ترتبط مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بأمراض مختلفة ، وغالبا ما يستخدم التألق المناعي لتصورها. ومع ذلك ، هناك العديد من بروتوكولات التلوين ، وفي كثير من الحالات ، يتم فحص نوع واحد فقط من الأنسجة. هنا ، نضع بروتوكولا قابلا للتطبيق بشكل عام لتلطيخ الشبكات في الفئران والأنسجة البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
يتم إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) بواسطة العدلات كاستجابة للعدوى البكتيرية أو تلف الأنسجة الرضحية ولكنها تلعب أيضا دورا في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات المعقمة. إنها هياكل تشبه الويب تتكون من خيوط الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، والهستونات ، والبروتينات المضادة للميكروبات. بمجرد إطلاقها ، يمكن للشبكات أن تحبس وتقتل مسببات الأمراض خارج الخلية في الدم والأنسجة. علاوة على ذلك ، تشارك الشبكات في تنظيم الاستتباب عن طريق تحفيز التصاق الصفائح الدموية وتجلطها. ومع ذلك ، فقد ارتبط الإنتاج غير المنظم للشبكات أيضا بأمراض مختلفة ، بما في ذلك الإنتان أو اضطرابات المناعة الذاتية ، مما يجعلها هدفا واعدا للتدخل العلاجي. بصرف النظر عن المجهر الإلكتروني ، يعد تصور الشبكات باستخدام التصوير المناعي حاليا أحد الطرق الوحيدة المعروفة لإظهار تفاعلات NET في الأنسجة. لذلك ، تم استخدام طرق تلطيخ مختلفة لتصور NETs. في الأدبيات ، تم وصف بروتوكولات تلطيخ مختلفة ، وحددنا أربعة مكونات رئيسية تظهر تباينا كبيرا بين البروتوكولات: (1) أنواع الأجسام المضادة المستخدمة ، (2) استخدام عوامل تقليل التألق الذاتي ، (3) طرق استرجاع المستضد ، و (4) النفاذية. لذلك ، تم تكييف بروتوكولات التلوين المناعي في المختبر وتحسينها بشكل منهجي في هذا العمل لجعلها قابلة للتطبيق على الأنواع المختلفة (الفأر ، الإنسان) والأنسجة (الجلد والأمعاء والرئة والكبد والقلب والقرص الفقري). بعد التثبيت وتضمين البارافين ، تم تركيب أقسام بسمك 3 ميكرومتر على شرائح. تم تلطيخ هذه العينات بالأجسام المضادة الأولية ل myeloperoxidase (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، وإيلاستاز العدلات (NE) وفقا لبروتوكول تلطيخ معدل. تم تلطيخ الشرائح بأجسام مضادة ثانوية وفحصها باستخدام مجهر مضان واسع المجال. تم تحليل النتائج وفقا لورقة تقييم ، وتم تسجيل الاختلافات شبه الكمية.
هنا ، نقدم بروتوكول تلطيخ صافي محسن مناسب للأنسجة المختلفة. استخدمنا جسما مضادا أوليا جديدا لتلطيخ H3cit وقللنا من تلطيخ غير محدد بعامل تقليل التألق الذاتي. علاوة على ذلك ، أثبتنا أن التلوين الصافي يتطلب درجة حرارة عالية ثابتة ومعالجة دقيقة للعينات.
المقدمة
تم تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) لأول مرة بواسطة Brinkmann et al. كمسار للموت الخلوي يختلف عن موت الخلايا المبرمج والنخر في عام 20041. في هذا المسار ، تطلق العدلات الكروماتين غير المكثف في الفضاء خارج الخلية لتشكيل هياكل كبيرة تشبه الويب مغطاة بالبروتينات المضادة للميكروبات التي كانت مخزنة سابقا في الحبيبات أو العصارة الخلوية. تشمل هذه البروتينات المضادة للميكروبات إيلاستاز العدلات (NE) ، والميلوبيروكسيديز (MPO) ، وهيستون سيترولين H3 (H3cit) ، والتي تستخدم عادة للكشف المناعي غير المباشر عن NETs2. هذه الطريقة لا تحدد فقط الوجود الكمي لهذه البروتينات. في الواقع ، لديها ميزة الكشف على وجه التحديد عن الهياكل الشبيهة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
شملت هذه الدراسة أنسجة الفئران المشتقة من التجارب المعتمدة من قبل إدارة ولاية هامبورغ للبحوث الحيوانية ، Behörde für Justiz und Verbraucherschutz ، هامبورغ ، ألمانيا (73/17 ، 100/17 ، 94/16 ، 109/2018 ، 63/16). كانت الأنسجة المستخدمة هي رئة الفأر والقولون من نموذج الصرف الصحي والجلد المحترق. استخدمنا الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اتباع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية لجميع التجارب. تضمنت العينات البشرية مجهولة المصدر أنسجة من التهاب الأمعاء والقولون الوليدي ، والجلد المحروق ، ورتق القناة الصفراوية ، والتهاب الفقار ، وعضلة القلب. وفقا للجنة أخلاقيات البحوث الطبية في هامبورغ ، لم تكن العينات بحاجة إلى م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قبل البدء في تحسين البروتوكول الخاص بنا ، حددنا الخطوات الرئيسية للتلوين الناجح من خلال البحث في PubMed عن الدراسات التي استخدمت أنسجة FFPE للتلطيخ المناعي للشبكات وقارنا بروتوكولاتها. تم تحديد الاختلافات الواعدة في البروتوكول كخطوات رئيسية لتحسين البروتوكول ، في حين لم يتم تغيير الخطوات التي تتوافق في الغالب مع بعضها البعض (الجدول 1).
