مقالة منهجية

الكشف الكمي عن الروابط المتقاطعة بين الحمض النووي والبروتين وتعديلاتها اللاحقة للترجمة

DOI:

10.3791/65315

⸱

أبريل 21, 2023

1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة معدلة للكشف عن الوصلات المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs) وقياسها كميا وتعديلاتها اللاحقة للترجمة (PTMs) ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، و SUMOylation ، و ADP-ribosylation التي تسببها مثبطات توبويزوميراز والفورمالديهايد ، مما يسمح بدراسة تكوين وإصلاح DPCs و PTMs الخاصة بها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الروابط المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs) هي آفات الحمض النووي المتكررة والمنتشرة في كل مكان والضارة ، والتي تنشأ من تلف الحمض النووي الداخلي ، أو خلل في الإنزيم (topoisomerases ، methyltransferases ، إلخ) ، أو العوامل الخارجية مثل العلاج الكيميائي وعوامل التشابك. بمجرد تحفيز DPCs ، يتم على الفور اقتران عدة أنواع من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) بها كآليات استجابة مبكرة. لقد ثبت أنه يمكن تعديل DPCs بواسطة ubiquitin ، ومعدل صغير يشبه ubiquitin (SUMO) ، و poly-ADP-ribose ، والتي تهيئ الركائز للإشارة إلى إنزيمات الإصلاح المخصصة لها ، وفي بعض الحالات ، تنسيق الإصلاح بطرق متسلسلة. نظرا لأن PTMs تظهر بسرعة ويمكن عكسها بشكل كبير ، فقد كان من الصعب عزل واكتشاف DPCs المترافقة PTM التي تظل عادة عند مستويات منخفضة. يظهر هنا مقايسة مناعية لتنقية واكتشاف DPCs في كل مكان و SUMOylated و ADP ريبوزيلات (توبويزوميراز DPCs التي يسببها الدواء و DPCs غير المحددة التي يسببها الألدهيد) في الجسم الحي. هذا الفحص مشتق من اختبار RADAR (النهج السريع لاستعادة تقريب الحمض النووي) الذي يستخدم لعزل الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على DPCs عن طريق ترسيب الإيثانول. بعد التطبيع وهضم النيوكلياز ، يتم الكشف عن PTMs من DPCs ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، SUMOylation ، و ADP-ribosylation ، عن طريق النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة المقابلة لها. يمكن استخدام هذا الفحص القوي لتحديد وتوصيف الآليات الجزيئية الجديدة التي تعمل على إصلاح DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية ولديها القدرة على اكتشاف مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف عوامل محددة تنظم PTMs لإصلاح DPCs.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدث تلف الحمض النووي الجينومي بسبب الاضمحلال التلقائي والتلف الداخلي والعوامل البيئية1. تشمل آفات الحمض النووي الناتجة القواعد التالفة ، وعدم التطابق ، وفواصل الشريط الفردي والمزدوج ، والوصلات المتقاطعة بين الخيوط وداخلها ، والارتباطات المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs). يتكون DPC عندما يتم احتجاز بروتين مرتبط بالكروماتين على الحمض النووي من خلال الارتباط التساهمي. يتم تحفيز DPCs بواسطة آفات الحمض النووي الداخلية والمستقلبات التفاعلية ، وكذلك العوامل الخارجية مثل العلاج الكيميائي وعوامل التشابك ثنائية الوظيفة. في ظل ظروف معينة ، يمكن أن يؤدي ضعف الإنزيم أيضا إلى تكوين DPCs2. يؤدي الاختلاف الشاسع في محفزات DPC إلى اختلاف في هوية البروتين المرتبط تساهميا ، ومنطقة الكروموسوم حيث يتم تشكيل DPC ، ونوع بنية الحمض النووي المتشابك مع البروتين ، والخاصية الكيميائية للارتباط التساهمي بين البروتين والحمض النووي2،3،4.

