طريقة "حلب الدماغ" لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن من الفئران الحية

الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة هي خلايا ملتزمة جزئيا يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة المعنية. بصرف النظر عن كونها متعددة القدرات ، فهي خلايا ذاتية التجديد وضرورية للحفاظ على التوازن والقدرة التجديدية للأنسجة¹. تظل بعض الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة في حالة نشطة وتكاثرية قوية ، مثل الخلايا الجذعية المعوية أو المكونة للدم. البعض الآخر ، مثل الخلايا الجذعية في الدماغ ، لا يزال هادئا أو نائما إلى حد كبير². في الدماغ البالغ ، يمكن العثور على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في مناطق متخصصة ، وغالبا ما تسمى المنافذ. توجد منطقتان موصوفتان جيدا في المنطقة تحت البطينية (SEZ) للبطينين الجانبيين وفي التلفيف المسنن للقرن الحمون. يولد مكانة المنطقة الاقتصادية الخاصة أكبر عدد من الخلايا ، في المقام الأول الخلايا العصبية التي تهاجر نحو المصابيح الشمية وتساهم في السكان المحليين بين الخلايا العصبية. في المقابل ، تهاجر الأرومات قليلة التغصن المتولدة إلى الجسم الثفني المجاور (CC)³. الخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) هي خلايا نشطة انقساميا ، موزعة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي ، والتي: أ) ملتزمة بسلالة oligodendroglial ، ب) يمكن أن تهاجر إلى مواقع إزالة الميالين ، و iii) يمكن أن تتمايز إلى oligodendrocytes الميالينية. تظهر OPCs أيضا إمكانات التجديد الذاتي والسكون⁴.

حتى الآن ، تطلب عزل ودراسة NSCs و OPCs تفكك ما بعد الوفاة للدماغ المشريح وأنسجة الحبل الشوكي. للتحايل على هذا القيد التجريبي ، أنشأنا طريقة تسمح ، لأول مرة ، بعزل NSCs و OPCs في الدماغ عن الحية. نسمي هذه الطريقة "الحلب" ، لأنها تمكن من مجموعات متعددة من الخلايا حيث لا يتم استنفاد بركها. تم تطوير البروتوكول في الفئران ، نظرا لحجم دماغها الكبير ، ويستهدف بشكل أساسي المنطقة الاقتصادية الخاصة ، أو CC ، ويتضمن خطوتين رئيسيتين. أولا ، يتم "إزالة" NSCs أو OPCs من الأنسجة عن طريق حقن i.c.v. من "كوكتيل إطلاق" يحتوي على النيورامينيداز ، وهو سم يحفز تعرية جدار البطين ، وجسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2). يتم حقن الكوكتيل بشكل نمطي ثنائي داخل البطينين الجانبيين. إذا كان الاستخدام المقصود هو عزل NSCs ، يتم استهداف المناطق المنضدية للبطينين الجانبيين. إذا كان الهدف هو عزل OPCs بشكل أكثر نقاء ، يتم حقن الكوكتيل ذيليا في منطقة الحصين فيمبريا. في خطوة "التجميع" الثانية ، يتم إجراء الخزعات السائلة من السائل النخاعي (CSF) من الصهريج العظيم للفئران المخدرة ، دون الحاجة إلى شق. يتم خلط الخزعة السائلة مع وسط زراعة NSC ويمكن الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية حتى الطلاء.

تم إجراء إجراءات تربية وصيانتها وتجربتها وفقا لقانون في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 ، الذي أذنت به وزارة الداخلية ، والمرسوم الرئاسي 56/2013 للجمهورية اليونانية ، والذي تم فحصه من قبل هيئات رعاية والمراجعة الأخلاقية لجامعتي كامبريدج وباتراس ، وكذلك تمت الموافقة عليه وفحصه من قبل لجنة رعاية واستخدام المحلية في المحافظات (رقم البروتوكول: 5675/39/18-01-2021). تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague-Dawley و Wistar و Long-Evans ، التي تتراوح أعمارها بين 2 و 4 أشهر وبأوزان جسم تتراوح بين 150 جم و 250 جم. يتم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.

