Method Article

تقييم تأثير نظام معالج خلايا التبريد الجديد على مرفق عزل الخلايا الجزرية

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول هنا نظام معالج خلية تبريد مخصص متوافق مع غرفة الأبحاث لممارسات التصنيع الجيدة (GMP) لتحسين قابلية الخلية للمعالجة اللاحقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
نادرا ما يتم تبريد معدات العلاج الخلوي القياسية

، بما في ذلك معالج الخلايا القياسي الذهبي لتنقية الجزر البشرية للزرع السريري ، مما قد يعرض الخلايا لدرجات حرارة مرتفعة أثناء خطوة الطرد المركزي. تتمتع أنظمة التبريد المخصصة بفائدة مباشرة على جدوى الجزيرة البشرية ووظيفتها. تم تصميم الدراسة الحالية لاختبار فعالية نظام معالج الخلايا المبردة المطور حديثا والمتوفر بسهولة والذي يتطلب الحد الأدنى من التعديلات وتقييم تأثيره على بقاء الخلايا البشرية وبيئة غرف الأبحاث GMP. تم استخدام نظام التبريد ، وهو مبادل حراري مبرد ميكانيكيا عند -30 درجة مئوية لتوصيل الهواء الجاف الطبي المبرد إلى وعاء معالج الخلية من خلال ثقب محفور في غطاء جهاز الطرد المركزي. مع محدودية توافر المتبرعين بالبنكرياس في قطر ، تم التحقق من صحة النظام من خلال تنقية متدرجة الكثافة المستمرة لطبقة نفاع العظم البشري المجمعة. تم قياس العقم والاضطراب وعدد الجسيمات في بيئات الغرف النظيفة من الفئة C والفئة B. لم يتم تطوير أي اضطراب حول معالج الخلايا المبردة ، ولم يتم إنشاء جسيمات محمولة جوا زائدة تبلغ 0.5 ميكرومتر و 5 ميكرومتر وفقا لمعايير GMP لغرف الأبحاث. في بداية ونهاية خطوات التجميع ، ارتفعت درجة الحرارة على التوالي إلى 21.50 درجة مئوية ± 0.34 درجة مئوية و 21.93 درجة مئوية ± 0.20 درجة مئوية في معالج الخلية غير المبردة وإلى 10.9 درجة مئوية فقط ± 0.17 درجة مئوية و 11.16 درجة مئوية ± 0.35 درجة مئوية في معالج الخلية المبردة (ص <0.05). أدى معالج الخلية المبردة إلى تحسين الاسترداد (98٪) لجزء الخلية أحادية النواة وقابلية البقاء (100٪ ± 2٪) بعد المعالجة. يقلل نظام التبريد الجديد بشكل فعال من الحرارة التي ينتجها معالج الخلية مع عدم وجود تأثير على الجسيمات على بيئة الغرفة النظيفة GMP. معالج الخلية المبردة الموصوف هنا غير مكلف (16,000 دولار دون تضمين الضرائب والتخليص الجمركي والنقل) وطريقة طفيفة التوغل لتوفير تبريد قوي. حاليا ، يتم تطبيق هذه التقنية في منشأة العلاج بالخلايا GMP لعزل الخلايا الجزرية البشرية وزرعها للبرنامج السريري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لزرع جزيرة لمرض السكري الحاد من النوع 1 أن يعيد إفراز الأنسولين الداخلي وأصبح معيار الرعاية في عدد من البلدان< فئة الدعم = "xref">1. عزل الجزر هو إجراء متعدد الخطوات يتضمن الهضم الأنزيمي والميكانيكي الدافئ للبنكرياس ، تليها مراحل مبردة لاستعادة الأنسجة المهضومة وتنقية الجزر مع تدرجات كثافة مستمرة أو متقطعة على معالج الخلية. يبطئ التبريد السريع مرحلة الهضم الأنزيمي ويحمي الجزر الصغيرة من الإنزيمات الهاضمة المحررة عن طريق تلويث خلايا الأسينار. تم تصميم معالج الخلية في الأصل لفصل مكونات الدم الخلوي في درجة الحرارة المحيطة < فئة sup = "xref" >2. تم إعادة توجيهه لتنقية جزر