بناء على طبيعتها الكيميائية ، يتم تصنيف DPCs بشكل عام إلى مجموعتين: DPCs الأنزيمية و DPCs غير الأنزيمية. تعمل بعض الإنزيمات مثل topoisomerases و glycosylases و methyl / acyltransferases عن طريق تكوين وسطاء تساهميين عكسيين للإنزيم والحمض النووي أثناء تفاعلاتهم التحفيزية العادية. هذه هي وسيطة إنزيم الحمض النووي قصيرة العمر ويمكن تحويلها إلى DPCs إنزيمية طويلة العمر عند محاصرتها بواسطة عوامل داخلية أو خارجية ، ولا سيما عن طريق العلاج الكيميائي3. تعد توبويزوميراز DPCs من بين DPCs الأنزيمية الأكثر شيوعا في الخلايا حقيقية النواة ، والتي يمكن توليدها بواسطة مثبطات توبويزوميراز المفيدة سريريا (توبوتيكان وإرينوتيكان لتوبويزوميراز I [TOP1] وإيتوبوسيد ودوكسوروبيسين لتوبويزوميراز II [TOP2]) وهي الآليات العلاجية الأساسية لهذه المثبطات 5,6. ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT) 1 و 3A و 3B هي هدف 5-aza-2'-deoxycytidine (المعروف أيضا باسم decitabine) وتشكل DPCs عند التعرض للدواء7. تحفز العوامل التفاعلية ، وكذلك الأشعة فوق البنفسجية والإشعاعات المؤينة ، DPCs غير الأنزيمية عن طريق ربط البروتينات المتشابكة بشكل غير محدد بالحمض النووي. غالبا ما يتم إنشاء الألدهيدات التفاعلية مثل الأسيتالديهيد والفورمالديهايد (FA) كمنتجات ثانوية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، ومن بينها FA يتم إنتاجه بتركيزات ميكرومولار أثناء استقلاب الميثانول ، وبيروكسيد الدهون ، وإزالة ميثيل الهستون. أيضا ، FA هي مادة كيميائية ذات حجم كبير يتم تصنيعها في جميع أنحاء العالم ، والتي يتعرض لها الكثير من الناس بيئيا ومهنيا 8,9.

تعتبر كل من DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية شديدة السمية للخلايا حيث أن مكوناتها البروتينية الضخمة تعيق بكفاءة جميع العمليات القائمة على الكروماتين تقريبا ، بما في ذلك النسخ المتماثل والنسخ ، مما يؤدي إلى توقف دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج إذا تركت دون إصلاح. على مدى العقدين الماضيين ، تمت دراسة إصلاح DPCs بقوة ، وتم تحديد العديد من البروتينات / المسارات كعوامل رئيسية إما إصلاح DPCs مباشرة أو تعديل عمليات الإصلاح الخاصة بها. على سبيل المثال ، لقد ثبت جيدا أن التحلل البروتيني للجزء الأكبر من البروتين في DPC هو خطوة محورية لإصلاح DPC ، وأن التحلل البروتيني يمكن تحفيزه بواسطة البروتياز SPRTN 10،11،12،13،14 ، FAM111A15 ، GCNA 16،17 ، أو مجمع البروتيازوم26S 18،19،20،21،22,23,24,25,26,27 بطريقة تعتمد على نوع الخلية أو السياق الخلوي. اعتمد تحديد وتوصيف هذه البروتياز إلى حد كبير على المركب في الجسم الحي لمقايسة الإنزيم (ICE)28,29 والنهج السريع لمقايسة استعادة تقريب الحمض النووي (RADAR)30,31 ، وكلاهما يعزل جزيئات الحمض النووي وبروتيناتها المرتبطة تساهميا من البروتينات الخلوية الحرة للسماح بالكشف عن DPCs عن طريق لطخة الفتحة باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات المتشابكة. أيضا ، تم استخدام مقايسة التلوين المناعي للحمض النووي للأغاروز المحاصر (TARDIS) كوسيلة للكشف عن DPCs وقياسها على مستوى الخليةالواحدة 32. حاليا ، يختار الباحثون مقايسة الرادار على مقايسة ICE لقياس DPCs ، حيث يعتمد اختبار ICE على تنقية الأحماض النووية باستخدام الطرد المركزي الفائق لتدرج كلوريد السيزيوم ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا للغاية ، في حين أن فحص الرادار يترسب الأحماض النووية باستخدام الإيثانول في غضون فترة أقصر بكثير.