1. الافراج عن إعداد كوكتيل

ملاحظة: استعد طازجا في يوم الإجراء واحفظه على الثلج. يتم إعطاء الكميات لكل 2 ميكرولتر ليتم حقنها في كل بطين جانبي. تحضير 1 ميكرولتر إضافية لكل حقنة مقصودة.

1. تحضير 0.5 ميكرولتر من 500 mU neuraminidase من كلوستريديوم بيرفرينجنز (كلوستريديوم ويلتشي).
   ملاحظة: قم بتخزين هذا كمخزون 1 وحدة / ميكرولتر مخفف في ماء معقم عند -20 درجة مئوية. لم يتم اختبار أنواع أخرى من النيورامينيداز.
2. تحضير 1 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة المانعة للإنتغرين-β1.
   ملاحظة: قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. تحضير 0.5 ميكرولتر تحتوي على 0.5 ميكروغرام من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (FGF البشري المؤتلف الأساسي).
   ملاحظة: قم بتخزينه كمرق 1 ميكروغرام / ميكرولتر مخفف في ماء معقم عند -20 درجة مئوية.

2. حقن كوكتيل الإفراج

ملاحظة: يمكن تنفيذ العملية برمتها في غضون 20 دقيقة. احرص على إجراء الجراحة في حالات العقم. نظف جميع الأسطح بمطهر (على سبيل المثال ، 3٪ أو 6٪ بيروكسيد الهيدروجين). استخدم أدوات وقفازات وأردية وستائر معقمة أو معقمة بسهولة.

