ، قم بإيواء الماوس دون إمكانية التفاعل المباشر مع الفئران الأخرى طوال مدة التجربة.
    3. توفير هلام غني بالمغذيات لمدة 3 أيام على الأقل بعد الجراحة ، وعند هذه النقطة سيكون الطعام الصلب وحده كافيا.
      1. نظرا للمتطلبات العامة لنظام الموازنة ، لا توفر الطعام والماء في شبكة سلكية علوية ؛ ضع الطعام على أرضية القفص ، ووفر الماء من خلال جانب القفص. لمنع التلف ، استبدل الطعام بالكامل يوميا.
    4. يوميا ، تأكد من أن الماوس لديه حرية الوصول إلى كامل القفص وأن الموازنة متصلة بقوة وقوة بمحرك الأقراص الصغير.

النتائج

تم استخدام البروتوكول الموصوف أعلاه لتسجيل إشارات المجال المحلي المحتملة والوحدات الفردية من مناطق الدماغ المتعددة في وقت واحد في الفئران ، مع إجراء تسجيلات يومية في نفس الفئران من p20 إلى p60. تم الإبلاغ هنا عن تسجيلات فسيولوجية كهربية تمثيلية من فأرين وأنسجة ما بعد التجربة توضح مواقع التسجيل النهائية.

الزرع الجراحي للمحرك الصغير في فئران p20
تم إنشاء محرك أقراص صغير (الشكل 1) (الشكل 2) وزرعه جراحيا في ماوس p20 ، كما هو موضح أعلاه. بعد الجراحة مباشرة ، تم ربط الماوس بنظام الموازنة (الشكل 2G-I) وسمح له بالتعافي. بمجرد أن أصبح الماوس متحركا بالكامل ، تم توصيل محرك الأقراص الصغير بنظام تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي. تم تعليق الكابلات التي تربط محرك الأقراص الصغير بجهاز التسجيل فوق الماوس. تم الحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية (32 كيلو هرتز) عبر جميع القنوات لمدة 1 ساعة بينما تصرف الفأر بشكل طبيعي في قفصه المنزلي. بعد التسجيل ، تم فصل الماوس عن نظام التسجيل ، وإعادة توصيله بنظام الموازنة ، وعاد إلى حظيرة الحيوان مع حرية الوصول إلى الماء والشو.

التسجيل اليومي للنشاط العصبي
تم الحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية يوميا لعدة أسابيع لتمكين المراقبة المزمنة لنفس منطقة الدماغ عبر النوافذ التنموية الحرجة ل p20-p60. يتم عرض عينة من إمكانات الحقل المحلي الخام (LFP) من عبر التسجيلات المزمنة في الشكل 3A ، C. تم الحصول على وحدات مفردة معزولة في وقت واحد من رباعيات متعددة (الشكل 3 ب). تم تحديد الوحدات ذات الأشكال الموجية المتشابهة عبر عدة أيام (الشكل 3B ، الوسط واليمين) ، ولكن نظرا للانجراف المحتمل لقطب التسجيل ، لم يكن من الممكن الادعاء بشكل قاطع أنه تم تحديد نفس الوحدة عبر الأيام. في فأر منفصل تم زرعه في p20 وتم تسجيله يوميا لعدة أسابيع ، تم فحص النشاط العصبي على رباعي يستهدف المنطقة الظهرية CA1. تم تحديد تموجات كبيرة السعة ووحدات مفردة معزولة جيدا في كل يوم من أيام التسجيل (الشكل 4). تشير هذه البيانات إلى أن التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية المستقرة وعالية الجودة في الجسم الحي يمكن أن تكون من نفس الفأر عبر التطور المبكر.

التأكيد النسيجي لمواقع التسجيل والتأثير التنموي للزرع المزمن
بعد يوم التسجيل الأخير ، تم تخدير الفأر تماما عن طريق تخدير الأيزوفلوران متبوعا بحقنة قاتلة من الصوديوم البنتوباربيتال ، وتم تمرير تيار عبر أطراف القطب لإنتاج آفات صغيرة في مواقع التسجيل. سمح التقسيم النسيجي بعد التجربة لدماغ الفأر بتصور مواقع التسجيل النهائية (الشكل 5 أ ، ب). في مجموعة منفصلة ، تم زرع ثلاثة ذكور وثلاث إناث من الفئران جراحيا في p20 كما هو موضح أعلاه. تم ترك أعداد متساوية من رفقاء القمامة دون زرع والحفاظ عليها في ظروف سكنية متطابقة. تم التضحية بالفئران في p62 (6 أسابيع بعد الجراحة للمجموعة المزروعة). تم تنظيف الجماجم بعناية ، وتم أخذ قياسات خارجية لمسافة بريجما إلى لامدا (الشكل 5C ، أعلى اليسار) وعرض الجمجمة الأقصى الخارجي عند لامدا (الشكل 5C ، أعلى اليمين). تم إجراء شق على طول خط الوسط من الجمجمة ، وتمت إزالة نصف الجمجمة لاستئصال الدماغ لقياس الكتلة (الشكل 5C ، أسفل اليمين). تم قياس ارتفاع تجويف الجمجمة في bregma من نصف الجمجمة السليم (الشكل 5C ، أسفل اليسار). لم يكن هناك مقياس يختلف اختلافا كبيرا بين الأفواج المزروعة وغير المزروعة (اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون) ، مما يشير إلى أن الزرع طويل الأمد ، بدءا من p20 ، ليس له تأثير جسيم على التطور الطبيعي للجمجمة أو حجم الدماغ.

