يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم تأثير نظام معالج خلايا التبريد الجديد على مرفق عزل الخلايا الجزرية

782 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65321

⸱

أغسطس 11, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول هنا نظام معالج خلية تبريد مخصص متوافق مع غرفة الأبحاث لممارسات التصنيع الجيدة (GMP) لتحسين قابلية الخلية للمعالجة اللاحقة.

الملخص

نادرا ما يتم تبريد معدات العلاج الخلوي القياسية

، بما في ذلك معالج الخلايا القياسي الذهبي لتنقية الجزر البشرية للزرع السريري ، مما قد يعرض الخلايا لدرجات حرارة مرتفعة أثناء خطوة الطرد المركزي. تتمتع أنظمة التبريد المخصصة بفائدة مباشرة على جدوى الجزيرة البشرية ووظيفتها. تم تصميم الدراسة الحالية لاختبار فعالية نظام معالج الخلايا المبردة المطور حديثا والمتوفر بسهولة والذي يتطلب الحد الأدنى من التعديلات وتقييم تأثيره على بقاء الخلايا البشرية وبيئة غرف الأبحاث GMP. تم استخدام نظام التبريد ، وهو مبادل حراري مبرد ميكانيكيا عند -30 درجة مئوية لتوصيل الهواء الجاف الطبي المبرد إلى وعاء معالج الخلية من خلال ثقب محفور في غطاء جهاز الطرد المركزي. مع محدودية توافر المتبرعين بالبنكرياس في قطر ، تم التحقق من صحة النظام من خلال تنقية متدرجة الكثافة المستمرة لطبقة نفاع العظم البشري المجمعة. تم قياس العقم والاضطراب وعدد الجسيمات في بيئات الغرف النظيفة من الفئة C والفئة B. لم يتم تطوير أي اضطراب حول معالج الخلايا المبردة ، ولم يتم إنشاء جسيمات محمولة جوا زائدة تبلغ 0.5 ميكرومتر و 5 ميكرومتر وفقا لمعايير GMP لغرف الأبحاث. في بداية ونهاية خطوات التجميع ، ارتفعت درجة الحرارة على التوالي إلى 21.50 درجة مئوية ± 0.34 درجة مئوية و 21.93 درجة مئوية ± 0.20 درجة مئوية في معالج الخلية غير المبردة وإلى 10.9 درجة مئوية فقط ± 0.17 درجة مئوية و 11.16 درجة مئوية ± 0.35 درجة مئوية في معالج الخلية المبردة (ص <0.05). أدى معالج الخلية المبردة إلى تحسين الاسترداد (98٪) لجزء الخلية أحادية النواة وقابلية البقاء (100٪ ± 2٪) بعد المعالجة. يقلل نظام التبريد الجديد بشكل فعال من الحرارة التي ينتجها معالج الخلية مع عدم وجود تأثير على الجسيمات على بيئة الغرفة النظيفة GMP. معالج الخلية المبردة الموصوف هنا غير مكلف (16,000 دولار دون تضمين الضرائب والتخليص الجمركي والنقل) وطريقة طفيفة التوغل لتوفير تبريد قوي. حاليا ، يتم تطبيق هذه التقنية في منشأة العلاج بالخلايا GMP لعزل الخلايا الجزرية البشرية وزرعها للبرنامج السريري.