1. تخدير التجارب عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2.5٪ للتحريض و 2٪ للصيانة). تأكد من عمق التخدير عن طريق فحص منعكس القرنية ، ورد الفعل على المنبهات (اختبار قرصة الأطراف الخلفية والذيل) ، وطريقة التنفس.
   ملاحظة: يمكن إجراء العمليات الجراحية تحت التخدير العام الناجم عن التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق (على سبيل المثال ، الكيتامين [40 مجم / كجم] والزيلازين [10 مجم / كجم]). تم تأكيد التخدير العميق عن طريق فحص منعكس القرنية ، ورد الفعل على المنبهات (اختبار قرصة الطرف الخلفي والذيل) ، وطريقة التنفس.
2. يجب تطبيق التسكين تحت الجلد (مثال: 0.3 ملغ/مل من البوبرينورفين) عند تحريض التخدير.
3. جبل الفئران على الإطار المجسم.
4. حلق فرو الرأس بشفرة حلاقة ونظف البشرة بمطهر ، مثل محلول بوفيدون اليود بنسبة 10٪ ثم الكحول. ضع المطهر ثلاث مرات باستخدام مسحات قطنية معقمة. فرك في حركة دائرية لمدة 3-5 ثوان في كل مرة. ضع مرهم العين لمنع الجفاف.
5. قم بعمل شق 2 سم في جلد الرأس على طول الخط الأوسط باستخدام مشرط معقم.
6. قم بتنظيف الجمجمة بدقة باستخدام مسحات معقمة ومحلول ملحي معقم.
7. حدد البريغما باستخدام حافة إبرة حقنة هاملتون سعة 10 ميكرولتر مثبتة على جهاز التجسيم. اضبط bregma على أنه "النقطة 0,0".
   ملاحظة: يتم تحديد bregma كنقطة تقاطع بين الغرز السهمية والإكليلية. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في أطلس دماغ الفئران في Paxinos و Watson⁵.
8. انقل الجهاز إلى الإحداثيات الأمامية الخلفية (AP) = 0.3 مم ، الجانبي (L) = +1.2 مم (لاستهداف المنطقة الاقتصادية الخاصة) ، أو AP = 1.5 مم ، L = +2.0 مم (لاستهداف CC).
9. حفر حفرة لدغ 1 مم باستخدام مثقاب الأسنان.
   ملاحظة: عند الحفر باليد ، احرص على عدم إصابة السطح القشري. من غير المتوقع أن يكون النزيف كبيرا. قم بإزالة أي دم بالمحلول الملحي واضغط لوقف النزيف المستمر.
10. تحميل 4 ميكرولتر من كوكتيل الإفراج في حقنة هاميلتون 10 ميكرولتر.
11. اخفض الإبرة (يفضل أن تكون حادة أو مخروطية الطرف) لحقنة هاملتون من أجل ملامسة الجافية.
12. أدخل الإبرة بالعمق المطلوب (D = 3.5 مم).
    ملاحظة: صب المياه المالحة على سطح الجافية للحفاظ على رطوبة الأنسجة.
13. نقع 2 ميكرولتر من كوكتيل الإطلاق بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة.
14. اترك الإبرة في مكانها لمدة 2 دقيقة أخرى قبل الاسترجاع البطيء لتجنب ظهور كوكتيل الإطلاق.
15. كرر الخطوات 2.8-2.14 لنصف الكرة الآخر عند الإحداثيات AP = 0.3 مم ، L = -1.2 مم (لاستهداف المنطقة الاقتصادية الخاصة) ، أو AP = 1.5 مم ، L = -2.0 مم (لاستهداف CC).
16. خياطة شق مع 5-0 نايلون (قطر 0.1 مم) وتنظيف المنطقة خياطة مع مطهر.
17. قم بإزالة القناع الذي يزود المخدر ونقل إلى منطقة مراقبة ما بعد العملية.
    ملاحظة: يجب أن يحدث التعافي من التخدير والحفاظ على الاستلقاء في غضون 5-10 دقائق ، والشفاء التام (السلوك الطبيعي) في غضون 25 دقيقة.
    1. راقب عن كثب الانتعاش (حركة حية وغير منقطعة ، وصول متكرر إلى الماء) في مكان ساخن جيدا (24-25 درجة مئوية) ، مكان هادئ بدون فراش صغير الجسيمات ، والذي يمكن أن يسد الشعب الهوائية. أعد إلى شركة زملائه في القفص (وليس للحيوانات الجديدة) فقط بعد التأكد من الشفاء التام.
    2. مراقبة في مرفق الصيانة لمدة 48 ساعة على الأقل بعد الجراحة. معالجة علامات الألم (إخفاء الرأس ، وضع الرأس أو الجسم غير الطبيعي ، فرط الحساسية ، وفرط الاستثارة في التعامل) عن طريق إعطاء تسكين الألم (على سبيل المثال ، 0.3 ملغ / مل من البوبرينورفين ، تحت الجلد). إحالة ذات الفراء المشوه أو المنسوب إلى الطبيب البيطري المسؤول.

3. خزعة السائل النخاعي (CSF)

ملاحظة: يمكن إجراء العملية برمتها في غضون 10 دقائق. يتم إجراء الخزعة السائلة الموصوفة هنا بعد 3 أيام من حقن كوكتيل الإطلاق ولكن يمكن إجراؤها بنفس الطريقة تماما عند الحاجة. احرص على إجراء الجراحة في حالات العقم. نظف جميع الأسطح بمطهر (على سبيل المثال ، 3٪ أو 6٪ بيروكسيد الهيدروجين). استخدم أدوات وقفازات وأردية وستائر معقمة أو معقمة بسهولة.

1. تخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2.5 ٪ للتحريض و 2 ٪ للصيانة). تأكيد عمق التخدير عن طريق فحص القرنية
   رد الفعل ، رد الفعل على المنبهات (اختبار الأطراف الخلفية وقرصة الذيل) ، وطريقة التنفس.
   ملاحظة: يمكن إجراء العمليات الجراحية تحت التخدير العام الناجم عن التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق (على سبيل المثال ، الكيتامين [40 مجم / كجم] والزيلازين [10 مجم / كجم]). ومع ذلك ، لا ينصح بذلك لأن الإجراء قصير ، خاصة إذا تم إجراء الخزعات عدة مرات في أيام متتالية.
2. يجب تطبيق التسكين تحت الجلد (مثال: 0.3 ملغ/مل من البوبرينورفين) عند تحريض التخدير.
3. جبل التجريبي على الإطار المجسم. استخدم قضبان الأذن لتثبيت الرأس دون إعاقة الحركة الدورانية نحو الأمام والخلف.
4. ثبت الرأس بزاوية 40 درجة لأسفل بحيث يمكن تحقيق امتداد جيد للجزء الخلفي من الرقبة.
   ملاحظة: تتمثل إحدى طرق القيام بذلك في استخدام شريط الفم الخاص بالجهاز⁶.
5. حلق الفراء في منطقة الرقبة باستخدام ماكينة حلاقة ونظف البشرة بمطهر ، مثل محلول البوفيدون واليود بنسبة 10٪ ثم الكحول. ضع المطهر ثلاث مرات باستخدام مسحات قطنية معقمة. فرك في حركة دائرية لمدة 3-5 ثوان في كل مرة.
6. باستخدام طرف الإصبع ، ابحث عن المنطقة الاكتئابية على شكل معين الموضوعة بين النتوء القذالي والعمود الفقري للأطلس⁶.
7. ارسم علامة نقطة (على سبيل المثال ، باستخدام علامة).
8. إصلاح حقنة 1 مل أو 0.5 مل على الإطار المجسم.
   ملاحظة: ينصح باستخدام المحاقن ذات الإبر غير القابلة للفصل لأنها تنتج شفطا أفضل ولها حجم ميت أقل.
9. أحضر الإبرة عند نقطة ملامسة الجلد عند علامة النقطة.
10. باستخدام زوج من الملقط ، ارفع الجلد أثناء خفض المحقنة عبر طبقات الجلد.
11. استرجع المكبس قليلا لتوليد ضغط سلبي في المحقنة.
12. أعد التشغيل لغمس الإبرة ببطء شديد حتى يظهر السائل (CSF) في المحقنة.
13. قم بتثبيت الإبرة في هذا الموضع واترك التدفق البطيء ل CSF.
    ملاحظة: يمكن خفض الإبرة أو رفعها قليلا إذا كان تدفق السائل الدماغي النخاعي بطيئا جدا.
14. ابدأ في إزالة السائل الدماغي النخاعي ببطء (بخطوات 40 ميكرولتر / دقيقة) حتى 120 ميكرولتر.
15. استرجع المحقنة ببطء.
16. يتم تطبيق 1 مل من المصل الطبيعي داخل الصفاق لدعم تجديد التجريبية للسوائل.
17. امزج الخزعة السائلة (CSF) مع 400 ميكرولتر من وسط NSC واحتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: يجب معالجة الخزعات السائلة في غضون 3 ساعات إذا لم يتم تجميدها.
18. قم بإزالة القناع الذي يزود المخدر ونقل إلى منطقة مراقبة ما بعد العملية.
    ملاحظة: يجب أن يحدث التعافي من التخدير والحفاظ على الاستلقاء في غضون 5-10 دقائق ، والشفاء التام (السلوك الطبيعي) في غضون 25 دقيقة.
    1. راقب عن كثب الانتعاش (حركة حية وغير منقطعة ، وصول متكرر إلى الماء) في مكان ساخن جيدا (24-25 درجة مئوية) ، مكان هادئ بدون فراش صغير الجسيمات ، والذي يمكن أن يسد الشعب الهوائية. أعد إلى صحبة زملائه في القفص (وليس إلى جديدة) فقط بعد تأكيد الشفاء التام.
    2. مراقبة في مرفق الصيانة لمدة 48 ساعة على الأقل بعد الجراحة. في حال ملاحظة علامات الألم (إخفاء الرأس، وضع غير طبيعي للرأس أو الجسم، فرط الحساسية، وفرط استثارة التعامل)، يتم تطبيق التسكين (على سبيل المثال، 0.3 ملغ/مل من البوبرينورفين تحت الجلد). إحالة ذات الفراء المشوه أو المنسوب إلى الطبيب البيطري المسؤول.