figure-results-1
الشكل 1: مكونات محرك الأقراص الصغيرة. عروض ثلاثية الأبعاد لجسم محرك الأقراص الصغير (A) ، (B) القنية ، (C) المخروط ، (D) الغطاء ، (E) الملحقات اللولبية ، و (F) المسمار اللولبي المتقدم. يشار إلى الميزات الهامة لكل مكون. يمكن استخراج تفاصيل القياس من ملفات النموذج المتوفرة في https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: بناء محرك الأقراص الصغير . (A) منظر جانبي و (B) علوي للبرغي المتقدم رباعي الرؤوس مع توصيل ملحقات المسمار العلوي والسفلي. (ج) منظر جانبي و (د) علوي للمحرك الصغير مع توصيل الجسم والقنية وأنبوب بوليميد كبير يمر عبر كل فتحة قنية ومشذب إلى أسفل القنية. ( ه) منظر جانبي للمحرك الصغير مع وجود البراغي وأنابيب البولي ميد الصغيرة في مكانها. يتم قطع قمم أنابيب البوليميد الصغيرة مباشرة قبل تحميل رباعي. (و) محرك ميكرو مكتمل متصل بجهاز التجسيم. تمت إزالة المخروط الواقي الذي يحيط عادة بمحرك الأقراص الصغير لأغراض التصور. لاحظ أن بعض الملحقات اللولبية تمت طباعتها في راتينج أسود لمحرك الأقراص الصغير هذا. (ز) نظام دعم الموازنة. (ح) منظر جانبي و (I) علوي لقفص الماوس مع توصيل نظام دعم الموازنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية التمثيلية. تم زرع ماوس p20 بمحرك أقراص صغير كما هو موضح أعلاه. بدءا من p21 وكل يوم بعد ذلك لمدة أسبوعين ، تم توصيل الماوس بجهاز التسجيل ، وتم تسجيل النشاط العصبي لمدة 1 ساعة على الأقل. (أ) تسجيلات إمكانات المجال المحلي الخام (LFP) من الثنائية (L = اليسار ؛ R = يمين) القشرة الحزامية الأمامية (ACC) ، منطقة الحصين CA3 (CA3) ، ومنطقة الحصين CA1 (CA1). تم جمع البيانات كل يوم. للتوضيح ، يتم عرض البيانات من الأيام الفردية فقط. تم أخذ جميع الآثار خلال فترات الجمود في قفص المنزل. شريط المقياس: 1 مللي فولت ، 2 ثانية. (B) وحدات فردية تمثيلية معزولة من منطقة الحصين CA3 (يسار) و CA1 (يمين) للتسجيلات في اللوحة A. تظهر جميع أشكال الموجات الخام على كل قطب كهربائي باللون الأسود ؛ المتوسط باللون الأحمر. شريط المقياس: 50 ميكروفولت ، 0.2 مللي ثانية. (C) تتبع LFP الخام التمثيلي لكل يوم 10 حتى يوم التسجيل النهائي في p60 للماوس الثاني المزروع في p20. تم جمع البيانات كل يوم. للتوضيح ، يتم عرض البيانات فقط من كل يوم 10. تم أخذ جميع الآثار خلال فترات الجمود في قفص المنزل. شريط المقياس: 1 مللي فولت ، 2 ثانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. استقرار التسجيلات المزمنة. تم زرع ماوس p20 بمحرك أقراص صغير ، كما هو موضح أعلاه. بدءا من p21 وبعد ذلك لمدة 4 أسابيع ، تم توصيل الماوس بجهاز التسجيل ، وتم تسجيل النشاط العصبي لمدة 1 ساعة على الأقل. تظهر بيانات من رباعيات تستهدف الحصين الظهري CA1. (أ) LFP الخام (العلوي) والمفلتر بالتموج (السفلي) لأحداث التموج المحددة في p21 و p30 و p40. لتحديد أحداث التموج ، تم ترشيح LFP الخام لتمرير النطاق بين 125 هرتز و 300 هرتز ، وتم تحديد أحداث التموج على أنها زيادات عابرة في قدرة نطاق التموج أكبر من 3 انحرافات معيارية فوق المتوسط. تم تعريف بداية ونهاية كل تموج على أنها النقطة التي عادت فيها قوة نطاق التموج إلى المتوسط. تظهر التموجات المحددة باللون الأحمر. شريط المقياس: 100 مللي ثانية ، من أعلى إلى أسفل: 1000 ميكروفولت ، 140 ميكروفولت ، 1800 ميكروفولت ، 180 ميكروفولت ، 9000 ميكروفولت ، 1200 ميكروفولت ، 10000 ميكروفولت ، 1000 ميكروفولت. (ب) وحدة مفردة تمثيلية من كل يوم من رباعي CA1 المستهدف للتسجيلات في اللوحة أ. تظهر جميع أشكال الموجات الخام على كل قطب كهربائي باللون الأسود ؛ المتوسط باللون الأحمر. شريط المقياس 0.2 مللي ثانية ، من أعلى إلى أسفل: 50 ميكروفولت ، 100 ميكروفولت ، 100 ميكروفولت. (ج) مخطط تلقائي لجميع المسامير للوحدات المفردة في اللوحة باء. توضح هذه البيانات وضع القطب الكهربائي المستقر داخل الطبقة الهرمية الحصين على مدار عدة أسابيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: الأنسجة التمثيلية وتأثيرها على نمو الجمجمة. تم زرع ماوس p20 بمحرك أقراص صغير ، كما هو موضح أعلاه. بعد يوم التسجيل النهائي على p60 ، تم إنتاج آفات التحليل الكهربائي في مواقع التسجيل ، وتم ترشيح الدماغ بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد. لتحديد مواقع التسجيل ، تم إنتاج أقسام 50 ميكرومتر. أ: الآفات في CA1 و CA3 من الحصين. يشير رأس السهم إلى موقع تسجيل CA3 ؛ يشير رأس السهم المزدوج إلى موقع تسجيل CA1. شريط المقياس: 0.5 مم. (ب) الآفات في ACC الثنائية. تشير رؤوس الأسهم إلى مواقع تسجيل ACC. شريط المقياس: 0.5 مم. (C) قياسات حجم الجمجمة وكتلة الدماغ للفئران p62 المزروعة بمحرك صغير عند p20 (رمادي) والقمامة غير المزروعة (بيضاء). يتم الإبلاغ عن القيمة p لاختبار مجموع رتبة ويلكوكسون لكل قياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