في السنوات الأخيرة ، ظهرت أدلة متزايدة على أن العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) تشارك في الإشارة وتوظيف البروتيازالمستهدف DPC 3،33،34،35. على سبيل المثال ، تم العثور على كل من TOP1- و TOP2-DPCs مترافقة بواسطة معدل صغير يشبه يوبيكويتين (SUMO) -2/3 ثم SUMO-1 بواسطة SUMO E3 ligase PIAS4 ، بشكل مستقل عن تكرار الحمض النووي والنسخ. يبدو أن تعديلات SUMO المتسلسلة هي هدف لليوبيكويتين ، الذي يتم ترسبه في SUMOylated TOP-DPCs ويشكل سلاسل بوليمرية من خلال بقايا اللايسين 48 بواسطة يوبيكويتين ليجاز مستهدف من سومو يسمى RNF4. بعد ذلك ، يثير بوليمر ubiquitin إشارة إلى وتجنيد البروتيازوم 26S إلى TOP-DPCs23,36. تم مؤخرا عرض نفس مسار SUMO-ubiquitin للعمل على DNMT1-DPCs بالإضافة إلى مجمعات PARP-DNA لإصلاحها37,38. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن وجود في كل مكان مستقل عن SUMO بواسطة ubiquitin E3 ligase TRAIP إلى DPCs الأولية لتدهور البروتيازوم بطريقة مقترنة بالتكرار39. على غرار التدهور البروتيني ل TOP-DPCs ، يتطلب التحلل البروتيني ل DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية بواسطة الميتالوبروتياز SPRTN المقترن بالنسخ المتماثل أيضا وجود ركائز DPC في كل مكان كآلية لإشراك SPRTN40,41. يتطلب تحديد دور SUMOylation و ubiquitylation الكشف عن DPCs التي تم تمييزها بهذه PTMs. نظرا لأن مقايسة ICE الأصلية ومقايسة الرادار تعتمد على جهاز اللطخة / البقعة النقطية لقياس عينات الحمض النووي غير المهضومة ، فإن أيا من هذين الاختبارين غير قادر على حل وتصور أنواع DPC المترافقة PTM بأوزان جزيئية مختلفة. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بهضم عينات الحمض النووي بعد تنقيتها عن طريق ترسيب الإيثانول وتطبيع العينة باستخدام نوكلياز المكورات الدقيقة ، وهو DNA و RNA endo-exonuclease لإطلاق البروتينات المتشابكة ، مما مكننا من حل البروتينات وكذلك PTMs التساهمية مع دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE). سمح لنا الرحلان الكهربائي باكتشاف وقياس DPCs المترافقة PTM باستخدام أجسام مضادة محددة تستهدف PTMs. أطلقنا في البداية على هذه الطريقة المحسنة اسم اختبار DUST ، لتسليط الضوء على قوتها في الكشف عن TOP-DPCs في كل مكان و SUMOylated23. في وقت لاحق ، قمنا بتوسيع استخدام الفحص لتقييم ADP-ribosylation كميا ل TOP1-DPCs في الجسم الحي ، باستخدام الأجسام المضادة ضد بوليمرات poly-ADP-ribose20.

يظهر هنا بروتوكول مفصل للفحص الذي يكتشف ويقيس DPCs في كل مكان ، SUMOylated ، و ADP-ribosylated ، والذي تم تحسينه ل TOP-DPCs المعدلة التي تسببها مثبطاتها و DPCs غير المحددة / غير الأنزيمية التي يسببها FA. يعزل هذا الفحص DPCs المترافقة PTM عن طريق تحلل الخلايا بعامل شاوتروبيك ، وترسيب الحمض النووي بالإيثانول ، وإطلاق البروتينات المتشابكة ومعدلاتها مع نوكلياز المكورات الدقيقة. يتم قياس البروتينات المرتبطة بالحمض النووي و PTMs الخاصة بها عن طريق النشاف المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة. يمهد هذا الفحص طريقا جديدا لتوضيح الآليات الجزيئية التي تقوم الخلية من خلالها بإصلاح كل من DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية. على وجه التحديد ، فإنه يتيح إجراء دراسات مفصلة عن تحريض وحركية PTMs المهمة لتنظيم تدهور وإصلاح TOP-DPC ، وبالتالي يسمح باكتشاف عوامل جديدة مثل أربطة E3 التي تملي PTMs ، وكذلك مثبطات تستهدف هذه العوامل. نظرا لأن بعض PTMs المسؤولة عن إصلاح TOP-DPC من المحتمل أن تشارك في إصلاح DPCs التي تسببها العلاجات الكيميائية الأخرى ، مثل الأدوية القائمة على البلاتين22 ، فإن هذا الاختبار لديه أيضا إمكانية التطبيق لاكتشاف أدوية جديدة والتحسين العقلاني للعلاجات التوافقية مع مثبطات توبويزوميراز أو مضادات الأورام القائمة على البلاتين في خلايا المريض لتوجيه أنظمة العلاج.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا والعلاج بالعقاقير في خط الخلية الجنينية البشرية 293 (HEK293)

  1. تحضير وسط الاستزراع ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ 2 mM L-glutamine ، و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين.
  2. البذور 1 × 10 6 خلايا في لوحة 60 مم أو لوحة6 آبار لكل حالة معالجة بالإضافة إلى التحكم.
  3. في اليوم التالي ، عالج الخلايا بمحرضات DPC التي تختارها.
    1. للحث على TOP1-DPCs وانتشارها في كل مكان و SUMOylation ، أضف مثبط TOP1 camptothecin عند 20 ميكرومتر إلى الخلايا واجمع الخلايا في 20 و 60 و 180 دقيقة.
    2. للحث على TOP2α و β-DPCs وانتشارها في كل مكان و SUMOylation ، قم بتعريض الخلايا لإضافة مثبط TOP2 etoposide عند 200 ميكرومتر إلى الخلايا وجمع الخلايا في 20 و 60 و 180 دقيقة.
    3. للحث على DPCs غير الأنزيمية وانتشارها في كل مكان و SUMOylation ، أضف FA عند 1 mM واجمع الخلايا بعد 2 ساعة من التعرض.
    4. للحث على استئصال TOP1-DPCs ، قم بمعالجة الخلايا مسبقا لمدة ساعة واحدة لمنع إزالة التحلل باستخدام مثبط جليكوهيدرولاز بولي (ADP-ريبوز) (PARG) PDD00017273 عند 10 ميكرومتر ، تليها المعالجة المشتركة مع 20 ميكرومتر كامبتوثيسين لمدة 20 و 60 و 180 دقيقة.