البنكرياس البشرية في لانجرهانز في عام 19893. على مدى ثلاثة عقود ، تم تنقية الجزر البشرية للتجارب السريرية ، ومؤخرا ، معيار الرعاية ، إما في معالج خلوي مع تدرجات متقطعة < فئة sup = "xref" >4 أو تدرجات الكثافة المستمرة < فئة الدعم = "xref" >1 مصنوعة من صانع التدرج < فئة الدعم = "xref" >1 أو ما يعادله من خلاط يعمل بالكمبيوتر < فئة سوب = "xref" > 5 ، < sup class = "xref" >6 ، < sup class = "xref" >7. أبلغت مجموعات أخرى عن تنقية الجزر من الثدييات الكبيرة والبشر باستخدام زجاجات بلاستيكية أسطوانية كبيرة < فئة sup = "xref" >8 ، < sup class = "xref" >7 ، < sup class = "xref" >9 ، مما أدى إلى تحسين فعالية التنقية وجودة الجزر بشكل كبير.

في الواقع ، بالنظر إلى المعيار الذهبي لتنقية الجزر البشرية للزرع السريري < sup class = "xref" > 10 ، < sup class = "xref" >11 ، كان معالج الخلايا المصنعة بدون تبريد. كنتيجة مباشرة لنقص التبريد ، تعرضت الجزر الجزئية لدرجات حرارة متزايدة أثناء خطوة التنقية. أثناء الطرد المركزي ، تحدث زيادة غير منضبطة في درجة الحرارة بسبب الاحتكاك الميكانيكي للدوار < فئة sup = "xref" > 12 ، < sup class = "xref" >13. تم تكييف معالجات الخلايا مع نظام تبريد في مراكز عزل الجزر الجزرية التي زادت إحصائيا من إفراز الأنسولين الناجم عن الجلوكوز وقابلية الخلية للحياة ، مما يؤكد ميزة الحفاظ على جزر البنكرياس في درجات حرارة منخفضة أثناء إجراء التنقية< فئة الدعم = "xref">14،15.

وتجدر الإشارة إلى أنه في أواخر الثمانينيات ، تم بناء 10 نماذج أولية مبردة لتقليل تلف الجزر أثناء تنقية تدرج الكثافة ولكنها لم تحظ بمزيد من الاهتمام. استندت نماذج معالج الخلية على تبريد المغزل والوعاء باستخدام جلايكول البولي إيثيلين المبرد. على وجه الخصوص ، قد تكون حلول تنقية الجزر ، بما في ذلك محاليل الحفاظ على الأعضاء وتدرجات كثافة السكريات ، ضارة لبقاء الجزيرة عند استخدامها في درجة حرارة الغرفة أو أعلى منها< فئة sup = "xref" >16،17،18. تم تقييم مقارنة بين استراتيجيات التبريد المختلفة لمعالج الخلية لتنقية الخلايا الجزرية مقابل معالج الخلايا الأصلي غير المبرد لمكافحة الزيادة غير المنضبطة في درجة الحرارة التي تحدث بسبب احتكاك الدوار. تم إجراء عدة محاولات لتبريد معالج الخلية أثناء تنقية الجزيرة البشرية. يمكن وضع معالج الخلية بشكل مؤقت أو دائم في غرفة باردة مصممة خصيصا للحفاظ على درجة حرارة 0-8 درجة مئوية < فئة sup = "xref" >19 أثناء الطرد المركزي المتدرج المستخدم حاليا في مراكز عزل الجزر الصغيرة في جامعة إلينوي شيكاغو < فئة التوصيل = "xref">19 ، جامعة ميامي < فئة التوصيل = "xref" >14 ، مرافق جامعة أكسفورد < فئة الدعم = "xref">15، وجامعة سان فرانسيسكو (وحدة التبريد المخصصة تغلف معالج الخلية). يتضمن التعديل الآخر التبريد الأساسي لمغزل معالج الخلية مع نظام تبريد باستخدام تبريد النيتروجين السائل الذي يتم التحكم فيه إلكترونيا في جنيف والسويد وجمهورية التشيك < sup class = "xref" >15,19. كان هناك بديل آخر في منتصف عام 2000 هو التبريد الأساسي لمعالج الخلية بوحدة تكييف الهواء < فئة sup = "xref" >12 أو عن طريق التبريد السائل للعمود في جامعة ليل.