غالبا ما تستخدم التجارب الحديثة التي تستكشف وظيفة الدائرة العصبية في الجسم الحي في القوارض الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية عبر أقطاب كهربائية مزروعة بشكل دائم لمراقبة نشاط الخلايا العصبية الفردية (أي الوحدات الفردية) أو السكان المحليين (عبر إمكانات المجال المحلي ، LFP) ، ولكن نادرا ما يتم تطبيق هذه الأساليب على الفئران اليافعة بسبب التحديات التقنية. تصف هذه المخطوطة طريقة للحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي في الفئران عبر النوافذ الحرجة من الناحية التنموية من p20 إلى p60 وما بعدها. تتضمن هذه المنهجية عملية تصنيع لطباعة وبناء غرسة محرك أقراص صغيرة ، وإجراء زرع جراحي ، واستراتيجية تعافي ما بعد الجراحة ، وكلها مصممة خصيصا للاستخدام في الفئران اليافعة. كانت هناك عدة اعتبارات مؤثرة في تطوير هذا البروتوكول ، بما في ذلك صغر حجم الفئران اليافعة وضعفها النسبي مقارنة بنظيراتها البالغة ، فضلا عن انخفاض تعظم جمجمة الفأر اليافعة التي يجب ربط محرك الأقراص الصغير بها.

