Method Article

القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا

DOI:

10.3791/65304

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه التقنية سير عمل فعال لتصور وقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق داخل خلايا هيلا باستخدام التصوير الحي القائم على التألق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا عضيات ديناميكية ضرورية للاتزان الداخلي الأيضي من خلال التحكم في إنتاج الطاقة عن طريق تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). لدعم التمثيل الغذائي الخلوي ، تتعاون آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا المختلفة للحفاظ على شبكة ميتوكوندريا صحية. أحد هذه المسارات هو الميتوفاجي ، حيث يسهل كيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) و Parkin phospho-ubiquitination للميتوكوندريا التالفة عزل البلعمة الذاتية والإزالة اللاحقة من الخلية عن طريق اندماج الليزوزوم. الميتوفاجي مهم للاتزان الخلوي ، وترتبط الطفرات في باركين بمرض باركنسون (PD). بسبب هذه النتائج ، كان هناك تركيز كبير على التحقيق في تلف الميتوكوندريا ودورانها لفهم الآليات الجزيئية وديناميكيات مراقبة جودة الميتوكوندريا. هنا ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لتصور شبكة الميتوكوندريا لخلايا HeLa ، لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بعد العلاج باستخدام سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ، وهو عامل فك ارتباط الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن طفرة مرتبطة بمرض باركين (ParkinT240R) والتي تثبط الميتوفاجي المعتمد على باركين لتحديد كيفية تأثير التعبير الطافر على شبكة الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التي تعبر عن باركين من النوع البري. يصف البروتوكول الموضح هنا سير عمل بسيط باستخدام مناهج قائمة على التألق لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شبكة الميتوكوندريا عبارة عن سلسلة من العضيات المترابطة التي تلعب دورا حاسما في إنتاج الطاقة1 ، والمناعة الفطرية2,3 ، وإشارات الخلية 4,5. ارتبط عدم تنظيم الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)6,7. PD هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يؤثر على الخلايا العصبية الدوبامينية للمادة السوداء التي تؤثر على ما يقرب من 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم8. تم ربط PD وراثيا ب mitophagy ، وهو مسار لمراقبة جودة الميتوكوندريا ضروري للحفا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير العينات البيولوجية

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. رش سطح الخزانة وجميع المواد بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.

  1. زراعة خلايا هيلا ونقلها
    1. استزرع 30000 خلية هيلا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco تحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ومحلول L-glutamine بنسبة 1٪ (HeLa media ؛ انظر جدول المواد). ضع الخلايا على أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم (انظر Table of Materials) تحتوي على 2 مل من وسائط HeLa المسخنة مسبقا. الحفاظ على مزارع هيلا عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية26,27

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، تم استخدام القياس الكمي القائم على التألق لقياس إمكانات الغشاء ومستويات الأكسيد الفائق لشبكة الميتوكوندريا بعد معالجة CCCP (الشكل 1). استخدم سير العمل هذا خلايا هيلا ، وهي خط خلوي خالد مشتق من سرطان عنق الرحم. تستخدم خلايا هيلا بشكل روتيني لدراسة بيولوجيا الميتوكوندريا وهي مسطحة نسبيا ، مما يجعل من السهل تصور شبكة الميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري. للتحقيق في دور Parkin في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا ، تم نقل خلايا HeLa بشكل عابر باستخدام ناقل تحكم فارغ ، Parkin<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام سير العمل الموضح هنا لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بقوة وقابلية التكرار باستخدام التصوير القائم على التألق30. هناك قيود فنية مهمة يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجارب. تم نقل خلايا هيلا باستخدام ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT240R. تم استخدام ناقل YFP الفارغ كعنصر تحكم لتأكيد أن النتائج التجريبية كانت خاصة بباركين. بالنسبة للنقل العابر ، تم تحديد نسبة كتلة 1: 3 للحمض النووي إلى كاشف النقل تجريبيا لتحقيق أعلى معدل نقل ، حيث .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة يعلنونها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر إيفانز على ملاحظاتهم المدروسة حول هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل علماء ديوك وايتهيد ، وعلماء ديوك للعلوم والتكنولوجيا ، وزمالة هانا جراي في معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). تم عمل الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<مواد كيميائية قوية > وببتيدات وبروتينات مؤتلفة < / قوية >
CCCP (كربونيل سيانيد م هيدرازون كلوروفينيل)   ؛سيجما ألدريتشC2759
DMEM (1x) مع 4.5 جم / لتر جلوكوزجيبكو11-965-084
DMSO ، اللامائيThermoFisher ScientificD12345
مصل الأبقار الجنينيHycloneSH3007103
FuGENE 6 (كاشف النقل)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (محلول L-Glutamine)   ؛Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX   أحمر ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (وسائط مصل Redued) ThermoFisherScientific31985070
Tetramethylrhodamine ، إيثيل استر ، بيركلورات (TMRE)   ؛ThermoFisher ScientificT669<
strong> النماذج التجريبية: الكائنات الحية / السلالات < / قوية >
HeLa-M ( الإنسان العاقل < / م >)A. Peden (معهد كامبريدج للبحوث الطبية)N / A
<قوي > مؤتلف الحمض النووي < / قوي>
EYFP ناقلات فارغةN / A N / AN / A
YFP-Parkin T240Rتم إنشاء هذه الورقةعن طريق الطفرات الموجهة للموقع من YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene ؛ PMID: 19029340RRID: Addgene_23955
<قوي>البرامج والخوارزميات
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (برامج جداول البيانات)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (إحصائي برنامج التحليل)برنامج GraphPadhttps://www.graphpad.com
<قوي > آخر < / قوي >
35 مم طبق ، غطاء رقم 1.5 ، قطر زجاج 20 مم ، حاضنةقفص غير مطلية MatTekP35G-1.5-20-C
(غرفة بيئية) مجهرمقلوب Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiLLeicaN / A
LIGHTNING DECONVOLUTION SOFTWARELeicaN / A
STELLARIS 8 مجهر متحد البؤرLeicaN / A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive Cell ImagingHeLa CellsFluorescence QuantificationMitochondrial NetworkTMRE StainingMitoSOX FluorescenceParkin MutationMitochondrial Quality Control

Related Articles