< p class = "jove_content" > تعديلات التبريد لمعالج الخلية ليست متاحة بسهولة وتأتي مع مخاطر (الرطوبة وتراكم التكثيف) داخل بيئات غرف الأبحاث GMP ، بما في ذلك فقدان الضمان ورفض المنشئ صيانة الماكينة. وبالتالي ، فإن بعض مراكز الجزر الصغيرة ، بما في ذلك ميلانو ، إيطاليا ، أوسلو ، النرويج ، وإدنبرة ، اسكتلندا ، لا تستخدم نظام تبريد لمعالجات الخلايا أثناء عملية تنقية الجزرة< فئة الدعم = "xref">15.

تم تصميم الدراسة الحالية لاختبار فعالية المبرد المطور حديثا المتاح بسهولة جنبا إلى جنب مع نظام معالج الخلية المعدل بالحد الأدنى. باختصار ، المبرد القائم على الهواء الموصوف هنا هو مبادل حراري مبرد ميكانيكيا يتحكم في درجة حرارة 1 قدم مكعب قياسي في الدقيقة (SCFM) من الغاز الجاف بين -40 درجة مئوية إلى -100 درجة مئوية. يتطلب نظام التبريد هذا إمدادات هواء طبية جافة. سوف يتدفق الهواء عبر الخط والمبادل الحراري ويخرج من خلال فوهة (7.9 مم). يوفر السخان الموجود داخل الفوهة الحرارة للتحكم في درجة حرارة تيار الهواء. تم شراء غطاء احتياطي لأجهزة الطرد المركزي البلاستيكية الصلبة ، وتم إجراء تعديلات طفيفة. تم حفر ثقب قطره 13.3 مم في الغطاء ، وتم توصيل الهواء المبرد من فوهة التبريد إلى معالج الخلية عبر الفتحة الموجودة في غطاء جهاز الطرد المركزي. تم حقن الهواء الطبي المبرد داخل وعاء الطرد المركزي لمعالج الخلية مع التحكم المستمر في درجة حرارة السوائل أو تدرجات الكثافة.

لقد قمنا بتقييم الأداء الفني لمعالج الخلية المبردة وتأثير عنصر التبريد على بيئة غرف الأبحاث GMP. كان التركيز الرئيسي هو تحقيق درجة حرارة منخفضة للغاية (<10 درجة مئوية) أثناء تنقية الجزر البشرية للحفاظ على البقاء. باستخدام فصل كثافة الطبقة المصفرة كبديل لعزل الجزر ، حددنا فعالية بروتوكول التبريد هذا على صلاحية الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول الدم الكامل المهمل غير الصالح للاستخدام وفقا لإرشادات التخلص من المؤسسة. لا تنطبق موافقة مجلس المراجعة المؤسسي والموافقة المستنيرة.

1. إعداد معالج الخلية المبردة

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات في بيئة غرفة نظيفة ، ويجب على الموظفين احترام إجراءات الملابس في الغرفة النظيفة.