طريقتان أساسيتان تستخدمان بشكل شائع لأداء الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي هما صفائف الأقطاب الكهربائية (على سبيل المثال ، رباعي الترودات) ومجسات السيليكون. مجسات السيليكون خفيفة الوزن ، ويمكن أن توفر عددا كبيرا من مواقع التسجيل لكل وحدة وزن ، وقد تم استخدامها سابقا في الفئراناليافعة 25. ومع ذلك ، فإن مجسات السيليكون باهظة الثمن نسبيا لكل وحدة. في المقابل ، يمكن إنشاء محرك الأقراص الصغير الموصوف في هذه المخطوطة باستخدام أقل من 50 دولارا أمريكيا من المواد الخام ، مما يجعله خيارا فعالا من حيث التكلفة للتسجيل في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يجب في كثير من الأحيان زرع مجسات السيليكون في خطوط ثابتة ، مما يحظر تسجيل مناطق الدماغ المتنوعة مكانيا. في المقابل، يستخدم تصميم محرك الأقراص الصغير الموصوف في هذه المخطوطة رباعيات قابلة للتعديل بشكل مستقل لاستيعاب التسجيلات المتزامنة في ما يصل إلى 16 موقعا مختلفا دون أي قيود تقريبا على العلاقة المكانية بين تلك المواقع. يمكن تعديل تصميم محرك الأقراص الصغير هذا بسهولة للسماح باستهداف مواقع مختلفة عن تلك الموضحة هنا عن طريق تحريك بثق فتحة القنية إلى أي موقع أمامي / خلفي ووسطي / بعيد مرغوب. عند استهداف مناطق الدماغ البديلة ، من المهم ملاحظة أنه في حين أن tetrodes غالبا ما تنتقل بشكل مستقيم ، فمن الممكن أن تنحرف هذه الأسلاك الرفيعة قليلا عند خروجها من قنية محرك الأقراص الصغيرة. وبالتالي ، كلما كانت منطقة الدماغ أصغر أو أكثر بطنية ، كلما كان من الصعب استهداف المنطقة بنجاح باستخدام رباعيات الترودات.

تشبه غرسة محرك الأقراص الصغيرة الموصوفة في هذه المخطوطة بشكل أساسي العديد من تصميمات محركات الأقراص الصغيرة السابقة القائمة على رباعي 23،32،33،34،35 من حيث أن tetrodes الفردية مثبتة على مسامير ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في عمق التسجيل لكل رباعي. في حين أن العديد من ميزات تصميم محرك الأقراص الصغير الحالي فريدة من نوعها ، بما في ذلك سهولة استهداف مناطق الدماغ الموزعة مكانيا ، فإن الحداثة الأساسية للمخطوطة الحالية هي وصف الزرع الجراحي واستراتيجيات التعافي بعد الجراحة ، والتي تسمح بإجراء دراسات مزمنة لنشاط الشبكة في الفئران اليافعة التي لا تزال في طور النمو. في الواقع ، يمكن تكييف منهجيات الجراحة والتعافي الموصوفة هنا لدعم عمليات الزرع الأخرى في الفئران اليافعة.

للحفاظ على تسجيل متسق عبر عدة أيام ، يجب تثبيت الأسلاك أو المجسات بشكل صارم على الجمجمة. في حين أن الهيكل العام لجمجمة الفأر يخضع لتغييرات طفيفة فقط بعد p20 ، فإن الجمجمة تتكاثف بشكل كبير بين الأعمار p20 و p4536. في الواقع ، الجمجمة في p20 ليست صلبة بما يكفي لدعم غرسة متصلة دون أن تتضرر. للتغلب على هذا القيد البيولوجي ، يقوم هذا البروتوكول بتكثيف الجمجمة بشكل مصطنع عبر cyanoacrylate أثناء جراحة الزرع. من المحتمل أن يكون الزرع في الفئران الأصغر من p20 ممكنا باستخدام هذه الإستراتيجية ، لكن جمجمة الفأر تخضع لتغييرات كبيرة في الحجم والشكل حتى p2036 تقريبا. وبالتالي ، لا ينصح بالزرع لفترات طويلة في الفئران الأصغر من p20 لأن cyanoacrylate ومسامير العظام الثابتة في الجمجمة التي لا تزال في طور النمو قد تؤثر بشكل كبير على النمو الطبيعي للجمجمة وتطور أنسجة المخ الأساسية. الأهم من ذلك ، في هذه الدراسة ، لم يلاحظ أي تأثير على القياسات الإجمالية للجمجمة أو حجم الدماغ بعد الزرع المزمن بدءا من p20 (الشكل 5C).

خطوة حاسمة في الطريقة الموصوفة في هذه المخطوطة هي استراتيجية التعافي بعد الجراحة. وفقا لهذه الاستراتيجية ، يجب موازنة وزن الغرسة باستمرار مع نضوج الفأر وخضوعه لتطوير الجهاز العضلي والعضلي الهيكلي. في وقت مبكر بعد الزرع ، لا تستطيع الفئران تحمل وزن الغرسة بنجاح دون موازنة ، مما يؤدي إلى سوء التغذية والجفاف حيث لا يستطيع الفأر الوصول بشكل كاف إلى مصادر الغذاء والماء في قفصه. نظام الموازنة سهل وغير مكلف في البناء ، وتافه في التنفيذ ، ويسمح للفئران من أي عمر قابل للزرع باستكشاف كامل قفصهم المنزلي بحرية ، وبالتالي ضمان التغذية الكافية والترطيب. مع تقدم الفئران في العمر ، يمكن تقليل كمية الموازنة حتى يمكن إزالتها بالكامل في الفئران البالغة. ومع ذلك ، يوصى بالاستخدام المستمر لنظام الموازنة طوال مدة التجربة مع ثقل موازن اسمي على الأقل متصل في جميع الأوقات. في حين أن الفأر البالغ قد يكون قادرا على تحمل حجم ووزن محرك الأقراص الصغير بمرور الوقت ، فإن الحركة الطبيعية المستمرة أثناء السلوك الحر دون تحسين ثقل موازن ينتج عزم الدوران وقوة القص على مسامير العظام التي تثبت محرك الأقراص الصغير على الجمجمة ، مما يجعلها عرضة بشكل متزايد للانفصال ، خاصة أثناء التجارب المزمنة الأطول.