المقدمة

يمكن لزرع جزيرة لمرض السكري الحاد من النوع 1 أن يعيد إفراز الأنسولين الداخلي وأصبح معيار الرعاية في عدد من البلدان< فئة الدعم = "xref">1. عزل الجزر هو إجراء متعدد الخطوات يتضمن الهضم الأنزيمي والميكانيكي الدافئ للبنكرياس ، تليها مراحل مبردة لاستعادة الأنسجة المهضومة وتنقية الجزر مع تدرجات كثافة مستمرة أو متقطعة على معالج الخلية. يبطئ التبريد السريع مرحلة الهضم الأنزيمي ويحمي الجزر الصغيرة من الإنزيمات الهاضمة المحررة عن طريق تلويث خلايا الأسينار. تم تصميم معالج الخلية في الأصل لفصل مكونات الدم الخلوي في درجة الحرارة المحيطة < فئة sup = "xref" >2. تم إعادة توجيهه لتنقية جزر البنكرياس البشرية في لانجرهانز في عام 19893. على مدى ثلاثة عقود ، تم تنقية الجزر البشرية للتجارب السريرية ، ومؤخرا ، معيار الرعاية ، إما في معالج خلوي مع تدرجات متقطعة < فئة sup = "xref" >4 أو تدرجات الكثافة المستمرة < فئة الدعم = "xref" >1 مصنوعة من صانع التدرج < فئة الدعم = "xref" >1 أو ما يعادله من خلاط يعمل بالكمبيوتر < فئة سوب = "xref" > 5 ، < sup class = "xref" >6 ، < sup class = "xref" >7. أبلغت مجموعات أخرى عن تنقية الجزر من الثدييات الكبيرة والبشر باستخدام زجاجات بلاستيكية أسطوانية كبيرة < فئة sup = "xref" >8 ، < sup class = "xref" >7 ، < sup class = "xref" >9 ، مما أدى إلى تحسين فعالية التنقية وجودة الجزر بشكل كبير.

في الواقع ، بالنظر إلى المعيار الذهبي لتنقية الجزر البشرية للزرع السريري < sup class = "xref" > 10 ، < sup class = "xref" >11 ، كان معالج الخلايا المصنعة بدون تبريد. كنتيجة مباشرة لنقص التبريد ، تعرضت الجزر الجزئية لدرجات حرارة متزايدة أثناء خطوة التنقية. أثناء الطرد المركزي ، تحدث زيادة غير منضبطة في درجة الحرارة بسبب الاحتكاك الميكانيكي للدوار < فئة sup = "xref" > 12 ، < sup class = "xref" >13. تم تكييف معالجات الخلايا مع نظام تبريد في مراكز عزل الجزر الجزرية التي زادت إحصائيا من إفراز الأنسولين الناجم عن الجلوكوز وقابلية الخلية للحياة ، مما يؤكد ميزة الحفاظ على جزر البنكرياس في درجات حرارة منخفضة أثناء إجراء التنقية< فئة الدعم = "xref">14،15.

وتجدر الإشارة إلى أنه في أواخر الثمانينيات ، تم بناء 10 نماذج أولية مبردة لتقليل تلف الجزر أثناء تنقية تدرج الكثافة ولكنها لم تحظ بمزيد من الاهتمام. استندت نماذج معالج الخلية على تبريد المغزل والوعاء باستخدام جلايكول البولي إيثيلين المبرد. على وجه الخصوص ، قد تكون حلول تنقية الجزر ، بما في ذلك محاليل الحفاظ على الأعضاء وتدرجات كثافة السكريات ، ضارة لبقاء الجزيرة عند استخدامها في درجة حرارة الغرفة أو أعلى منها< فئة sup = "xref" >16،17،18. تم تقييم مقارنة بين استراتيجيات التبريد المختلفة لمعالج الخلية لتنقية الخلايا الجزرية مقابل معالج الخلايا الأصلي غير المبرد لمكافحة الزيادة غير المنضبطة في درجة الحرارة التي تحدث بسبب احتكاك الدوار. تم إجراء عدة محاولات لتبريد معالج الخلية أثناء تنقية الجزيرة البشرية. يمكن وضع معالج الخلية بشكل مؤقت أو دائم في غرفة باردة مصممة خصيصا للحفاظ على درجة حرارة 0-8 درجة مئوية < فئة sup = "xref" >19 أثناء الطرد المركزي المتدرج المستخدم حاليا في مراكز عزل الجزر الصغيرة في جامعة إلينوي شيكاغو < فئة التوصيل = "xref">19 ، جامعة ميامي < فئة التوصيل = "xref" >14 ، مرافق جامعة أكسفورد < فئة الدعم = "xref">15، وجامعة سان فرانسيسكو (وحدة التبريد المخصصة تغلف معالج الخلية). يتضمن التعديل الآخر التبريد الأساسي لمغزل معالج الخلية مع نظام تبريد باستخدام تبريد النيتروجين السائل الذي يتم التحكم فيه إلكترونيا في جنيف والسويد وجمهورية التشيك < sup class = "xref" >15,19. كان هناك بديل آخر في منتصف عام 2000 هو التبريد الأساسي لمعالج الخلية بوحدة تكييف الهواء < فئة sup = "xref" >12 أو عن طريق التبريد السائل للعمود في جامعة ليل.

