يلعب انقباض Actomyosin دورا مهما في تكوين الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، من الصعب التلاعب بانقباض الأكتوميوسين في الجسم الحي بشكل حاد. يصف هذا البروتوكول نظاما بصريا وراثيا يثبط بسرعة انقباض الأكتوميوسين بوساطة Rho1 في أجنة ذبابة الفاكهة ، مما يكشف عن الفقدان الفوري للتوتر الظهاري بعد تعطيل الأكتوميوسين في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعتبر القوى المقلصة الناتجة عن الأكتين والميوسين الثاني غير العضلي ("انقباض الأكتوميوسين") ضرورية للتغيرات المورفولوجية للخلايا والأنسجة على مقاييس طول متعددة ، مثل انقسام الخلايا ، وهجرة الخلايا ، والطي الظهاري ، والتشكل المتفرع. يتطلب الفهم المتعمق لدور انقباض الأكتوميوسين في التشكل مناهج تسمح بالتعطيل السريع للأكتوميوسين ، وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام الأساليب الجينية أو الدوائية التقليدية. يوضح البروتوكول المقدم استخدام نظام dimerization البصري الوراثي القائم على CRY2-CIBN ، Opto-Rho1DN ، لمنع انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع ضوابط زمنية ومكانية دقيقة. في هذا النظام ، يتم دمج CRY2 في الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) ، بينما يتم تثبيت CIBN على غشاء البلازما. يؤدي التثبيط بوساطة الضوء الأزرق ل CRY2 و CIBN إلى الانتقال السريع ل Rho1DN من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، حيث يثبط نشاط الأكتوميوسين عن طريق تثبيط Rho1 الداخلي. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لاقتران تعطيل الأكتوميوسين بوساطة Opto-Rho1DN مع الاستئصال بالليزر للتحقيق في دور الأكتوميوسين في توليد التوتر الظهاري أثناء تكوين ثلم ذبابة الفاكهة البطني. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على العديد من العمليات المورفولوجية الأخرى التي تنطوي على انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع الحد الأدنى من التعديلات. بشكل عام ، تعد هذه الأداة البصرية الجينية نهجا قويا لتشريح وظيفة انقباض الأكتوميوسين في التحكم في ميكانيكا الأنسجة أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية.
المقدمة
انقباض Actomyosin ، قوة الانقباض التي يمارسها الميوسين II غير العضلي (المشار إليه فيما يلي باسم "الميوسين") على شبكة F-actin ، هي واحدة من أهم القوى في تغيير شكل الخلية ودفع التشكل على مستوى الأنسجة 1,2. على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط انقباض الأكتوميوسين في المجال القمي للخلايا الظهارية إلى انقباض قمي ، مما يسهل مجموعة متنوعة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك الطي الظهاري ، وقذف الخلايا ، والتفريغ ، والتئام الجروح3،4،5،6،7. يتطلب تنشيط الميوسين فس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الصليب الجيني وإعداد كوب جمع البويضات
- حدد الذباب الأنثوي (العذراء) من الخط البصري الوراثي UASp-CIBNpm (I) ؛ UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) على وسادة CO2 تحت المجهر المجسم وإعداد صليب مع الذباب الذكور من خط سائق الأم GAL4 67 Sqh-mCherry ؛ 15 E-cadherin-GFP.