4. معالجة الأنسجة للتألق المناعي

1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق التسريب داخل القلب من 20 مل من محلول ملحي بارد مثلج ، يليه 50 مل من الجليد البارد 4٪ بارافورمالدهايد (PFA ؛ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] من الرقم الهيدروجيني = 7.4).
2. تشريح أنسجة المخ.
   1. افصل الرأس عن الجسم باستخدام مقص لعمل قطع في منطقة عنق الرحم. استخدم المقص لإزالة الجلد ثم قطع عظم الجمجمة على طول خط الوسط السهمي ، مع توجيه أطراف المقص لأعلى حتى لا تتلف أنسجة المخ. تهدف إلى مواصلة القطع قدر الإمكان ، واجتياز خط الوسط الإكليلي.
   2. استخدم الملقط لإزالة العظام ، بدءا من العظام فوق القذالي والجداري وأخيرا العظام الأمامية.
   3. بمجرد الكشف عن أنسجة المخ ، استخدم الملقط أو ملعقة لرفعها من الجمجمة. لتسهيل ذلك ، قم بقطع الأعصاب في قاعدة الدماغ والمصابيح الشمية ، إن لم يكن مطلوبا.
3. بعد تثبيت الأنسجة طوال الليل في 2٪ PFA عند 4 درجات مئوية.
4. قم بحماية الأنسجة بالتبريد في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني) لمدة 48 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية حتى تغوص الأنسجة في القاع.
5. قم بتجميد المنديل عند -80 درجة مئوية.
6. قطع أنسجة المخ إلى أقسام إكليلية بسمك 14 ميكرومتر باستخدام cryostat.
7. إجراء تلطيخ المناعي باستخدام البروتوكولات القياسية ^3,7
   1. احتضان الأقسام مع العازلة المانع (3٪ ألبومين مصل البقر [BSA] ، 0.1٪ Triton X-100 ، في PBS) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إجراء استرجاع المستضد (الغليان لمدة 15 دقيقة في محلول سترات 10 مللي متر ، الرقم الهيدروجيني = 6.0 ، باستخدام الجرار الزجاجية).
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكنها ضرورية للمستضدات النووية.
   3. يحضر إلى درجة حرارة الغرفة ويحتضن بالأجسام المضادة الأولية ضد البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، و doublecortin (Dcx) ، و S100β ، و β-catenin (انظر جدول المواد) في سد المخزن المؤقت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   4. احتضان لمدة ساعتين مع الأجسام المضادة الثانوية في PBS مع 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) للتلطيخ النووي في درجة حرارة الغرفة (انظر جدول المواد).
   5. قم بتركيب أغطية الغطاء.

5. معالجة الخلايا المعزولة للتألق المناعي

1. قم بطلاء الخلايا في 96 لوحة بئر متوافقة مع الفحص المجهري ، مغلفة ببولي-D-lysine (100 ميكروغرام / مل).
2. ثبت الخلايا في الثلج البارد 2٪ PFA لمدة 10 دقائق واغسل 3x باستخدام PBS.
3. إجراء التألق المناعي باستخدام الإجراءات القياسية ^3,7 ل PDGFRα و GFAP و Dcx و SOX2 و ID3 (انظر جدول المواد).
4. احتفظ بالخلايا في PBS + NaN₃ (0.1٪) عند 4 درجات مئوية في الظلام.

6. الفحص المجهري وتحليل الصور

1. التقط صورا باستخدام التألق أو الفحص المجهري متحد البؤر وقم بإجراء عمليات عد الخلايا باستخدام أدوات برامج تحليل الصور القياسية ، مثل عدادات الخلايا.