2. عزل وتطبيع الحمض النووي الذي يحتوي على بروتينات متشابكة

  1. قم بشفط الوسائط بسرعة باستخدام ماصة شفط بعد العلاج واشطف الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج 1x (PBS). تحلل الخلايا على الفور في 600 ميكرولتر من كاشف DNAzol الذي يحتوي على مثبط كوكتيل البروتياز 1x ، و 1 mM dithiothreitol (DTT) ، و 20 mM N-ethylmaleimide (مثبط إنزيمات deSUMOylating و deubiquitylating).
  2. حرك اللوحة ببطء على منصة اهتزازية لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. أضف 1/2 حجم الإيثانول البارد بنسبة 100٪ (0.3 مل) مباشرة إلى اللوحة وكرر الخطوة 2.2 حتى يصبح ركام الحمض النووي غير الشفاف مرئيا. انقل الخلية المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وأخضع الأنبوب للطرد المركزي بسرعة قصوى (20000 × جم) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب الحمض النووي وبروتيناته المتشابكة.
  4. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة شفط واغسل حبيبات الحمض النووي في 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ متبوعا ب 2 دقيقة من الطرد المركزي 20000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  5. نضح المادة الطافية ، وقم بتدويرها بنفس السرعة ، وقم بإزالة السائل المتبقي باستخدام ماصة P20. جفف الحبيبات في الهواء لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإذابة حبيبات الحمض النووي بسرعة في 0.1 مل من ddH2O. أعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب المتكرر ثم احتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تتضخم الحبيبات إلى ثلاث مرات على الأقل أكبر (حوالي 30 دقيقة).
  7. قم بفحص العينات باستخدام مسبار معالج بالموجات فوق الصوتية بسعة 30٪ لمدة 10 ثوان لإذابة الحبيبات بالكامل.
  8. خطوة اختيارية: عالج العينات بمزيج RNase A / T1 (10 ميكروغرام من RNase A و 25 U من RNase T1) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف حجم 1/10 من أسيتات الصوديوم 3 M ومجلدين من الإيثانول المثلج بنسبة 100٪ إلى الأنبوب ، متبوعا بالطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 10 دقائق لاسترداد الحمض النووي. أزل المادة الطافية وقم بإذابة الحمض النووي المترسب في 0.1 mL من ddH2O.
  9. خطوة اختيارية: جهاز طرد مركزي للعينة لمدة 5 دقائق عند 20000 × جم ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  10. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئية (UV-Vis). يبلغ إنتاج الحمض النووي النموذجي حوالي 600-800 نانوغرام / ميكرولتر. يجب تخفيض نسبة A260 / A280 من 2.0-2.1 إلى 1.8-1.9 بعد إزالة الحمض النووي الريبي.
  11. اضبط تركيز الحمض النووي إلى 400-500 نانوغرام / ميكرولتر في 0.12 مل من ddH 2 O. انقل 20 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد كتحكم في تحميل الحمض النووي غير المهضوم (راجع الخطوة2.4).
  12. لهضم الحمض النووي المذاب في ال 100 ميكرولتر المتبقية من ddH2O ، أضف 2000 وحدة هلام من نوكلياز المكورات الدقيقة جنبا إلى جنب مع حجم 1/10 (~ 11 ميكرولتر) من 10x محلول تفاعل نوكلياز المكورات الدقيقة الكالسيوم إلى العينة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

3. النشاف الغربي لعينات الحمض النووي المهضومة

  1. أضف 4x Laemmli عينة عازلة ، ثم اغلي العينة لمدة 5 دقائق.
  2. قم بتحميل 5-6 ميكروغرام من العينة المهضومة (~ 15 ميكرولتر) على جل بولي أكريلاميد 4٪ -20٪ ، متبوعا ب SDS-PAGE42 لحل DPCs غير المعدلة والمترافقة PTM.
  3. للكشف عن أنواع DPC غير الأنزيمية التي يسببها FA ، احتضن الجل بصبغة Coomassie الزرقاء طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. اغسل الجل باستخدام ddH2O لمدة ساعتين واحصل على صورة باستخدام نظام التصوير.
  4. نقل الجل واحتضان الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التخفيفات المناسبة من الأجسام المضادة الأولية في سد العازلة.
    1. للكشف عن الوجود في كل مكان ، قم بتخفيف 1: 100 من الأجسام المضادة المضادة لليوبيكوتين.
    2. للكشف عن تعديل SUMO-1 أو SUMO-2/3 ، قم بإجراء تخفيف 1: 250 من الأجسام المضادة المضادة SUMO-1 أو المضادة ل SUMO-2/3.
    3. للكشف عن ADP-ribosylation ، قم بتخفيف 1: 500 من الأجسام المضادة المضادة ل PAR.
    4. للكشف عن إجمالي TOP1- أو TOP2α- أو TOP2β-DPCs ، قم بإجراء تخفيف 1: 500 من الأجسام المضادة TOP1 أو anti-TOP2α أو anti-TOP2β.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول تخفيف الأجسام المضادة.
  5. احتضان غشاء مغسول 1x PBS-T (0.1٪ tween 20) بجسم مضاد ثانوي مخفف 5000 ضعف في عازلة مانعة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. تطوير الغشاء باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) والحصول على صورة باستخدام نظام التصوير.