< p class = "jove_content" > تعديلات التبريد لمعالج الخلية ليست متاحة بسهولة وتأتي مع مخاطر (الرطوبة وتراكم التكثيف) داخل بيئات غرف الأبحاث GMP ، بما في ذلك فقدان الضمان ورفض المنشئ صيانة الماكينة. وبالتالي ، فإن بعض مراكز الجزر الصغيرة ، بما في ذلك ميلانو ، إيطاليا ، أوسلو ، النرويج ، وإدنبرة ، اسكتلندا ، لا تستخدم نظام تبريد لمعالجات الخلايا أثناء عملية تنقية الجزرة< فئة الدعم = "xref">15.

تم تصميم الدراسة الحالية لاختبار فعالية المبرد المطور حديثا المتاح بسهولة جنبا إلى جنب مع نظام معالج الخلية المعدل بالحد الأدنى. باختصار ، المبرد القائم على الهواء الموصوف هنا هو مبادل حراري مبرد ميكانيكيا يتحكم في درجة حرارة 1 قدم مكعب قياسي في الدقيقة (SCFM) من الغاز الجاف بين -40 درجة مئوية إلى -100 درجة مئوية. يتطلب نظام التبريد هذا إمدادات هواء طبية جافة. سوف يتدفق الهواء عبر الخط والمبادل الحراري ويخرج من خلال فوهة (7.9 مم). يوفر السخان الموجود داخل الفوهة الحرارة للتحكم في درجة حرارة تيار الهواء. تم شراء غطاء احتياطي لأجهزة الطرد المركزي البلاستيكية الصلبة ، وتم إجراء تعديلات طفيفة. تم حفر ثقب قطره 13.3 مم في الغطاء ، وتم توصيل الهواء المبرد من فوهة التبريد إلى معالج الخلية عبر الفتحة الموجودة في غطاء جهاز الطرد المركزي. تم حقن الهواء الطبي المبرد داخل وعاء الطرد المركزي لمعالج الخلية مع التحكم المستمر في درجة حرارة السوائل أو تدرجات الكثافة.

لقد قمنا بتقييم الأداء الفني لمعالج الخلية المبردة وتأثير عنصر التبريد على بيئة غرف الأبحاث GMP. كان التركيز الرئيسي هو تحقيق درجة حرارة منخفضة للغاية (<10 درجة مئوية) أثناء تنقية الجزر البشرية للحفاظ على البقاء. باستخدام فصل كثافة الطبقة المصفرة كبديل لعزل الجزر ، حددنا فعالية بروتوكول التبريد هذا على صلاحية الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استخدم هذا البروتوكول دماً كاملاً مُستبعداً غير صالح للاستخدام وفقاً لإرشادات الاستبعاد الخاصة بالمؤسسة. كما أن موافقة مجلس مراجعة المؤسسات (IRB) والموافقة المستنيرة غير مطلبتين في هذه الحالة.

1. إعداد معالج الخلايا المبرد

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة غرفة نظيفة، ويجب على الموظفين الالتزام بإجراءات ارتداء ملابس الغرف النظيفة.

