يتم تقديم طريقة لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية oligodendrocyte من أدمغة الفئران الحية هنا بالتفصيل التجريبي. يسمح بمجموعات متعددة من هذه الخلايا من نفس دون المساس برفاههم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة "حلب الدماغ" لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن من الفئران الحية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تظل الخلايا الجذعية العصبية الخاصة بالأنسجة (NSCs) نشطة في دماغ الثدييات بعد الولادة. يقيمون في منافذ متخصصة ، حيث يولدون خلايا عصبية جديدة وخلايا دبقية. أحد هذه الأماكن هو المنطقة تحت البطينية (SEZ ؛ وتسمى أيضا المنطقة البطينية تحت البطينية) ، والتي تقع عبر الجدران الجانبية للبطينين الجانبيين ، بجوار طبقة الخلايا العصبية. يتم توزيع الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) بكثرة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، وتشكل مجموعة من الخلايا السلفية التكاثرية التي يمكن أن تولد خلايا قليلة التغصن.
تظهر كل من NSCs و OPCs إمكانية التجديد الذاتي ودورات الهدوء / التنشيط. بسبب موقعها ، يتم إجراء العزل والتحقيق التجريبي لهذه الخلايا بعد الوفاة. هنا ، نصف بالتفصيل "حلب الدماغ" ، وهي طريقة لعزل NSCs و OPCs ، من بين خلايا أخرى ، عن الحية. هذا بروتوكول من خطوتين مصمم للاستخدام في القوارض واختباره في الفئران. أولا ، يتم "إطلاق" الخلايا من الأنسجة عن طريق الحقن داخل المخ البطيني التجسيمي (i.c.v.) من "كوكتيل التحرير". المكونات الرئيسية هي النورامينيداز ، الذي يستهدف خلايا البطانة العصبية ويحفز تعرية جدار البطين ، وهو جسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية -2. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي من الصهريج الكبير ، في الفئران المخدرة دون الحاجة إلى شق.
تظهر النتائج المعروضة هنا أن الخلايا المعزولة تحتفظ بصورتها الذاتية وأن NSCs في المنطقة الاقتصادية الخاصة تحافظ على هدوءها. يقتصر تعرية طبقة البطانة العصبية على المستوى التشريحي للحقن ويتم تحمل البروتوكول (الإطلاق والتجميع) جيدا من قبل. يمهد هذا النهج الجديد الطريق لإجراء دراسات طولية لتكوين الخلايا العصبية الداخلية والتكون الدبقي في التجارب.
المقدمة
الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة هي خلايا ملتزمة جزئيا يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة المعنية. بصرف النظر عن كونها متعددة القدرات ، فهي خلايا ذاتية التجديد وضرورية للحفاظ على التوازن والقدرة التجديدية للأنسجة1. تظل بعض الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة في حالة نشطة وتكاثرية قوية ، مثل الخلايا الجذعية المعوية أو المكونة للدم. البعض الآخر ، مثل الخلايا الجذعية في الدماغ ، لا يزال هادئا أو نائما إلى حد كبير2. في الدماغ البالغ ، يمكن العثور على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في مناطق متخصصة ، وغالبا ما تسمى المنافذ. توجد منطقتان موصوفتان جيدا في المنطقة تحت البطينية (SEZ) للبطينين الجانبيين وفي الت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء إجراءات تربية وصيانتها وتجربتها وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، الذي أذنت به وزارة الداخلية ، والمرسوم الرئاسي 56/2013 للجمهورية اليونانية ، والذي تم فحصه من قبل هيئات رعاية والمراجعة الأخلاقية لجامعتي كامبريدج وباتراس ، وكذلك تمت الموافقة عليه وفحصه من قبل لجنة رعاية واستخدام المحلية في المحافظات (رقم البروتوكول: 5675/39/18-01-2021). تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley و Wistar و Long-Evans ، التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أشهر وبأوزان جسم تتراوح بين 150 جم و 250 جم. يتم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.