  1. شراء المعدات
    1. قم بشراء غطاء زجاج شبكي احتياطي. قم بشراء نظام معدات التبريد ، والمبرد مع جهاز التحكم في درجة حرارة تيار الغاز المبرد ميكانيكيا ، ومجفف الهواء ، ومنظم الضغط والتدفق ، والضمان (اختياري). انظر جدول المواد للحصول على مراجع.
      ملاحظة: التكلفة الإجمالية 16,133 دولارا بدون رسوم شحن أو جمرك.
    2. اطلب الهواء الجاف الطبي ، وهو غاز طبي مضغوط يتوافق مع الدرجة القياسية (مرجع دستور الأدوية الأوروبي 1238) من مورد الغاز الطبي المحلي. قم بشراء 2 أسطوانات بحجم 6.8 م3 (47 طول: 23 سم × 153 سم ؛ القطر × الطول).
  2. إعداد المعدات (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 و <فئة قوية = "xfig" >الشكل 2)
    1. أدخل الجهاز في غرفة الأبحاث GMP (قم بالتطهير قبل دخول غرفة الأبحاث وفقا لإجراءات GMP).
    2. بالنسبة للهواء المضغوط من الدرجة الطبية ، قم بتركيب خط غاز بدلا من وضع أسطوانة الغاز مباشرة في غرف الأبحاث.
  3. تعديل معالج الخلية للتبريد
    1. أولا ، قم بإزالة غطاء زجاج شبكي. احتفظ بغطاء زجاج شبكي الأصلي في حالة وجود مشكلة في الضمان. قم بحفر ثقب في الغطاء الاحتياطي لمعالج الخلية بقطر يتناسب مع القطر الخارجي لطرف فوهة جهاز التبريد ويناسب ذلك لمنع تكسير غطاء جهاز الطرد المركزي (يوصى ب 13.3 مم).
    2. إصلاح الأقواس مع قطعة دائرية من الرغوة. يتم ذلك لمنع كسر و / أو خدش الغطاء ، لتثبيت فوهة التبريد في مكانها فوق معالج الخلية ، لحماية الغطاء من الانحناء المفرط بسبب الضغط العالي للهواء المحقون ، لدعم وزن الفوهة ، وأخيرا لضمان أقصى درجات الأمان للمشغل للحصول على وصول مجاني وآمن إلى جميع وظائف معالج الخلية المطلوبة أثناء الإجراء التجريبي.
    3. قم بتوصيل نظام التبريد بمعالج الخلية عن طريق توصيل فوهة التبريد بالفتحة الموجودة في زجاج شبكي. قم بتثبيته بأقواس ووسائد إسفنجية.
    4. ضع غلاف التبريد على بعد 8 أقدام (2.44 م) من الفوهة. ضع وحدة التحكم في درجة الحرارة في خزانة منفصلة وضعها على بعد 6 أقدام (1.83 م) من مبيت التبريد.
    5. اضبط نقطة ضبط المبرد على -40 درجة مئوية لتبريد تيار الهواء على المبرد. يشار إلى درجة حرارة هواء الخروج باستمرار على المؤشر الرقمي بدقة 0.1 درجة مئوية. اضبط درجة حرارة المخرج رقميا على 0.1 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم في درجة الحرارة.
    6. تحكم في الضغط ومعدل تدفق إمداد الهواء على وحدة منظم الضغط والتدفق (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2) قبل التغذية إلى المبرد. اضبطها على معدلات تدفق 55 رطل لكل بوصة مربعة و 4 SCFM ، على التوالي ، للوصول إلى الظروف المثلى على تيار هواء مبرد عند -30 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية.
    7. تحقق من تنظيم إمداد الغاز الطبي عند ضغط خارجي يبلغ 5 بار ويمكن أن يستمر لمدة 90 دقيقة على الأقل ، حيث أن هذا مطلوب للوصول إلى -30 درجة مئوية><. ملاحظة: الهواء الجاف الطبي عبارة عن غاز طبي مضغوط ، ويتوافق الهواء الجاف المضغوط بالكامل مع الدرجة القياسية.