  1. شراء المعدات
    1. قم بشراء غطاء احتياطي من البلكسي جلاس. قم بشراء نظام معدات التبريد، والمبرد المزود بجهاز تحكم في درجة حرارة تيار الغاز المبرد ميكانيكياً، ومجفف الهواء، ومنظم الضغط والتدفق، والضمان (اختياري). انظر جدول المواد للمراجع.
      ملاحظة: التكلفة الإجمالية هي 16,133 دولاراً بدون رسوم الشحن أو الجمارك.
    2. اطلب هواءً طبياً جافاً، وهو غاز طبي مضغوط يتوافق مع الدرجة القياسية (مرجع دستور الأدوية الأوروبي 1238)، من مورد الغازات الطبية المحلي. قم بشراء أسطوانتين سعة كل منهما 6.8 m3 (٤٧ لتر: ٢٣ سم × ١٥٣ سم؛ القطر × الطول).
  2. إعداد الأجهزة (الشكل 1 و الشكل 2)
    1. أدخل المعدات إلى الغرفة النظيفة المعتمدة وفق ممارسات التصنيع الجيدة (يجب التطهير قبل دخول الغرفة النظيفة وفقاً لإجراءات ممارسات التصنيع الجيدة GMP).
    2. بالنسبة للهواء المضغوط ذي الدرجة الطبية، قم بتركيب خط غاز بدلاً من وضع أسطوانة الغاز مباشرة داخل الغرفة النظيفة.
  3. تعديل معالج الخلايا لأغراض التبريد
    1. أولاً، قم بإزالة غطاء البليكسي جلاس. احتفظ بغطاء البليكسي جلاس الأصلي في حال حدوث مشكلة تتعلق بالضمان. قم بحفر ثقب في الغطاء الاحتياطي لمعالج الخلايا بقطر يتناسب مع القطر الخارجي لطرف فوهة جهاز التبريد لمنع تشقق غطاء جهاز الطرد المركزي (يُوصى بقطر 13.3 ملم).
    2. ثبّت الدعامات معاً باستخدام قطعة دائرية من الفوم. يتم ذلك لمنع كسر الغطاء و/أو خدشه، ولتثبيت فوهة المبرد في مكانها فوق معالج الخلايا، ولحماية الغطاء من الانثناء المفرط الناتج عن الضغط العالي للهواء المحقون، ولدعم وزن الفوهة، وأخيراً لضمان أقصى درجات السلامة للمشغل من خلال إتاحة وصول حر وآمن إلى جميع وظائف معالج الخلايا المطلوبة أثناء الإجراء التجريبي.
    3. قم بتوصيل نظام التبريد بمعالج الخلايا عن طريق تركيب فوهة التبريد في الفتحة الموجودة في البلكسي جلاس، ثم ثبتها باستخدام الدعامات والوسائد الرغوية.
    4. ضع غلاف التبريد على مسافة تصل إلى 8 أقدام (2.44 م) من الفوهة. ضع وحدة التحكم في درجة الحرارة في خزانة منفصلة على مسافة لا تتجاوز 6 أقدام (1.83 م) من غلاف التبريد.
    5. اضبط نقطة ضبط المبرد عند -40 °C لتبريد تيار الهواء في المبرد. ويتم عرض درجة حرارة الهواء الخارج باستمرار على المؤشر الرقمي بدقة تصل إلى 0.1 °Cاضبط درجة حرارة المخرج رقمياً على 0.1 °C باستخدام جهاز التحكم في درجة الحرارة.
    6. تحكم في الضغط ومعدل تدفق إمدادات الهواء في وحدة تنظيم الضغط والتدفق (الشكل 2) قبل التغذية إلى المبرد. اضبطها على 55 psi ومعدلات تدفق 4 SCFM، على التوالي، للوصول إلى الظروف المثلى لتيار هوائي مبرد عند -30 °C ± 2 °C.
    7. تحقق من أن إمدادات الغاز الطبي تنظم عند ضغط مخرج يبلغ 5 بار، وبإمكانها الاستمرار لمدة 90 دقيقة على الأقل، حيث إن ذلك مطلوب لكي يصل الهواء المضغوط إلى -30 °C.
      ​ملاحظة: الهواء الطبي الجاف هو غاز طبي مضغوط، ويتوافق الهواء الجاف المضغوط بالكامل مع الدرجة القياسية.
    8. قم بتوصيل ضغط قدره 5 بار من فوهة مبردة متصلة بغطاء معالج الخلايا عبر ثقب محفور في غطاء جهاز الطرد المركزي. احقن الهواء الطبي المبرد داخل وعاء الطرد المركزي الخاص بمعالج الخلايا (الشكل 2حدد موضع حقن الهواء بحيث يتم توجيه الهواء المبرد بشكل عمودي على الحافة الألومنيومية لدوار جهاز الطرد المركزي.
    9. عند تحضير معالج الخلايا، تأكد من أن الدوار في درجة حرارة الغرفة (18 °C). اضبط منظم الحرارة التلقائي لنظام التبريد على -30 °C وتوجيه حقنات الهواء المبرد مباشرة إلى الدوار.
      ملاحظة: تم اختبار ظروف تجريبية مختلفة للوصول إلى تدرج حراري أمثل يبلغ +4 °C، وهو أمر ضروري للتغلب على المقاومة الحرارية لنظام فاصل الخلايا في معالج الخلايا وارتفاع درجة حرارة الدوّار أثناء الطرد المركزي. وسيعمل المنظم الحراري المبرمج على الحفاظ على درجة الحرارة المستهدفة المثلى داخل جهاز معالجة الخلايا أثناء الإجراء، ولا سيما أثناء عملية الطرد المركزي، وذلك في درجة حرارة غرفة نظيفة تبلغ +18 °C.
      1. قم بإعداد معالج الخلايا مع ضبط مرحلة التبريد المسبق الأولى لتبريد المعالج (بدون طقم معالج الخلايا) عند درجة حرارة +3 °C لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة، ويجب أن تكون مرحلة التبريد المسبق الثانية عند تشغيل معالج الخلايا بينما تكون المجموعة مبردة مسبقاً عند +4 °C عند تكبير 134x جرام، لمدة 5 دقائق.