هناك قيدان مهمان ملحوظان للدراسة الحالية. أولا ، لتقييم تأثير الزرع في p20 على نمو الجمجمة والدماغ ، تم التضحية بعدة مجموعات من الفئران بعد الزرع المطول (الشكل 5C). في حين أن هذه التحليلات لم تكشف عن أي تأثير كبير للزرع على حجم تجويف الجمجمة أو كتلة الدماغ (الشكل 5C) ، فإن الدراسة الحالية لم تفحص حجم الجمجمة أو كتلة الدماغ في نقاط زمنية متعددة طوال فترة النمو المبكرة ل p20-p60. بينما يوضح العمل السابق أن تطور تجويف الدماغ قد اكتمل بواسطة p2036 ، فمن الممكن أن يؤدي الزرع في هذه النافذة المبكرة إلى تغييرات غير متوقعة يتم تصحيحها أو تعويضها من خلال أعمار البالغين التي تم تقييمها هنا. ثانيا، لم تكن التجارب التي أنتجت بيانات الفيزيولوجيا الكهربية الموضحة في الشكلين 3 و4 مصممة لزيادة إنتاج الخلية إلى أقصى حد. وبالتالي ، في حين أن البيانات المقدمة هنا تظهر تسجيلات مستقرة ومزمنة ووحدات مفردة معزولة جيدا ، فلا ينبغي اعتبارها ممثلة للعائد المحتمل الأقصى لهذا الجهاز.