    8. قم بتوصيل 5 بار من فوهة تبريد متصلة بغطاء معالج الخلية من خلال فتحة محفورة في غطاء جهاز الطرد المركزي. قم بحقن الهواء الطبي المبرد داخل وعاء الطرد المركزي لمعالج الخلية (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2). حدد موضع حقن الهواء بطريقة يتم فيها توجيه الهواء المبرد بشكل عمودي على حافة الألومنيوم لدوار جهاز الطرد المركزي.
    9. عند تحضير معالج الخلية ، تأكد من أن الدوار في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية). اضبط المنظم الحراري الأوتوماتيكي لنظام التبريد على -30 درجة مئوية وحقن الهواء البارد المباشر إلى الدوار.
      ملاحظة: تم اختبار ظروف تجريبية مختلفة للوصول إلى تدرج درجة الحرارة الأمثل +4 درجة مئوية ، وهو أمر ضروري للتغلب على المقاومة الحرارية لنظام فاصل خلية معالج الخلية وتسخين الدوار أثناء الطرد المركزي. سيحافظ المنظم الحراري المبرمج على درجة الحرارة المستهدفة المثلى داخل آلة معالجة الخلية أثناء الإجراء ، خاصة أثناء الطرد المركزي ، عند درجة حرارة غرفة نظيفة تبلغ +18 درجة مئوية.
      1. قم بإعداد معالج الخلية بمرحلة التبريد المسبق الأولى لتبريد المعالج (بدون مجموعة معالج الخلية) عند +3 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة ، ويجب أن تكون مرحلة التبريد المسبق الثانية لتشغيل معالج الخلية مع المجموعة المبردة مسبقا عند +4 درجة مئوية عند 134 × جم ، لمدة 5 دقائق.
< p class = "jove_title" >2. عدد الجسيمات المحمولة جوا
  1. تقييم امتثال جهاز التبريد لبيئة غرف الأبحاث GMP وفقا لمعيار ISO 14644-1 لتقييم تأثير الأجهزة الحرارية أثناء مرحلة التشغيل.
  2. استخدم مراقبة عدد الجسيمات لتقديم دليل على أن المستوى المطلوب من النظافة يتم تحقيقه في نقاط التحكم الحرجة أثناء الراحة والتشغيل.
    1. يعتمد الحد الأدنى لعدد مواقع العينات على المنطقة المقاسة. احسب هذا باستخدام المعادلة
      figure-protocol-1
      حيث A هي مساحة غرفة الأبحاث أو المساحة النظيفة التي يتم التحكم فيها بالهواء في m2 ، و NL هو عدد مواقع العينة التي تم تقريبها إلى رقم صحيح.
    2. حجم أخذ العينات المحمولة جوا هو الحد الأدنى لحجم الصوت في كل موقع. تأكد من أن حجم الهواء كبير بما يكفي لحساب 20 جسيما من أكبر حجم للجسيمات المحدد. احسب حجم أخذ العينات المحمولة جوا من خلال المعادلة
      V = 20 / C × 1000
      حيث V هو الحد الأدنى لحجم العينة الفردية لكل موقع ، معبرا عنه ب L ، و C هو حد الفئة (عدد الجسيمات / م3).
    3. لكل موقع ، اعتمادا على المنطقة ، استخدم عينة واحدة أو أكثر. تأكد من أن أقل حجم يتم أخذ عينات منه في كل موقع هو 2 لتر وأن الحد الأدنى لوقت العينة لا يقل عن 1 دقيقة.
  3. قبل أخذ العينات ، قم بتطهير جهاز عداد الجسيمات باستخدام مرشح تطهير. قم بإزالة الفلتر وضعه مع مسبار متساوي الحركة لأخذ العينات.
  4. ضع أداة عداد الجسيمات في موقع أخذ العينات المحدد. ابدأ جمع العينات من الشاشة الرئيسية لجهاز عداد الجسيمات.