2. تعداد الجسيمات المحمولة جواً

  1. تقييم مدى امتثال جهاز التبريد لبيئة الغرف النظيفة وفق ممارسات التصنيع الجيد (GMP) طبقاً لمعيار ISO 14644-1، وذلك لتقييم تأثير أجهزة الحرارة خلال مرحلة التشغيل.
  2. استخدم مراقبة عدد الجزيئات لتقديم دليل على تحقيق مستوى النظافة المطلوب في نقاط التحكم الحرجة في حالتي السكون والتشغيل.
    1. يعتمد الحد الأدنى لعدد مواقع العينات على المساحة المقاسة. احسب ذلك باستخدام المعادلة التالية
      figure-protocol-1
      ​حيث A هي مساحة الغرفة النظيفة أو المساحة ذات الهواء النظيف الخاضع للتحكم بالمتر المربع (m²)2، وNL هو عدد مواقع العينات مقرباً إلى أقرب عدد صحيح.
    2. يمثل حجم العينات المحمولة جواً الحد الأدنى للحجم عند كل موقع. تأكد من أن حجم الهواء كبير بما يكفي لإحصاء 20 جسيماً من أكبر حجم جسيم محدد. احسب حجم العينات المحمولة جواً من خلال المعادلة التالية
      V= 20/C x 1000
      حيث تمثل V الحد الأدنى لحجم العينة الواحدة لكل موقع، ويُعبر عنها باللتر (L)، وتمثل C حد الفئة (عدد الجسيمات/م3)3).
    3. استخدم عينة واحدة أو أكثر لكل موقع، وذلك حسب المساحة. تأكد من أن أقل حجم عينة يتم سحبه من كل موقع هو 2 لتر، وألا تقل المدة الدنيا لأخذ العينة عن دقيقة واحدة.
  3. قبل أخذ العينات، قم بتطهير جهاز عد الجسيمات باستخدام مرشح تطهير. أزل المرشح وضعه مع المسبار متساوي الحركة (isokinetic probe) لأخذ العينات.
  4. ضع جهاز عد الجسيمات في موقع أخذ العينات المحدد. ابدأ عملية جمع العينات من الشاشة الرئيسية لجهاز عد الجسيمات.
  5. بمجرد انتهاء عملية أخذ العينات، انقل جهاز عد الجسيمات إلى الموقع التالي. وعند الانتهاء من جميع مواقع أخذ العينات، راجع البيانات واطبع تقريراً.
  6. عندما ينخفض متوسط تركيز الجسيمات لجميع نقاط أخذ العينات في المنطقة عن حد الفئة المذكور في جدول 1، تُعتبر الغرفة مجتازة لكونها ضمن تركيز الجسيمات المسموح به.