1. الافراج عن إعداد كوكتيل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الإفراج عن وجمع NSCs
يتم فصل NSCs من SEZ عن CSF فقط عن طريق الطبقة الأحادية من الخلايا العصبية ، وإن كانت لا تزال على اتصال مباشر مع محتوى البطين عن طريق إقحام العمليات أحادية الهدب 8,9. يعمل Neuraminidase بشكل خاص على خلايا البطانة العصبية عن طريق انشقاق بقايا حمض السياليك ويمكن أن يؤدي إلى تعرية جدار البطين. هذا يؤدي إلى تجمع الخلايا العصبية على سطح البطين10,11. علا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخلايا الجذعية والسلفية متناثرة نسبيا في أنسجة المخ في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، توجد NSCs في مناطق يتعذر الوصول إليها لإجراء خزعات سهلة وآمنة (جدران البطين ، الحصين). لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة للعمل تجريبيا مع هذه الخلايا ، حتى الآن ، هي عزلها بعد الوفاة. يتم وصف طريقة تسمح بالجمع الفردي أو المتكرر ل NSCs و OPCs من الفئران الحية ، والتي تسمى الحلب ، هنا خطوة بخطوة. تعتمد الطريقة على ميزتين رئيسيتين: i) يتم فصل NSCs أو OPCs بواسطة طبقة أحادية الخلية العصبية من السائل الدماغي النخاعي ، وتتدفق داخل نظام البطين في الدم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للإعلان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة Action Medical Research (المملكة المتحدة) (GN2291) إلى R.J.M.F. و I.K. كما تم دعم العمل البحثي جزئيا (تكاليف ودعم D.D) من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (H.F.R.I.) في إطار "الدعوة الأولى لمشاريع أبحاث H.F.R.I. لدعم أعضاء هيئة التدريس والباحثين وشراء منحة معدات البحث عالية التكلفة" (رقم المشروع: 3395).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > إطلاق كوكتيل < / قوي > | |||
| & بيتا ؛ 1-الأجسام المضادة التي تحجب الإنتجرين | BD Biosciences | # 555002 | منقى NA / LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2 / 5 ، 1 مجم / مل. يجب أن يكون أي جسم مع نشاط حجب مناسبا. |
| Neuraminidase من Clostridium perfringens< / em> (Clostridium welchii< / em>) | Sigma-Aldrich | #N2876 | اختبار Neuraminidases من مصادر أخرى (على سبيل المثال ، من ضمة الكوليرا). |
| FGF البشري المؤتلف الأساسي (154 أ) | Peprotech | # 100-18B | تم الاحتفاظ بها ك 1 & mu ؛ ز /&مو; مخزون L ، مخفف في ماء معقم عند -20 درجة ؛ C |
| العمليات الجراحية< / قوي> | |||
| 10 & مايكرو; L حقنة | هاميلتون | # 80330 | موديل 701 RN ، إبرة صغيرة قابلة للإزالة ، مقياس 26 ثانية ، 2 بوصة ، نمط نقطة 2 |
| BD دقيق دقيق 1 مل محاقن الأنسولين | BD Biosciences | 04085-00 | 29 جم × 12.7 مم |
| قطع البيتادين. SOL 10٪ FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | كود المنتج: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 مل (بوبرينوفين 0.3 مجم / مل) |
| رقمي جديد قياسي تجسيمي ، فئران وفأر | Stoelting | 51500D | |
| نظام مراقبة الحرارة المنزلية | هارفارد جهاز هارفارد | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 مجم / غرام بخار استنشاق ، سائل | Vetpharma صحة | 32509/4031 | |
| كيتاميدور | ريختر فارما | رمز المنتج: | كيتامين 100 مجم / مل |
| خياطة نايلون ، إثيلون | إيثيكون | D9635 | شفاف ، مقاس 5-0 |
| تشذيب جراحية لاسلكية قابلة لإعادة الشحن | التثبيت | البند:51472 | |
| شفرات مشرط ، معقمة | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8 بوصة مسحات | مختبرات بيرشوود | 34-7021-12P | |
| مثقاب تجسيمي عالي السرعة | Foredom | 1474w / o1464 | |
| Stoelting ' s مجموعة أدوات التجسيمية | Stoelting | العنصر: 52189 | |
| Xylan 2٪ | Chanelle Pharmaceuticals | 13764 / 03 / 19-5-2004 | Xylazine ، 25 مل |
| < قوي > مناولة الأنسجة والخلايا والتلطيخ المناعي < / لوحات قوية > | |||
| 96 جيدا مناسبة للفحص المجهري | Greiner | # 655866 | Star Microplate |
| B27 | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V ، صدمة حرارية |
| سترات | ميرك | 71497 | سترات الصوديوم أحادية القاعدة |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck ، Calbiochem | 28718-90-3 | تلطيخ نووي ، تخفيف: 1 / 1,000 |
| DMEM | ThermoFisher 11995065 العلمي | ارتفاع نسبة الجلوكوز ، الحمار البيروفات | |
| المضاد للماعز | Biotium | 20016 أو 20106 أو 20048 | التخفيف: 1/1,000 |
| حمار مضاد للفأر | Biotium | 20014 أو 20105 أو 20046 | التخفيف: 1/1,000 |
| حمار مضاد للأرانب | Biotium | 20015 أو 20098 أو 20047 | التخفيف: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (أو bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| الماعز المضاد ل GFAP | Abcam | ab53554 | التخفيف: 1/500 |
| الماعز المضاد ل SOX2 | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-17320 | التخفيف: 1/200 |
| فأر مضاد ل ID3 | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-56712 | التخفيف: 1/200 |
| فأر مضاد ل S100 & beta ؛ | Sigma | S2532 | : 1/200 |
| Mowiol | Merck ، Calbiochem | 475904 | تركيب متوسط |
| N2 مكمل | غذائي ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck ، محلول Millipore | A-003-E | ، 1.0 مجم / مل |
| أرنب مضاد للكورتين المزدوج (DCX) | Abcam | ab18723 | التخفيف: 1/500 |
| أرنب مضاد ل PDGFR & alpha ؛ | Abcam | ab51875 | التخفيف: 1/200 |
| أرنب مضاد بيتا ؛ - catenin | Abcam | ab16051 | التخفيف: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100< | |
| strong> المجهر وتحليل الصور < / قوي > | |||
| مجهر متحد البؤر | Leica | SP6 و SP8 | |
| الصور | NIH ، الولايات المتحدة الأمريكية | ImageJ | |
| تحليل الصور | Leica | LasX |
المراجع
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