  5. بمجرد انتهاء أخذ العينات ، خذ جهاز عداد الجسيمات إلى الموقع التالي. عند الانتهاء من جميع مواقع أخذ العينات، راجع البيانات واطبع تقريرا.
  6. عندما ينخفض متوسط تركيز الجسيمات لجميع نقاط أخذ العينات في المنطقة إلى ما دون حد الفئة المذكور في الجدول 1 ، ضع في اعتبارك المساحة التي تم تمريرها للحصول على تركيز الجسيمات المسموح به.
< p class = "jove_title" >3. تحضير التدرج ومعالجة فصل الخلايا
  1. قبل التجربة ، قم بتبريد تدرجات الكثافة الخفيفة والثقيلة ومجموعات معالج الخلية طوال الليل عند +4 درجة مئوية في الثلاجة.
  2. قم بتبريد معالج الخلية مسبقا لمدة 45 دقيقة في حالة السكون (أي قم بتشغيل معالج الخلية قبل الاستخدام). حافظ على درجة الحرارة بين +2 درجة مئوية و +5 درجة مئوية. أدخل مجموعة معالج الخلية المبردة مسبقا عند +4 درجة مئوية.
  3. لصانع التدرج القياسي المبرد بالإيثانول المزدوج (اختياري ؛ <فئة قوية = "xfig" >الشكل 3) قم بتوصيل 2 غرف زجاجية وضعها على محرك مغناطيسي. المشبك الأنبوب بين 2 غرف. قم بتبريد صانع التدرج باستخدام مبرد تبريد متداول بالإيثانول عند 0 درجة مئوية.
  4. أولا ، استعد لتحميل الطبقة الثقيلة في الجزء السفلي من الكيس عن طريق ملء الغرفة ب 130 مل من تدرج الكثافة الثقيلة (HD ؛ 1.087 جم / مل). التحميل بسرعة مضخة 150 مل / دقيقة.
  5. بمجرد أن يكون التدرج الثقيل في الكيس ، أضف 130 مل من الكثافة العالية (HD) إلى الدورق الأمامي و 140 مل من التدرجات منخفضة الكثافة (LD ؛ 1.063 جم / مل) إلى الخلف (المشبك مغلق).
  6. قم بفك المشبك من المرقئ / المشبك بين الغرفتين وإنشاء تدرج مستمر بسرعة المضخة 50 مل / دقيقة.
  7. قم بإعداد خلايا معطف مصفرة بشرية أحادية النواة مسبقا لتنقيتها من العديد من المعاطف المصنوعة من معاطف بافي مجهولة المصدر التي تم جمعها من فضلات الدم الكاملة (تمت إضافة 40 مل إلى 60 مل من الدم الكامل إلى 10 أكياس معطف مصفر) اعتمادا على التوافر من بنك الدم.
      فصل
    1. MNC
      1. استخدم الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا البشرية أحادية النواة منخفضة الكثافة. للقيام بذلك ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
      2. لتحضير الخلية ، احسب حجم الدم (الدم الكامل المضاد للتخثر أو معطف بافي معلق). خفف الدم بمحلول عازلة 2x-4x عن طريق خلط الانعكاس. كلما كان الدم مخففا ، كان نقاء الخلايا أحادية النواة أفضل.
      3. تحضير المخزن المؤقت عن طريق خلط عازلة الفوسفات مع مضاد للتخثر. احسب عدد الأنابيب المطلوبة بقسمة حجم الدم على 35 مل وصب 15 مل من محلول التدرج بكثافة 1.073 في كل أنبوب.
      4. ضع طبقة تدريجية من 35 مل من معلق الدم المخفف فوق تدرج الكثافة عن طريق الجري برفق على سطح تدرج الكثافة باستخدام حقنة 60 مل متصلة بإبرة؛ بالنسبة للأحجام الصغيرة، استخدم ماصة. حاول ألا تعطل الواجهة ، لأن هذا سيؤدي إلى طبقة أحادية النواة ضعيفة.