3. تحضير التدرج ومعالجة فصل الخلايا

  1. قبل البدء بالتجربة، يتم تبريد متدرجات الكثافة الخفيفة والثقيلة وأطقم معالج الخلايا مسبقاً طوال الليل عند +4 °C في الثلاجة.
  2. يُبرد معالج الخلايا مسبقاً لمدة 45 دقيقة في وضع السكون (أي تشغيل معالج الخلايا قبل الاستخدام). يتم الحفاظ على درجة الحرارة بين +2 °C و +5 °C. ثم يتم إدخال طقم معالج الخلايا المبرد مسبقاً عند +4 °C.
  3. بالنسبة لصانع المتدرجات ذي الغلاف المزدوج المبرد بالإيثانول القياسي (اختياري؛ الشكل 3)، يتم توصيل الغرفتين الزجاجيتين ووضعهما على محرك مغناطيسي. تُثبت الأنابيب بين الغرفتين بواسطة مشبك. يُبرد صانع المتدرجات باستخدام مبرد تدوير الإيثانول عند 0 °C.
  4. أولاً، يتم التحضير لتحميل الطبقة الثقيلة في قاع الكيس عن طريق ملء الغرفة بـ 130 mL من متدرج الكثافة الثقيلة (HD; 1.087 g/mL). يتم التحميل بسرعة مضخة تبلغ 150 mL/min.
  5. بمجرد وجود المتدرج الثقيل في الكيس، يُضاف 130 mL من الكثافة العالية (HD) إلى البيكر الأمامي و 140 mL من متدرجات الكثافة المنخفضة (LD; 1.063 g/mL) إلى الخلفي (مع إبقاء المشبك مغلقاً).
  6. يتم فك الملقط/المشبك بين الغرفتين وإنشاء متدرج مستمر بسرعة مضخة تبلغ 50 mL/min.
  7. يتم تحضير خلايا طبقة الغباء (buffy coat) أحادية النواة البشرية مسبقاً للتنقية من عدة طبقات غباء مجمعة ومجهولة المصدر، جُمعت من نفايات الدم الكامل (أُضيف 40 mL إلى 60 mL من الدم الكامل إلى 10 أكياس من طبقة الغباء) وذلك حسب توفرها من بنك الدم.
    1. فصل الخلايا أحادية النواة (MNC Separation)
      1. يُستخدم الطرد المركزي بالتدرج الكثافي لعزل الخلايا أحادية النواة البشرية منخفضة الكثافة. وللقيام بذلك، تتبع الخطوات الموضحة أدناه.
      2. لتحضير الخلايا، يتم حساب حجم الدم (دم كامل مميع أو طبقة غباء معلقة). يُخفف الدم بمحلول منظم (buffer) بنسبة 2x-4x عن طريق الخلط بالقلب. كلما كان الدم أكثر تخفيفاً، كانت نقاوة الخلايا أحادية النواة أفضل.
      3. يُحضر المحلول المنظم بخلط محلول الفوسفات المنظم مع مادة مضادة للتخثر. يُحسب عدد الأنابيب المطلوبة بقسمة حجم الدم على 35 mL، ويُصب 15 mL من محلول متدرج الكثافة 1.073 في كل أنبوب.
      4. تُوضع 35 mL من معلق الدم المخفف تدريجياً كطبقة فوق متدرج الكثافة عن طريق تمريرها بلطف على سطح متدرج الكثافة باستخدام حقنة سعة 60 mL متصلة بإبرة؛ وبالنسبة للأحجام الصغيرة، تُستخدم الماصة. يجب تجنب تعكير الواجهة البينية، لأن ذلك سيؤدي إلى الحصول على طبقة ضعيفة من الخلايا أحادية النواة.
      5. يُجرى الطرد المركزي عند 400 x g لمدة 20 min عند 20 °C دون أي توقف (التسارع 0، التباطؤ 0). بعد الطرد المركزي، تُجمع الطبقة البينية من الخلايا أحادية النواة بلطف باستخدام ماصة نقل معقمة. تُنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 mL.
      6. تُغسل الخلايا مرتين بالمحلول المنظم (PBS مضاف إليه مادة مضادة للتخثر). في الغسلة الأولى، يُملأ الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بالمحلول المنظم حتى 50 mL. يُجرى الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 10 min عند 20 °C لترسيب الخلايا (التسارع 9، التباطؤ 0). يُزال جميع السائل الطافي بعناية وببطء.
      7. تُجرى الغسلة الثانية لإزالة الصفائح الدموية. يُعاد تعليق الراسب إلى حجم 50 mL باستخدام المحلول المنظم. يُجرى الطرد المركزي عند 200-300 x g لمدة 10 min عند 20 °C (التسارع 9، التباطؤ 0).
      8. تُعاد صياغة الخلايا إلى حجم نهائي قدره 5 mL، ويجب أن يكون لهذه الخلايا كثافة نوعية تشبه الخلايا أحادية النواة منخفضة الكثافة <1.073. تُقاس الكثافة النوعية للمتدرج باستخدام مقياس الكثافة (densiometer).
      9. يُعاد تعليق الراسب إلى حجم نهائي قدره 100 mL باستخدام 95 mL من وسط متدرج الكثافة العالية (1.083 g/mL) في كيس نقل. يُستخدم هذا المنتج للتنقية باستخدام فاصل الخلايا. يحتوي الحجم النهائي البالغ 100 mL على الخلايا ووسط متدرج الكثافة العالية 1.083.
        ملاحظة: يمكن تخزين طبقة الغباء في الثلاجة طوال الليل في محلول PBS يحتوي على 0.5% BSA أو بلازما ذاتية. كما يمكن غسل طبقة الغباء أيضاً.
  8. يتم تحميل المتدرجات المتكونة مسبقاً من الأعلى بحد أقصى 30 mL من الخلايا أحادية النواة المعزولة من طبقة الغباء والمعلقة في 100 mL من وسط حفظ مركز، وذلك باستخدام مضخة 연동ية بسرعة 25 mL/min. يتم الحفاظ على المتدرج عند +4 °C.
  9. يتم قياس درجة الحرارة داخل معالج الخلايا باستمرار باستخدام مسبار حراري مُعاير مسبقاً. وباستخدام مزدوجة حرارية رقمية متصلة بمسبار حراري معقم، يتم مراقبة درجة حرارة المتدرجات والخلايا أثناء العملية.