الإفراج عن وجمع NSCs
يتم فصل NSCs من SEZ عن CSF فقط عن طريق الطبقة الأحادية من الخلايا العصبية ، وإن كانت لا تزال على اتصال مباشر مع محتوى البطين عن طريق إقحام العمليات أحادية الهدب 8,9. يعمل Neuraminidase بشكل خاص على خلايا البطانة العصبية عن طريق انشقاق بقايا حمض السياليك ويمكن أن يؤدي إلى تعرية جدار البطين. هذا يؤدي إلى تجمع الخلايا العصبية على سطح البطين10,11. علاوة على ذلك ، لوحظ تدفق الخلايا العصبية في السائل الدماغي الشوكي بعد حقن i.c.v. لجسم مضاد مانع للإنتغرين-β1 ، ربما بسبب ارتخاء تقاطعات الخلايا بين الخلايا العصبية12. وقد أدت هذه الملاحظات إلى تطوير بروتوكول يتيح عزل الخلايا الجذعية والسلفية في الدماغ عن طريق التسوية الخاضعة للرقابة لسلامة جدران البطين الجانبي. في الخطوة الأولى ، يتم تحفيز الإطلاق من الحمة والتدفق اللاحق ل NSCs أو OPCs داخل السائل الدماغي الشوكي عن طريق حقن i.c.v. من كوكتيل الإطلاق. يتم حقن الكوكتيل بشكل تجسيمي بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة ، بشكل ثنائي (2 ميكرولتر لكل حقنة) في البطينين الجانبيين (الإحداثيات التي تستهدف المناطق الاقتصادية الخاصة NSCs: AP = 0.3 مم ، L = ± 1.2 مم ، D = 3.5 مم ؛ الإحداثيات التي تستهدف CC OPCs: AP = 1.5 مم ، L = ± 2 مم ، D = 3.5 مم). تتضمن الخطوة الثانية ("التجميع") أداء الخزعات السائلة CSF من الصهريج الكبير. يجب تخدير الفئران ويمكن إجراء الخزعة باستخدام محاقن سعة 1 مل. يسمح استخدام جهاز التجسيم بالنجاح الكامل تقريبا في استرجاع ما يقرب من 100 ميكرولتر من السائل الدماغي النخاعي ، دون الحاجة إلى شقوق. تضاف الخزعة السائلة إلى وسط الاستزراع المثلج ويتم الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية حتى الطلاء لمدة <3 ساعات (يحتوي وسط الاستزراع NSC على وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] ، ومكمل B27 [2٪] ، ومكمل N2 [1٪] ، و FGF2 [20 نانوغرام / مل] ، وعامل نمو البشرة [EGF ؛ 20 نانوغرام / مل]).

التقييم النسيجي لمنطقة البطين بعد حقن كوكتيل الإطلاق
كشفت المجموعة الأولى من التجارب أنه عند حقن أكثر من 3 ميكرولتر من السائل ، يمكن أن تتلف البطينين بسبب إصابة ميكانيكية غير محددة (الشكل 2B ، C). أدى الحقن البطيء ل 2 ميكرولتر من كوكتيل الإطلاق إلى ظهور مجموعات من الخلايا العصبية المناعية Dcx على سطح البطين. ظلت هذه المجموعات مرئية حتى بعد 8 أشهر من الحقن (الشكل 2 د). نظرا لأن الطريقة كانت مخصصة للدراسات الطولية ، بهدف المتابعة طويلة الأجل للحيوانات ، فقد تم تقييم تلف الأنسجة الناجم عن كوكتيل الإطلاق. تم إجراء التلوين المناعي على أقسام الدماغ المبردة بسمك 14 ميكرومتر لعلامات الخلايا العصبية ، مثل S100β و β-catenin13 ، وتم تقييم السلامة العامة لطبقة البطانة العصبية. كانت مواقع تعرية الطبقة البطانية موجودة فقط بالقرب من المستوى الوردي الذيلي للحقن ، مع انخفاض تدريجي في اضطرابات الطبقة البطانية المكتشفة في المناطق الخلفية والأمامية من المنطقة الاقتصادية الخاصة (الشكل 2E ، F) وتصبح غائبة بعد مسافة ±2 مم من موقع الحقن. تظهر النتائج المذكورة أعلاه أن التعرية الجزئية لطبقة البطانة العصبية الناتجة عن حقن i.c.v. لكوكتيل الإطلاق بؤري ، مقيد بالقرب من موقع الحقن ، ويترك بقية طبقة البطانة العصبية حول البطينات سليمة.