تظهر العديد من الاضطرابات العصبية والنفسية البشرية خلال فترات النمو المبكر أو عبر فترة المراهقة ، بما في ذلك التوحد والفصام. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الخلل الوظيفي على مستوى الدائرة الذي قد يكمن وراء هذه الأمراض ، على الرغم من وفرة نماذج الفئران المتاحة. يعد تحديد هذه التغييرات الأولية في الشبكة أمرا بالغ الأهمية لإنشاء استراتيجيات الكشف المبكر ونماذج العلاج. ومع ذلك ، بسبب التحديات التقنية ، لا يزال من غير الواضح كيف تتعطل وظيفة الشبكة عبر التطوير في نماذج الفئران للأمراض العصبية والنفسية. تم تصميم استراتيجية القيادة الصغيرة والتعافي الموصوفة هنا لدعم التحقيقات في تطوير شبكة الدماغ متعددة المناطق في دماغ الفأر ، وبالتالي السماح للباحثين بقياس نمو الدماغ الصحي وكذلك تحديد التغييرات في هذا التطور في نماذج الفئران للمرض.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 NS104829 (B.E.P.) ، R01 MH117149 (L.J.V.) ، و F99NS12053 (L.D.Q.) وجائزة UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. و L.D.Q.). يشكر المؤلفون جيني سكاريا (كلية الصيدلة بمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا) على المساعدة الفنية والدكتور بريندون واتسون (جامعة ميشيغان) على الاقتراحات المنهجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 فولت تتبع الفيديو المصابيحNeuralynxHS-LED-أحمر / أخضر-أومني-10 فولتللاستخدام مع مكبرات الصوت المسبقة التي تحتوي على مآخذ LED لأغراض تتبع الحركة
16TT EIB BoardNeuralynxEIB-36-16TTلوحة واجهة إلكترونية - موصل omnetics
16TT مضخم صوت مسبقNeuralynxHS-36-LEDمكبر للصوت Omnetics 44 مقبس إشارة بين لوحة EIB وكابل الحبل لتسجيل التطبيقات ؛ يتضمن موصلات لمصابيح LED في الرأس لأغراض تتبع الحركة
إرقاء خلاط الأطفالFST13013-14إرقاء منحني ناعم
برغي تثبيت العظامStoelting51457يستخدم لتوصيل لوحة EIB بجسم محرك الأقراص الرئيسي
BurpenorphineZooPharmLot #BERLAB0.5-221207Burpenorphine (0.5 مجم / مل) كمية 5 مل
حبل كابلNeuralynxHS-36 Litz حبلسلكي محمي خفيف الوزن لمراحل الرأس للسهم. خيارات الطول من 1 م / 2 م / 3 م / 5 م
كاربروفين / ريماديلBio-ServeMD150-2عامل مضاد للالتهابات بعد الجراحة
راتنج شفاف v4FormlabsFLGPGR04راتنج سائل يتم بلمرته ضوئيا بواسطة طابعة ثلاثية الأبعاد أثناء عملية الطباعة ثلاثية الأبعاد برغي
مخصص (مكوك)Advanced Machining and Tooling، Inc.مساميرمخصصة تشكيلها ومترابطة
مكون سائل أكريليك الأسنانطقم أسنانLot # 329801السائل - nbsp ؛ مكون من مادة طقم الأسنان (انظر أعلاه)
مسحوق أكريليك الأسنانطقم الأسنان TeetsLot # 583987"العلاج البارد" مادة طقم الأسنان ، ميثيل ميثاكريلات ؛ مختلطة مع مكون سائل للتطبيق لتأمين جهاز التسجيل في مكانه
DietGel BoostClearH2O72-04-5022مكمل غذائي عالي السعرات الحرارية للفئران الصغيرة / المتعافة
Digital Lynx 16SXNeuralynxDigitalLynx 16SX Baseجهاز التسجيل الرئيسي مع 16 فتحة لوحة كومبو لما يصل إلى 512 قناة تسجيل
مقص التشريح - شفرات ثقيلةFST14082-09
ملقط مطلي بالسيراميك Dumont # 5مختلف FST11252-50مناولة / خيوط / تثبيت Tetrode
ملقط Dumont #5SFFST11252-00التجميع متعدد الأغراض يستخدم
ملقط Dumont #5SFFST11252-00الاستخدام الجراحي متعدد الأغراض
Dumont # 7 ملقط ناعم (منحني)FST11274-20
ملقط دقيق Dumont # 7 مختلف (منحني)FST11274-20الاستخدام الجراحي متعدد الأغراض
EIB-36 محول الطلاءمحول الطلاء NeuralynxEIB-36الطلاء / التجميع استخدام
محول الطلاء EIB-36 محولNeuralynxEIB-36ملحق تجسيمي لخفض محرك الأقراص على الجمجمة أثناء الجراحة
EuthasolVirbac710101Pentobarbital الصوديوم للقتل الرحيم
مقص بون ناعم للغايةFST14083-38غرامة إضافية
ملقط graefeFST11150-10ملقط مسنن مستقيم صغير
ملقط غرايف ناعم للغايةFST11150-10ملقط مسنن مستقيم صغير
مرقئ ناعمFST13006-12مرقئ
ناعم مقص ناعم - CeramaCutFST14958-09
مقص قطع رباعي - ToughCutFST14058-09مختلف
نموذج 3 +FormlabsPKG-F3-P-WS-SVC-BASICطابعة ثلاثية الأبعاد لتصنيع جميع الأجزاء / المواد المطبوعة ؛ طابعة ثلاثية الأبعاد مجسمة منخفضة القوة (LFS)