الجدول 1: بحث PubMed للتلطيخ المناعي FFPE للشبكات. يوضح هذا الجدول المتغيرات في بروتوكول التلوين المناعي في الدراسات التي تم ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل ، كنا نهدف إلى تكييف وتحسين البروتوكولات الحالية لتصوير الشبكات لمزيد من أنواع الأنسجة ، بدءا من عملية التلوين الفعلية. الخطوة الأولى الحاسمة لهذه الطريقة هي اختيار الأجسام المضادة الأكثر ملاءمة. بالنسبة إلى NE ، جربنا جسما مضادا NE من مضيف فأر على الأنسجة البشرية ، والذي لم يظهر أي تلطيخ موثوق به مقارنة ب NE من مضيف أرنب. علاوة على ذلك ، اقترح Thålin et al. H3cit (R8) كجسم مضاد أكثر تحديدا للتلطيخ خارج الخلية. قارنا هذا الجسم المضاد مع triH3cit المستخدم على نطاق واسع (R2 ، R8 ، R17). أظهرت دراستنا أن الجسم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تأسست هذه الأبحاث من قبل جمعية الأبحاث الألمانية (BO5534). نشكر أنطونيا كيويت وموريتز لينز ويوهانا هاجنز والدكتورة أنيكا هوير والأستاذة العامة الدكتورة إنغو كونيغس على تزويدنا بالعينات. بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون فريق مرفق التصوير المجهري UKE (المرفق الأساسي ، كلية الطب UKE) على الدعم في الفحص المجهري المناعي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > تخفيف< قوي> | |||
| الأجسام المضادة للعدلات Elastase 100 & micro ؛ ز | أبكام | أب 68672 | 1:100 |
| الأجسام المضادة المضادة للهيستون H3 (السيترولين R2 + R8 + R17) 100 & micro; ز | أبكام | أب 5103 | 1:50 |
| الأجسام المضادة المضادة للميلوبيروكسيداز [2C7] مضاد للإنسان 100 وميكرو ؛ ز | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| الأجسام المضادة للمايلوبيروكسيداز [2D4] مضاد للفأر 50 & مايكرو; ز | abcam | ab 90810 | 1:50 |
| برنامج Axiovision المجهري | زايس | 4.8.2. | |
| محلول حجب مع مصل الحمار (جاهز للاستخدام) 50 مل | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1: 25000 |
| DCS تخفيف الأجسام المضادة 500 مل | DCS تشخيص | DCS AL120R500 | |
| حمار نملة الماعز Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| حمار مضاد للأرانب AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| حمار مضاد للأرانب Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G تصاعد متوسط | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| رف منزلق زجاجي | Roth | H552.1 | |
| الإنسان / الفأر MPO الأجسام المضادة | R & D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| قلم مسعور | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1: 2000 و 1: 250 |
| Reduction Recode Kit (RUO) 100 مل | Maxvision | MB-L | |
| كاميرا الفحص المجهري | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| ميكروويف | بوش | HMT84M421 | |
| ماوس IgG1 التحكم السلبي | Dako | X0931 Aglient | 1:50 و 1: 5 |
| Normal Goat IgG Control | R & D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS فوسفات محلول ملحي مخزن (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP جرة تلطيخ | Roth | 2292.2 | |
| المؤتلف المضاد للهيستون H3 (citrulline R8) الجسم المضاد 100 & micro ؛ g | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| أرنب مؤتلف IgG ، أحادي النسيلة [EPR25A] - التحكم في النمط المتشاوي 200 & g | abcam | ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris محلول ملحي مخزن (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| حمام مائي | Memmert | 830476 | |
| طباخ | أرز حمام مائيreishunger | RCP-30 | |
| غرفة رطبة | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss مجهر وايدفيلد | Zeiss | Axiovert 200M |
المراجع
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