ملف تعريف العلامة والسلوك المختبري للخلايا المجمعة
بعد ذلك ، تم تقييم السلوك في المختبر وملف تعريف العلامة للخلايا المعزولة عبر بروتوكول الحلب. يبلغ متوسط إنتاج الخلايا لكل خزعة سائلة حوالي 300 ± 45 خلية (لكل خزعة 100 ميكرولتر)7. أسفرت خزعات الحلب عن مزارع NSC بمتوسط 3.17 ± 0.45 إمكانية مرور. يمكن تمرير الخلايا المعزولة من الفئران المحقونة بالمحلول الملحي في المتوسط 1.92 ± 0.76 مرة. في المقابل ، وصل أولئك المعزولون عن طريق الحلب إلى تسعة مقاطع (p = 0.038 ، اختبار t) (الشكل 3A)7. متوسط قدرة المرور لثقافات الغلاف العصبي القياسية المشتقة من المناطق الاقتصادية الخاصة بعد الوفاة أعلى من 12 ممرا في أيدينا. نظرا لأن إمكانات التوسع في الجسم الحي ل SEZ NSCs ، كما كشفت عنها تجارب رسم خرائط مصير الخلايا في الجسم الحي 14 ، قد ثبت أنها محدودة ، فإن الحلب ينتج خلايا ذات سلوك مختلف بشكل كبير في المختبر عن سلوك الخلايا في الثقافات القياسية ، وإن كانت أقرب بكثير إلى سلوك NSCs الذاتية. تم طلاء الخلايا المجمعة على آبار مغلفة بولي دي ليسين ، حيث نمت كطبقات أحادية ملتصقة ونادرا ما تكون كرات عصبية (الشكل 3 ب). كانت الخلايا المعزولة حديثا (التي تم جمعها بعد 3 أيام من الحقن وتثبيتها بعد 24 ساعة من الطلاء) التي كانت إيجابية المناعة للعلامة النجمية GFAP إيجابية المناعة أيضا ل ID3 ، وهي علامة على السكون ، وكان لها خاصية التشكل ثنائي القطب NSC (الشكل 3C). علاوة على ذلك ، كما ورد سابقا7 ، أظهرت مقارنة كيميائية مناعية أكثر تفصيلا للخلايا المشتقة من الخزعة والخلايا المشتقة بعد الوفاة من نفس ، بعد 3 أيام من الحقن (تبحث عن الخلايا النجمية GFAP + ، والخلايا العصبية Dcx + ، وأسلاف الخلايا قليلة التغصن PDGFRa + ، وخلايا SOX2 + من السلالة العصبية) أن ملف تعريف الخلايا المجمعة كان مشابها لخلايا المناطق الاقتصادية الخاصة الداخلية (الشكل 3D). والجدير بالذكر أنه عند مقارنة الخزعة والخلايا المشتقة من الأنسجة في ظروف مختلفة (على سبيل المثال ، حقن كوكتيل إطلاق مع وبدون FGF2) ، وجد أن عامل النمو أدى إلى زيادة مصاحبة وكبيرة في وجود خلايا SOX2 + ، وكذلك في انخفاض كبير في وجود الخلايا العصبية Dcx + في كلتا العينتين (الشكل 3D). أكدت هذه البيانات أن أي تغييرات تظهر في ملف تعريف المجموعات الداخلية ل NSCs تنعكس في عينات الخلايا الناتجة عن الحلب.