4. النشاف الفتحات لعينات الحمض النووي غير المهضومة

  1. تمييع عينة الحمض النووي غير المهضومة 20 ميكرولتر في 180 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم (25 مللي مول ، درجة الحموضة 6.6).
  2. قطع غشاء النيتروسليلوز (0.45 ميكرومتر) والتوازن لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت فوسفات الصوديوم.
  3. قم بتجميع جهاز الفتحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتوصيله بنظام تفريغ.
  4. اغسل الآبار بمحلول فوسفات الصوديوم عن طريق تطبيق الفراغ. تأكد من عدم وجود تسرب للآبار.
  5. أوقف الفراغ وقم بتحميل 200 ميكرولتر من الحمض النووي لكل عينة (1 ميكروغرام). املأ الآبار الفارغة ب 200 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم.
  6. تطبيق الفراغ.
  7. عندما تكون جميع الآبار فارغة تماما ، أوقف الفراغ ، وقم بتحميل 200 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم في كل بئر ، وكرر الخطوة 4.6.
  8. استرجع الغشاء وكتلته بحاجز مانع بنسبة 5٪ لمدة 0.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  9. دقق باستخدام الجسم المضاد للحمض النووي المزدوج (dsDNA) عند تخفيف 1: 5000 طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  10. اغسل 3x ب 1x PBS-T واحتضن بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر مرتبط بالفجل المخفف 1: 5,000 (HRP).
  11. تطوير الغشاء باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) والحصول على صورة باستخدام نظام التصوير.

5. تحليل الكثافة

  1. باستخدام ImageJ ، احسب نسبة شدة كل شريط / لطاخة بالنسبة إلى شدة فتحة الحمض النووي غير المهضوم وقم بتطبيع النسبة إلى الخلايا بدون / قبل العلاج بالعقاقير.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر النتائج التمثيلية المعروضة في الشكل 1 تكوين وحركية TOP1-DPCs التي يسببها الدواء وSUMOylation و ubiquitylation. شق TOP1 حبلا واحدا من الحمض النووي المزدوج وشكل وسيطا تساهميا للإنزيم والحمض النووي ، يسمى مجمع الانقسام TOP1 (TOP1cc). علاج الكامبتوثيسين (CPT) ، وهو مثبط TOP1 ، مرتبط ب TOP1cc ومستقر ، مما يؤدي إلى تكوين TOP1-DPCs طويلة العمر. لوحظ أن TOP1-DPCs مستحثة وتبلغ ذروتها بعد 20 دقيقة من التعرض ل CPT. في الوقت نفسه ، تم تعديل TOP1-DPCs بواسطة SUMO-2/3 ، والتي بلغت ذروتها أيضا بعد 20 دقيقة من علاج CPT. نظرا لأن SUMO-2 و SUMO-3 يشتركان في هوية تسلسل بنسبة 95٪ ، فإن الجسم المضاد لا يميز أحدهما عن الآخر. في 60 دقيقة ، تضاءلت TOP1-DPCs وتعديل SUMO-2/3 الخاص بها ، مصحوبا بتتويج تعديل SUMO-1 وانتشارها في كل مكان. بعد العلاج بالعقاقير لمدة 60 دقيقة ، بدأت مستويات تعديل TOP1-DPC SUMO-1 والانتشار في كل مكان في الانخفاض. في الثدييات ، تعمل α إيزوزيمات TOP2 β عن طريق إدخال كسر مزدوج الخيوط DNA ، وكذلك عن طريق تكوين مركب تساهمي إنزيم DNA عابر وقابل للانعكاس (TOP2cc). مثبطات TOP2 ، مثل etoposide (ETOP) ، تحول TOP2cc إلى TOP2-DPCs وتحفز SUMOylation و ubiquitylation. على غرار حركية TOP1-DPCs و PTMs الخاصة بهم ، وصلت TOP2α- و β-DPCs وتعديل SUMO-2/3 إلى ذروتها في 20 دقيقة ، ثم بدأت في الانخفاض. وفي الوقت نفسه ، بلغت تعديلات SUMO-1 و ubiquitin ذروتها في 60 دقيقة (الشكل 2). وقد ثبت أن إزالة TOP-DPCs ناتجة عن تحلل البروتيازوم ، ومن المحتمل أن يكون إزالة TOP-DPC SUMOylation و ubiquitylation بسبب إعادة التدوير عن طريق إزالة SUMOylation و deubiquitylation ، على التوالي ، بواسطة إنزيماتها العكسية. فحصت التجارب في الشكل 3 DPCs غير الأنزيمية التي يسببها FA و PTMs الخاصة بها. لوحظ أن DPCs و SUMO-2/3 و SUMO-1 و ubiquitylation تشكلت وتراكمت بطريقة تعتمد على جرعة FA. أخيرا ، تم الكشف عن PARylation من TOP1-DPCs كميا باستخدام جسم مضاد مضاد ل PAR باستخدام نفس الطريقة (الشكل 4). لم يكن من الممكن اكتشاف TOP1-DPC PARylation ما لم تتم إضافة مثبط PARG إلى الخلية ، مما يشير إلى أن PARylation يحدث على الفور وهو ديناميكي للغاية. تمشيا مع النتيجة السابقة ، يبدو أن تثبيط dePARylation بواسطة PARGi يتراكم TOP1-DPCs ، على الأرجح عن طريق منع التحلل البروتيني.