جل الغراء الفائقLoctite1363589خطوات مختلفة
ملقط GraefeFST11049-10ملقط مسنن بزاوية
صغيرة سلك أرضيأنظمة AMLot # 582335سلك مكشوف من الفولاذ المقاوم للصدأ ، قطر .005 بوصة ، صلب ، جل إزالة الشعر 100 قدم
عاممتاح تجاريالإزالة الشعر قبل العملية من أعلى رأس الماوس
مسدس حراريDewaltD26960KTetrode الانصهار بعد الغزل طقم
الكي بدرجة حرارة عاليةFST18010-00للاستخدام مع شمع العظام إن أمكن
معقم حبة ساخنةFST18000-45جهاز التعقيم الكهربائي لتعقيم الأدوات المخصصة أثناء العمليات الجراحية
IsofluraneCovetrus11695067771التخدير السائل القياسي من الأيزوفلوران للاستخدام في مبخر الأيزوفلوران بحد أقصى 5٪
كحول الأيزوبروبيل 91٪عاممتاح تجاريالإجراء التعقيم القياسي قبل الجراحة
برغي المجوهرات (مسامير عظمية للفئران الصغيرة)شركة توريد المكوناتMX-000120-02SFLS / S آلة المسمار # 000-120 × 1/8 '' رأس filister ، محرك مشقوق
LaGrange مقصFST14173-12مختلف
أنابيب بوليميد كبيرةنوردسون الطبيةالقطعة # 13564أنابيب البوليميد - القطر الداخلي 0.0071 "؛ القطر الخارجي 0.0115 "؛ الطول 36 "
السائل سوبر الغراءلوكتايت1365882خطوات
مختلفة مايكرو drillForedomK.1070K.1070 طقم محرك صغير دوار عالي السرعة ؛ مع صندوق تحكم ، كوليت 3/32 بوصة ، تحكم متغير السرعة في القدم ، مهد قبضة ؛ مناسب تجسيميا ؛ 100 & ndash ؛ 115 فولت استخدام
لدغ الحفر الصغير (0.5 مم +)FST19007-05 / 07/09
القحف الزيوتالمعدنية سيجمابي كود 1002076577 ؛ M5904-500mLخطوات مختلفة
الزيوت المعدنيةسيجماPcode 1002076577 ؛ M5904-500mLللاستخدام مع الحفاظ على فتحات حج القحف
مفتوحة مفك براغي مصغر مسطحالرأس FST30051-10إدخال / شد مسامير العظام
نيوسبورين مرهم مضاد حيوي ثلاثيجونسون آند جونسون512373700مرهم المضادات الحيوية
Omnetics 44 مقبس موصل نانوNeuralynxNeuralynx الجزء #A70427-801عنصر غير قياسي- omnetics 44 مقبس (أنثى) صف مزدوج مستقيم الساق موصل نانو مع 2 دبابيس توجيه (ذكر) للاستخدام مع جهاز الموازنة المصنوع حسب الطلب
سلك البلاتين 10٪ إيريديومكاليفورنيا الأسلاك الدقيقةMO # M374710سلك تسجيل دقيق مغزول إلى رباعي لاستخدامه أثناء التسجيل باستخدام محطة تجميع التيرود والدوار 2.0 (انظر أدناه) ؛ معطف HML NATRL VG BOND ؛ بحجم .0007 × 200 قدم
محلول طلاء أسود بلاتينيNeuralynxطلاء أسودمن
أسفل قفصتوماس ساينتفيك / ماريلاند بلاستيك1113M35 ؛ mfr. رقم E0270قاع القفص القياسي ؛ يمكن تزويدها بجهاز شبكة سلكية في الأعلى يحتوي على زجاجة ماء + زجاجة ماء للفئران غير المزروعة
أعلى قفص البولي كربونات مع مرشح صغير N10AncareN / Aأعلى القفص القياسي ليتم تعديله مع الأنابيب البلاستيكية لجهاز الموازنة
Povidone اليود 10٪عاممتاح تجاريالإجراء التعقيم القياسي قبل الجراحة
الأنابيب البلاستيكيةالأنابيب شارلوتN / A1/2 "× 600 رطل لكل بوصة مربعة الجدول الزمني 40 الأنابيب البلاستيكية البيضاء. للاستخدام / التجميع في جهاز الموازنة أثناء استعادة الماوس
شفرات مشرط- # 4FST10060-00شق استخدم
مقبض مشرط- # 4 تشريح إجماليFST10060-13شق استخدم
ملقط برغي ودبوس ذاتي الإمساكFST26100-00حامل للبراغي العظمية والأرضية أثناء إدخاله في الجمجمة
دبابيس EIB الصغيرةNeuralynxدبابيس EIB الصغيرةمرفق أسلاك رباعي بلوحة EIB
بوليميد صغيرةنوردسون الطبيةالكثير # 19102423أنابيب بوليميد - القطر الداخلي 0.004 بوصة ؛ القطر الخارجي 0.0044 بوصة ؛ الطول 36 "
SolidWorksDassault Systemesبرنامج SolidWorks3D CAD لتصميم محرك الأقراص الصغيرة
ملعقة ومسبارFST1090-13قضيب للفازلين / الزيوت المعدنية + استخدام اختياري لاستقامة رباعي
مقص زنبركي - 8 ممFST15024-10مقص لشقوق أنسجة الجمجمة
مقص زنبركي - 8 ممFST15024-10الشقوق الأولية
ملقط نمط قياسيFST11000-12ملقط مسنن كبير
مقص جراحي - حادحاد FST14001-12
مقص جراحي مختلف - ToughCutFST14054-13محطة
تجميع Tetrodeمحطة تجميع TetrodeAssemblyTetrode
Spinner 2.0NeuralynxTetrode الدوار 2.0Tetrode Assembly
العلامة التجارية الايبوكسيغوريلاجزأين 4200102خطوات مختلفة
مادة مكون مادة الطلاء مختلفة بضع محلول البولي كربونات أنابيب مخصص المختلفة Tetrode من