ملاحظة: يرمز 67 و 15 إلى الأم توبولين GAL4 الذي تم إدخاله في الكروموسومات الثانية (II) والثالثة (III) ، على التوالي52. يعبر خط GAL4 المستخدم في هذا البروتوكول أيضا عن سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين الموسومة ب mCherry Sqh (اسباجيتي الاسكواش) 37 و E-cadherin53 الموسوم ب GFP. قد لا يزال الذباب من ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الأجنة غير المحفزة التي تخضع للانقباض القمي ، أصبح Sqh-mCherry غنيا في المنطقة القمية المتوسطة لخلايا الأديم المتوسط البطني ، بينما كان CRY2-Rho1DN-mCherry خلويا (الشكل 1 أ). أدى الاجتثاث بالليزر داخل مجال الانقباض إلى ارتداد سريع للأنسجة على طول محور A-P (الشكل 1B ، C). في الأجنة المحفزة ، أصبحت إشارة CRY2-Rho1DN-mCherry غشاء بلازما موضعيا ، في حين اختفت الإشارة المتوسطة ل Sqh-mCherry تماما (الشكل 1 أ). لم يؤد ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصف هذا البروتوكول الاستخدام المشترك لعلم البصريات الوراثي والاستئصال بالليزر لاستكشاف التغيرات في توتر الأنسجة مباشرة بعد تعطيل انقباض الأكتوميوسين. تستفيد الأداة البصرية الوراثية الموصوفة هنا من الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) لتثبيط انقباض الأكتوميوسين الداخلي المنشأ Rho1 و Rho1 بشكل حاد. أظهر التوصيف السابق ل Opto-Rho1DN في سياق تكوين الأخدود البطني لذبابة الفاكهة أن الأداة فعالة للغاية في التوسط في التعطيل السريع لانقباض الأكتوميوسين القمي من خلال تعطيل الميوسين المتزامن وتفكيك الأكتين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون آن لافانواي على دعم التصوير. يشكر المؤلفون مختبر Wieschaus ومختبر De Renzis لمشاركة الكواشف ومركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة لمخزون الذباب. هذه الدراسة مدعومة من قبل NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ومنحة البحوث المؤسسية لجمعية السرطان الأمريكية #IRG-82-003-33 إلى BH.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق زجاجي القاع مقاس 35 مم | MatTek | P35G-1.5-10-C | يستخدم لتحضير العينات |
| 60 مم ومرات طبق بتري 15 مم بغطاء | فالكون | 351007 | يستخدم لتحضير العينات |
| قطعة قماش سوداء لتغطية المجهر | عبر الإنترنت | NA | تستخدم لتجنب التحفيز الضوئي غير المرغوب فيه |
| مبيض كلوركس الترا جرميكادي (8.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم) | VWR | 10028-048 | تستخدم لتفكيك الأجنة |
| CO2< / sub> pad | Genesee Scientific | 59-114 | تستخدم للإعداد المتقاطع |
| ddH2< / sub>O | NA | NA | تستخدم لإعداد العينة |
| Dumont Style 5 ملاقط | VWR | 102091-654 | تستخدم لإعداد العينة |
| أداة رمش (مصنوعة من فرشاة مستديرة السمور الأحمر النقي # 2) | VWR | 22940-834 | تستخدم لإعداد |
| العينة FluoView (برنامج) | Olympus | NA | تستخدم للحصول على الصور والتحفيز البصري الوراثي |
| زيت الهالوكربون 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | تستخدم لتصور مرحلة الجنين |
| ImageJ / FIJI | NIH | NA | تستخدم لتحليل الصور |
| MATLAB | MathWorks | NA | تستخدم لتحليل الصور |
| نيكون SMZ-745 مجسم | نيكون | NA | يستخدم لإعداد العينة |
| مجهر أوليمبوس FVMPE-RS متعدد الفوتون مع ليزر فائق السرعة ثنائي الخط InSight DS للتصوير متعدد الفوتون ثنائي الطول الموجي المتزامن ، وهدف الغمر في الماء 25x / NA1.05 (XLPLN25XWMP2) ، ووحدة تحفيز الأشعة تحت الحمراء / VIS لتنشيط / تحفيز الصور. تم تجهيز هذا النظام أيضا بمرشح TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x ، 565BS ، 620/60M) ، ووحدة إضاءة مضان تنبعث منها ضوء أبيض. | يستخدم Olympus | NA | للحصول على الصور والتحفيز البصري للوراثة |
| SP Bel-Art صندوق تخزين فريزر بولي بروبلين 100 مكان (صندوق أسود مقاوم للضوء لنقل العينات) | VWR | 30621-392 | يستخدم لتجنب التحفيز الضوئي غير المرغوب فيه |
| درع مرشح الأشعة فوق البنفسجية للفلورات FM1403 (درع بلاستيكي برتقالي أحمر) | بوليوبتكس | FM14036151 | تستخدم لتجنب تحفيز |
| الضوء غير المرغوب فيهVITCHELO V800 كشافات أمامية مع أضواء LED بيضاء وحمراء | Amazon | NA | تستخدم لتجنب تحفيز الضوء غير المرغوب فيه |
المراجع
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