figure-results-1
الشكل 1: التحليلات الكمية لتكوين وحركية TOP1-DPCs وSUMOylation وانتشارها في كل مكان عند معالجة CPT في خلايا HEK293. (أ) عولجت خلايا HEK293 ب 20 ميكرومتر CPT لفترات زمنية محددة. تم حصاد محللات الخلايا وإخضاعها لمقايسة الرادار المعدلة والنشاف الغربي بالأجسام المضادة المشار إليها. تعرضت عينات الحمض النووي غير المهضومة لنشاف الفتحات باستخدام الأجسام المضادة ل dsDNA كعنصر تحكم في التحميل. (ب) تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ ورسمها باستخدام برنامج Prism. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التحليلات الكمية لتكوين وحركية TOP2-DPCs وSUMOylation وانتشارها في كل مكان عند معالجة ETOP في خلايا HEK293. (أ) عولجت خلايا HEK293 ب 200 ميكرومتر ETOP لفترات زمنية محددة. تم حصاد محللات الخلايا وإخضاعها لمقايسة الرادار المعدلة والنشاف الغربي بالأجسام المضادة المشار إليها. تعرضت عينات الحمض النووي غير المهضومة لنشاف الفتحات باستخدام الأجسام المضادة ل dsDNA كعنصر تحكم في التحميل. (ب) تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ ورسمها باستخدام برنامج Prism. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحليلات الكمية ل DPCs غير الأنزيمية و SUMOylation و ubiquitylation عند معالجة FA في خلايا HEK293. (أ) عولجت خلايا HEK293 ب FA بتركيزات محددة لمدة 2 ساعة. تم حصاد محللات الخلايا وإخضاعها لمقايسة الرادار المعدلة والنشاف الغربي بالأجسام المضادة المشار إليها. تعرضت عينات الحمض النووي غير المهضومة لنشاف الفتحات باستخدام الأجسام المضادة ل dsDNA كعنصر تحكم في التحميل. (ب) تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ ورسمها باستخدام برنامج Prism. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التحليلات الكمية ل TOP1-DPCs و PARylation عند معالجة CPT في خلايا HEK293. (أ) تمت معالجة خلايا HEK293 مسبقا ب 10 ميكرومتر PARGi لمدة 1 ساعة ثم تمت معالجتها مع CPT لفترات زمنية محددة. تم حصاد محللات الخلايا وإخضاعها لمقايسة الرادار المعدلة والنشاف الغربي بالأجسام المضادة المشار إليها. تعرضت عينات الحمض النووي غير المهضومة لنشاف الفتحات باستخدام الأجسام المضادة ل dsDNA كعنصر تحكم في التحميل. (ب) تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ ورسمها باستخدام برنامج Prism. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح الطريقة الموصوفة بقياس الروابط المتقاطعة لبروتين الحمض النووي الأنزيمي وغير الأنزيمي في خلايا الثدييات وهي الطريقة المناسبة الوحيدة لدراسة انتشارها في كل مكان ، و SUMOylation ، و ADP-ribosylation. يسمح النشاف بالفتحات بعد فحص ICE أو RADAR بالكشف السريع عن DPCs الأنزيمية المحددة مثل TOP-DPCs باستخدام أجسامها المضادة. ومع ذلك ، فإن التحذير من هذه الطريقة هو عدم قدرتها على فصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة ، مما يجعل من المستحيل تحديد أحجام DPCs المترافقة PTM. تحل الطريقة الموصوفة المشكلة عن طريق إطلاق بروتينات متشابكة مع نوكلياز المكورات الدقيقة ، والتي تحلل الحمض النووي إلى قليل النوكليوتيدات مع الفوسفات الطرفي 3'، مما يسمح بالفصل الكامل للبروتينات (المترافقة مع قليل النيوكليوتيدات) بواسطة SDS-PAGE. وبالتالي ، يمكن تصور DPCs المعدلة باستخدام مونومرات ubiquitin أو SUMO أو ADP-ribose والبوليمرات ذات الأحجام المختلفة وقياسها من خلال الأجسام المضادة التي تستهدف هذه PTMs ، مما يتيح إجراء فحص مفصل لتكوينها وحركيتها. لضمان التكاثر وحساب الأهمية الإحصائية ، يلزم وجود نسخ بيولوجية مكررة للتجارب.