      5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية دون أي فواصل (التسارع 0 ، التباطؤ 0). بعد الطرد المركزي ، قم بحصاد طبقة واجهة الخلايا أحادية النواة برفق باستخدام ماصة نقل معقمة. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد آخر سعة 50 مل.
      6. اغسل الخلايا 2x مع المخزن المؤقت (PBS مع مضاد التخثر المضاف). للغسيل الأول ، املأ الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بمخزن مؤقت حتى 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لخلايا الحبيبات (التسارع 9 ، التباطؤ 0). قم بإزالة جميع المواد الطفية برفق بعناية.
      7. قم بإجراء الغسيل الثاني لإزالة الصفائح الدموية. أعد تعليق الحبيبات إلى حجم 50 مل مع المخزن المؤقت. جهاز طرد مركزي عند 200-300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية (التسارع 9 ، التباطؤ 0).
      8. أعد تكوين الخلايا إلى حجم نهائي قدره 5 مل ، يجب أن يكون لهذه الخلايا ثقل نوعي يشبه MNC منخفض الكثافة <1.073. قم بقياس الكثافة المحددة للتدرج باستخدام مقياس الكثافة.
      9. أعد تعليق الحبيبات إلى حجم نهائي قدره 100 مل مع 95 مل من وسط التدرج عالي الكثافة (1.083 جم / مل) في كيس النقل. استخدم هذا المنتج للتنقية باستخدام فاصل الخلايا. يحتوي الحجم النهائي البالغ 100 مل على خلايا و 1.083 وسط تدرج عالي الكثافة.
        ملاحظة: يمكن تخزين الطبقة المصفرة في الثلاجة طوال الليل في PBS التي تحتوي على 0.5٪ BSA أو بلازما ذاتية المنشأ. يمكن أيضا غسل المعطف المصفر.
  8. قم بالتحميل العلوي للتدرجات المشكلة مسبقا بحد أقصى 30 مل من MNC المعزولة من الطبقة المصقولة المعلقة في 100 مل من وسط الحفظ المركز باستخدام مضخة تمعجية عند 25 مل / دقيقة.
  9. قم بقياس درجة الحرارة داخل معالج الخلية باستمرار باستخدام مسبار حراري معاير مسبقا. باستخدام مزدوج حراري رقمي متصل بمسبار حراري معقم ، راقب درجة حرارة التدرجات والخلايا أثناء العملية.

4. تحسين الخطوات المختلفة لتحميل التدرج

  1. أدخل مجموعة معالج الخلية المبردة مسبقا عند +4 درجة مئوية. قم بتحميل التدرج الثقيل (130 مل) عند + 4.5 درجة مئوية. في نهاية تحميل التدرج ، اضبط جهاز الطرد المركزي بسرعة منخفضة نسبيا (537 × جم) لتقليل الحرارة الناتجة عن الدوار.
  2. قم بإيقاف تشغيل المعالج الخلوي للسماح للنظام الهيدروليكي بالعودة إلى مستويات ما قبل التشغيل وتحرير الهواء.
  3. أعد تشغيل معالج الخلية عند 537 × جم وأضف تدرجات الكثافة الثقيلة (130 مل) ومنخفضة (140 مل) لإنشاء تدرج كثافة مستمر عند +4.3 درجة مئوية ومعدل تدفق 50 مل / دقيقة.
  4. قم بتحميل الطبقة المصفرية (30 مل) ب 100 مل من وسط التخزين البارد عند +6 درجة مئوية ومعدل تدفق 25 مل / دقيقة. أضف 50 مل (25 مل × 2) من محلول الغسيل.
  5. بعد 5 دقائق عند +5 درجة مئوية ، اجمع التدرج المغزول في 12 زجاجة بمعدل تدفق 100 مل / دقيقة.