الشكل 1: ملخص بياني للحلب. مقطع إكليلي من نصف الكرة المخية مع المعالم التشريحية الرئيسية (البطين الجانبي ، الجسم الثفني المغطي ، والجثة الأمامية أدناه [مساحات المادة البيضاء باللون الرمادي] ، والمنطقة تحت البطانة عند الجدران الجانبية [باللون الأزرق]). يتم حقن كوكتيل الإطلاق في البطين الجانبي ، مما يؤدي إلى المساس بسلامة الأنسجة وإطلاق الخلايا الجذعية العصبية للدماغ بعد الولادة في السائل النخاعي ، والتي يمكن جمعها منها عن طريق الخزعات السائلة. الاختصارات: SEZ = منطقة تحت البطانة ؛ LV = البطين الجانبي. CSF = السائل النخاعي. pbNSCs = الخلايا الجذعية العصبية للدماغ بعد الولادة ؛ β1-int = beta1 integrin. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التقييم النسيجي لآثار حقن i.c.v. (A-D) صور منخفضة التكبير للنصف الظهري للبطين الجانبي بعد التلوين المناعي ل Dcx (باللون الأحمر ، لتمييز الخلايا العصبية). (أ) إن إدخال حقنة هاملتون ببساطة لا يزعج البنية الخلوية للمنطقة الاقتصادية الخاصة ، في حين أن حقن i.c.v. بمقدار 10 مل (معدل التسريب 1 مل / دقيقة) يؤدي إلى تلف شديد في جدار البطين بغض النظر عن محتواه. ب: محلول ملحي، ج: كوكتيل إطلاق. (د) يؤدي حقن 2 ميكرولتر من كوكتيل الإطلاق إلى تسوية خاضعة للرقابة لجدار البطين ، يتم ملاحظتها حتى بعد 8 أشهر من الجراحة. تظهر تفاصيل التكبير الأعلى لجدار المنطقة الاقتصادية الخاصة في 7 و 14 يوما بعد الحقن في (E) و (F) ، على التوالي. هناك بنية غير منظمة ، مع الخلايا العصبية Dcx + (باللون الأخضر) تستريح على سطح الجدار والخلايا الأخرى في مكانها (Sox2 + ، باللون الأبيض) تستريح بشكل أعمق. تلف الأنسجة المحيطة بالبطين على المستوى الوردي للحقن في نقطة زمنية 2 شهر (في G) ، في حين أن الأنسجة سليمة على مستوى أكثر الذيلية (في H) في نفس. يتم تقييم جدار البطين عن طريق التلوين المناعي لعلامات البطانة العصبية S100β و β-catenin. تظهر تفاصيل العمارة النموذجية للجدار في (I). يتم إجراء التلوين النووي باستخدام DAPI (كما هو موضح باللون الأزرق). أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر (A-C ، G ، H ، إدخالات) ، 150 ميكرومتر (D) ، 30 ميكرومتر (E ، F) ، و 50 ميكرومتر (I). تم تعديل هذا الرقم من McClenahan et al.13. الاختصارات: SEZ = منطقة تحت البطانة ؛ i.c.v = داخل بطانة الرحم البطينية. Dcx = دبل كورتين. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تقييم الخلايا المعزولة عن طريق الحلب. (أ) رسم بياني يوضح الحد الأقصى لعدد الممرات التي تم الحصول عليها لكل عينة خزعة سائلة من المحقونة بالمحلول الملحي (القضبان الرمادية ، إجمالي 12 عينة) ، أو بعد الحلب (أشرطة سوداء ، إجمالي 29 عينة ، تطلق كوكتيلا مع النيورامينيداز والجسم المضاد المانع للإنتغرين-β1). (ب) صورة مجهرية متحدة البؤر تمثيلية للخلايا الأولية التي تم الحصول عليها عن طريق الحلب ، بعد 3 أيام من الحقن ، ملطخة بالمناعة ضد GFAP و ID3. (ج، د) صور برايتفيلد للخلايا المعزولة بعد 3 أيام من الحقن ، مطلية على آبار مغلفة ببولي دي ليسين ويسمح لها بالنمو في وسط انتشار NSC لمدة 7 أيام. (ه) رسم بياني يوضح ملف تعريف نوع الخلية للخلايا المعزولة عن طريق حلب المنطقة الاقتصادية الخاصة والسكان الداخليين للمناطق الاقتصادية الخاصة من نفس التجارب. تم زيادة ونقصان كسور SOX2 + و Dcx + بشكل ملحوظ ، على التوالي ، بعد الحقن المشترك ل FGF2. (تحليل ANOVA أحادي الاتجاه لكل علامة ، متبوعا بتحليل ما بعد مخصص ؛ ن = 4-6 لكل مجموعة تجريبية.) أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (C ، D) و 10 ميكرومتر (B). تم تعديل هذا الرقم من McClenahan et al.13. الاختصارات: SEZ = منطقة تحت البطانة ؛ DPI = أيام بعد الحقن ؛ NSC = الخلايا الجذعية العصبية. Dcx = دبل كورتين. GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للإعلان عنه.