واحدة من أكثر المشاكل شيوعا في هذا الفحص هي انخفاض إنتاج الحمض النووي بعد ترسيب الإيثانول. من ناحية ، يمكن زيادة إنتاج الحمض النووي مع المزيد من المواد الأولية (الخلايا). من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي احتضان الخلية إلى تحلل الإيثانول في صفيحة مسطحة بدلا من أنبوب إيبندورف إلى تحسين تجميع جزيئات الحمض النووي بشكل ملحوظ وبالتالي تسهيل ترسيبها. قد تشير الإشارات غير المحددة التي لوحظت في العينات بدون علاجات دوائية إلى تلوث البروتين غير التساهمي. إذا كانت هذه هي الحالة, يمكن للمرء أن ينظر في غسل الكريات الحمض النووي مع عازلة عالية الملح لإزالة الملوثات قبل صوتنة. يوصى أيضا بتدوير عينات الحمض النووي بعد صوتنة وهضم نوكلياز المكورات الدقيقة والتخلص من أي غير قابل للذوبان. في حالة ضعف الإشارة أو عدم وجود إشارة ، يمكن محاولة العديد من الحلول المحتملة. أولا ، يمكن للمرء زيادة كمية تحميل الحمض النووي ل SDS-PAGE و immunoblotting. لجعل أنواع DPC SUMOylated و dubiquitylated قابلة للكشف ، يوصى بتحميل ما لا يقل عن 4 ميكروغرام من الحمض النووي على الجل. ثانيا ، يمكن للمرء زيادة تركيزات الدواء للحث على مستويات أعلى من DPCs و PTMs المرتبطة بها. ثالثا ، يقترح احتضان البقع بالأجسام المضادة الأولية ليوم آخر إذا بدت العصابات / اللطاخات ضعيفة. يمكن للحضانة لمدة يومين أن تحفز الإشارة بشكل كبير وبالتالي تقلل من التباين البيولوجي من التجارب المستقلة23. يؤدي تجريد الغشاء لإعادة التلوين حتما إلى فقدان كمية معينة من أنواع DPC المترافقة PTM الموجودة بالفعل بوفرة منخفضة. لذلك ، يوصى بشدة بتشغيل مواد هلامية منفصلة للكشف عن يوبيكويتين وسومو بدلا من إعادة فحص لطخة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب غسل كريات الحمض النووي بنسبة 75٪ من الإيثانول لإزالة الحمض النووي المتبقي المحتوي على ملح الجوانيدين قبل الذوبان في H2O أو أي مذيبات أخرى ، مما يؤدي إلى تبلور العينة بعد إضافة مخزن تحميل Laemmli.

يعد سير عمل الطريقة الموصوفة أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بمقايسة ICE المرهقة ، حيث تعتمد على ترسيب الإيثانول السريع بدلا من الطرد المركزي الفائق لكلوريد السيزيوم الذي يستغرق وقتا طويلا لعزل الحمض النووي الجينومي. بسعر ، تجلب التنقية القائمة على الإيثانول كمية منخفضة من ملوثات البروتين التي عادة ما تكون ضئيلة للكشف المناعي. ومع ذلك ، عندما يتعلق الأمر بالدراسات التحليلية ، مثل التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي أو تسلسل الجيل التالي الذي يتطلب الدقة والدقة ، لا يزال الطرد المركزي المتدرج لكثافة كلوريد السيزيوم نهجا أكثر موثوقية لعزل الحمض النووي النقي عالي الوفرة. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تنميط مواقع التعديل على البروتينات المتشابكة وتحديد أنواع الارتباط من poly-ubiquitylation و poly-SUMOylation باستخدام الطرق المناسبة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