  6. املأ الأنابيب بوسائط الغسيل (M199 + 20٪ ألبومين بشري + 10٪ بنسلين ستربتومايسين). املأ الأنبوب 1 ب 100 مل من وسائط الغسيل و 150 مل من الخلايا والأنابيب 2-12 ب 225 مل من وسائط الغسيل و 25 مل من الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحديد تأثير معالج الخلية المبردة على غرفة الأبحاث GMP لأول مرة. استخدمت الطرق الموحدة عداد الجسيمات الذي يقيس تلوث الجسيمات المحمولة جوا في بيئة غرفة نظيفة من الفئة C والفئة B من GMP في النقاط الحرجة بالقرب من معالج الخلية ونظام تبريد الهواء المضغوط. أظهرت النتائج أنه لم يحدث اضطراب حول المعدات. أظهرت البيانات المسجلة أنه لم يكن هناك فائض من الجسيمات المحمولة جوا 0.5 ميكرومتر و 5 ميكرومتر وفقا لمعايير GMP من الدرجة C والدرجة B و BSL III (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتمدت مرافق عزل الجزر في جميع أنحاء العالم لعقود من الزمن تنقية الجزر البشرية في معالج خلوي معاد استخدامه. على الرغم من أن بعض مرافق إنتاج الجزر تستمر في معالجة الجزر الصغيرة في معالج خلوي غير مبرد ، إلا أن معظم المراكز تستخدم نسخة مبردة من معالج الخلية10،11،15. تقوم المراكز إما بوضع معالج الخلية في غرفة باردة لها عيب كبير يتمثل في التعرض للرطوبة والتكثيف ، أو تقوم تقنيا بإجراء تعديلات كبيرة على معالج الخلية نفسه ، بما في ذلك ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للمعهد الأوروبي لعلم الجينوم للسكري (ANR-10- LABEX-0046 to FP) ومعهد قطر لعملية التمثيل الغذائي - مؤسسة حمد الطبية ، قطر. يشكر المؤلفون أيضا مركز البحوث الطبية في مؤسسة حمد الطبية على دعم رسوم معالجة المقالات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>المعدات< / قوي>
عداد جزيئات الهواءLasair III & nbsp ؛
AirJet XR40  SP ScientificFTS system XR40
خزانة السلامةالحيوية الحرارية العلميةEQ-1301
مبرد التبريد الدائريJulaboCF30
COBE 2991   ؛Terumo BCT
BiorepCCT-01
صانع التدرج المزدوج المغلف  حسب الطلب في المنزل
KJT-Thermocouple ThermometerHanna InstrumentsHI93551Nلقياس درجة حرارة السوائل
المحرك المغناطيسي   ؛88880014العلمية الحرارية
 ميزان حرارة MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430لدرجة حرارة COBE
بدون ماء حبة حمامكول بارمر10122-00
المواد والكواشف< / قوي >
BD طقم تعداد الخلايا الجذعيةBD Biosciences 344563
طقم أنابيب COBE 2911Terumo BCT90819
أنابيب مخروطية 250 ملكورنينج430776
كثافة التدرج 1.1Biochrom   ؛L6155
زجاجات متدرجة يمكن التخلصمنها Thermo fisher382019-1000
ألبومين بشري 20٪   ؛كيدريون بيوفارما 8091600
M199 محلول الغسيل كورنينج 99-784-CM 
أنابيب MasterflexMasterflex96400-6
Medical Dry AirLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-Streptomycin Gibco 15140122
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan blue  سيجما ألدريتش15250061
جامعة ويسكونسن بيلزر (UW)  جسر الحياة RM / N 4055وسط الحفظ
علبة تبريد مخروطية المضخة التمعجية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Islet Cell IsolationCooled Cell ProcessorDensity Gradient PurificationHuman Islet ViabilityCell Therapy EquipmentCleanroom GMP StandardsMononuclear Cell FractionCentrifugation StepAirborne Particle AssessmentCell Viability Measurement

Related Articles