المراجع

  1. Konrad, K., Firk, C., Uhlhaas, P. J. Brain development during adolescence. Deutsches Arzteblatt International. 110 (25), 425-431 (2013).
  2. Silbereis, J. C., Pochareddy, S., Zhu, Y., Li, M., Sestan, N. The cellular and molecular landscapes of the developing human central nervous system. Neuron. 89 (2), 248-268 (2016).
  3. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. 106-107, 1-16 (2013).
  4. Volk, L., Chiu, S. -L., Sharma, K., Huganir, R. L. Glutamate synapses in human cognitive disorders. Annual Review of Neuroscience. 38, 127-149 (2015).
  5. Lord, C., et al. Autism spectrum disorder. Nature Reviews Disease Primers. 6, 5(2020).
  6. McCutcheon, R. A., Reis Marques, T., Howes, O. D. Schizophrenia - An overview. JAMA Psychiatry. 77 (2), 201-210 (2020).
  7. Hopfield, J. J. Neural networks and physical systems with emergent collective computational abilities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2554-2558 (1982).
  8. Heeger, D. J. Theory of cortical function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1773-1782 (2017).
  9. Pouget, A., Dayan, P., Zemel, R. Information processing with population codes. Nature Reviews Neuroscience. 1, 125-132 (2000).
  10. Averbeck, B. B., Latham, P. E., Pouget, A. Neural correlations, population coding and computation. Nature Reviews Neuroscience. 7 (5), 358-366 (2006).
  11. Bey, A. L., Jiang, Y. -H. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Current Protocols in Pharmacology. 66, 1-26 (2014).
  12. Kazdoba, T. M., et al. Translational mouse models of autism: Advancing toward pharmacological therapeutics. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 28, 1-52 (2016).
  13. Mendoza, M. L., Quigley, L. D., Dunham, T., Volk, L. J. KIBRA regulates activity-induced AMPA receptor expression and synaptic plasticity in an age-dependent manner. iScience. 25 (12), 105623(2022).
  14. Bernardet, M., Crusio, W. E. Fmr1 KO mice as a possible model of autistic features. The Scientific World Journal. 6, 1164-1176 (2006).
  15. Weaving, L. S., Ellaway, C. J., Gécz, J., Christodoulou, J. Rett syndrome: Clinical review and genetic update. Journal of Medical Genetics. 42 (1), 1-7 (2005).
  16. Krawczyk, M., et al. Hippocampal hyperexcitability in fetal alcohol spectrum disorder: Pathological sharp waves and excitatory/inhibitory synaptic imbalance. Experimental Neurology. 280, 70-79 (2016).
  17. Jaramillo, T. C., et al. Altered striatal synaptic function and abnormal behaviour in Shank3 exon4-9 deletion mouse model of autism. Autism Research. 9 (3), 350-375 (2016).
  18. Suh, J., Foster, D. J., Davoudi, H., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Impaired hippocampal ripple-associated replay in a mouse model of schizophrenia. Neuron. 80 (2), 484-493 (2013).
  19. Altimus, C., Harrold, J., Jaaro-Peled, H., Sawa, A., Foster, D. J. Disordered ripples are a common feature of genetically distinct mouse models relevant to schizophrenia. Molecular Neuropsychiatry. 1 (1), 52-59 (2015).
  20. Marcotte, E. R., Pearson, D. M., Srivastava, L. K. Animal models of schizophrenia: A critical review. Journal of Psychiatry and Neuroscience. 26 (5), 395-410 (2001).
  21. Makuch, L., et al. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71 (6), 1022-1029 (2011).
  22. Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
  23. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication. Journal of Visualized Experiments. (26), e1094(2009).
  24. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  25. Farooq, U., Dragoi, G. Emergence of preconfigured and plastic time-compressed sequences in early postnatal development. Science. 363 (6423), 168-173 (2019).
  26. Langston, R. F., et al. Development of the spatial representation system in the rat. Science. 328 (5985), 1576-1580 (2010).
  27. Wills, T. J., Cacucci, F., Burgess, N., O'Keefe, J. Development of the hippocampal cognitive map in preweanling rats. Science. 328 (5985), 1573-1576 (2010).
  28. Bjerknes, T. L., Moser, E. I., Moser, M. B. Representation of geometric borders in the developing rat. Neuron. 82 (1), 71-78 (2014).
  29. Bjerknes, T. L., Dagslott, N. C., Moser, E. I., Moser, M. -B. Path integration in place cells of developing rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), E1637-E1646 (2018).
  30. Jansen, N. A., et al. Impaired θ-γ coupling indicates inhibitory dysfunction and seizure risk in a Dravet syndrome mouse model. Journal of Neuroscience. 41 (3), 524-537 (2021).
  31. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: Tetrode assembly. Journal of Visualized Experiments. (26), e1098(2009).
  32. Voigts, J., Siegle, J., Pritchett, D. L., Moore, C. I. The flexDrive: An ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8(2013).
  33. Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026044(2020).
  34. Guardamagna, M., et al. The Hybrid Drive: A chronic implant device combining tetrode arrays with silicon probes for layer-resolved ensemble electrophysiology in freely moving mice. Journal of Neural Engineering. 19 (3), (2022).
  35. Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).
  36. Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, 417(2016).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيزيولوجيا الكهربائية في الجسم الحيغرس المحرك الدقيقنشاط الشبكة الدماغيةالاضطرابات النمائية العصبيةغرس الأقطاب الكهربائيةتذبذب ثيتا في الحصينتسجيل الوحدة المفردةنظام الموازنة
غرسة محرك خفيفة الوزن لتسجيلات Tetrode المزمنة في الفئران اليافعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.