وتجدر الإشارة إلى أن هذا الفحص يسمح بتحديد وتوصيف العوامل التي تنظم PTMs لإصلاح DPCs. على سبيل المثال ، تعد طرق الفحص عالية الإنتاجية غير المتحيزة (تداخل الحمض النووي الريبي وكريسبر) أدوات قوية لاكتشاف أربطة يوبيكويتين E3 ، وأربطة SUMO E3 ، والعوامل المساعدة المرتبطة بها التي تخفف من السمية الخلوية لمحفزات DPC. تتيح الطريقة الموصوفة التحقق الجزيئي من صحة هذه البروتينات من خلال تحديد ما إذا كانت تساعد الخلايا على البقاء على قيد الحياة من محفزات DPC عن طريق إصلاح DPCs. يمكن أيضا التحقق من صحة مثبطات الجزيئات الصغيرة الجديدة التي تستهدف هذه البروتينات التي تم تحديدها ، على سبيل المثال ، عن طريق الفحص الافتراضي ، باستخدام هذا البروتوكول. بالنظر إلى أن مثبطات توبويزوميراز هي من بين أكثر العلاجات الكيميائية الموصوفة ، يمكن تطوير هذا الفحص القوي كأداة لتطوير الأدوية التي تتآزر مع مثبطات توبويزوميراز السريرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلف عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مركز المعهد الوطني للسرطان لأبحاث السرطان جائزة التميز في انتقال أبحاث ما بعد الدكتوراه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر70011069
4 & ndash ؛ 20٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصبBio-Rad4561096
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747
AcquaStain (coomassie blue)Bulldog BioAS001000
anti-dsDNA (أحادي النسيلة للفأر)Abcam271561: يوصى باستخدام 5,000
مضاد ل PAR (أحادي النسيلة للفأر)R & يوصى باستخدام أنظمةD 4335-MC-1001: 500 التخفيف
المضاد ل SUMO-1 (أحادي النسيلة للأرانبيوصى باستخدام تقنية إشارات الخلية49401: 250 التخفيف
المضاد ل SUMO-2/3 (أحادي النسيلة للأرانب)تقنية إشارات الخلية49711: يوصى بالتخفيف 250
مضاد ل TOP1 (أحادي النسيلة للفأر)يوصى باستخدام BD Biosciences5565971: 500
مضاد TOP2 & alpha ؛ (أحادي النسيلة للفأر)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-3657991: يوصى بتخفيف 250
مضاد ل TOP2 & beta ؛ (أحادي النسيلة للفأر)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-253301: يوصى بالتخفيف 250
مضاد لليوبيكويتين (أحادي النسيلة للفأر)يوصى باستخدام سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-80171: 100
كلوريد الكالسيومSigma-Aldrich499609يستخدم لهضم نوكلياز المكورات الدقيقة
CamptothecinSigma-AldrichPHL89593
نظامالتصوير ChemiDo MPBio-Rad12003154
فوسفات ثنائي الصوديومسيجماألدريتش 5438380100يستخدم لصنع عازلة فوسفات الصوديوم
DNAzolThermo Fisher10503027
DTT (dithiothreitol)Thermo FisherR0861
Dulbecco's Modified Eagle11965084Sigma-Aldrich
الإيثيلي ، 200 دليلSigma-AldrichE7023
EtoposideSigma-Aldrich1268808
الفورمالديهايدسيجما-ألدريتش47608
برنامج Graphpad PrismGraphStatsPrism 9.0.0
ماوس مرتبط ب HRP IgGCytivaNA9311: يوصى بتخفيف 5,000
Cytivaالمرتبط ب HRP1: يوصى بتخفيف 5,000
برنامج ImageJالمعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكيةImageJ 1.53e
L-GlutamineFisher Scientific25030081
أقصى حساسية ركيزة ECLThermo Fisher34095
نوكلياز المكورات الدقيقةنيو إنجلاند BioLabsM0247S
فوسفات أحادي الصوديومSigma-AldrichS3139تستخدم لصنع عازلة فوسفات الصوديوم
NanoDrop 2000 مقياس الطيفالضوئي الحراري العلميND-2000
N-ethylmaleimideThermo Fisher23030DeSUylation / deubiquitylation
مثبط غشاء النيتروسليلوز ، 0.45 & micro ؛ mBio-Rad1620115
حليب جاف خالي الدسمBio-Rad1706404XTU
PDD00017273SelleckchemS8862بولي (ADP-ribose) مثبط جليكوهيدرولاز
بنسلين ستربتومايسينثيرمو فيشر15140122
كوكتيل مثبط البروتيازThermo Fisher78430
Q700 سونيكاتورQsonicaQ700-110
طقم نقل PVDF جاهز للتجميعBio-Rad1704274
جهاز لطخة الفتحةBio-Rad1706542
ورق ترشيحBio-Rad1620161
نظام نقل توربو Trans-BlotBio-Rad Bio-Rad1704150
Tris / Glycine / SDS الرحلان الكهربائي عازلةBio-Rad1610732
Tween-20Sigma-AldrichP3179
خلية الرحلان الكهربائي العموديBio-Rad1658004
تخفيف ) تخفيف الكحول Rabbit IgG NA934

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
  3. Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
  4. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  5. Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
  6. Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
  7. Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11(2021).
  8. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  9. Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051(2020).
  10. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  11. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  12. Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  13. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
  14. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491(2016).
  15. Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318(2020).
  16. Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
  17. Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496(2019).
  18. Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
  19. Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064(2022).
  20. Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010(2021).
  21. Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837(2020).
  22. Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926(2020).
  23. Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
  24. Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569(2020).
  25. Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
  26. Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
  27. Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447(2020).
  28. Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
  29. Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
  30. Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250(2021).
  31. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).
  32. Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
  33. Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775(2022).
  34. Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924(2020).
  35. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
  36. Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161(2022).
  37. Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
  38. Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413(2021).
  39. Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
  40. Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
  41. Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080(2021).
  42. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA ADP RADAR

مقالات ذات صلة