4. تحسين الخطوات المختلفة للتحميل المتدرج

  1. أدخل مجموعة معالج الخلايا المبردة مسبقاً عند +4 °C. قم بتحميل التدرج عالي الكثافة (130 mL) عند + 4.5 °C. عند الانتهاء من تحميل التدرج، اضبط جهاز الطرد المركزي على سرعة منخفضة نسبياً (537 x g) لتقليل الحرارة الناتجة عن الدوار.
  2. أوقف تشغيل معالج الخلايا للسماح للنظام الهيدروليكي بالعودة إلى مستويات ما قبل التشغيل وتفريغ الهواء.
  3. أعد تشغيل معالج الخلايا عند 537 x g وأضف تدرجات الكثافة العالية (130 mL) والمنخفضة (140 mL) لإنشاء تدرج كثافة مستمر عند +4.3 °C ومعدل تدفق 50 mL/min.
  4. قم بتحميل الطبقة المدمجة (buffy coat) (30 mL) مع 100 mL من وسط تخزين بارد عند +6 °C ومعدل تدفق 25 mL/min. أضف 50 mL (25 mL x 2) من محلول الغسيل.
  5. بعد 5 min عند +5 °C، اجمع التدرج المفصول في 12 زجاجة بمعدل تدفق 100 mL/min.
  6. املأ الأنابيب بوسط الغسيل (M199 + 20% human albumin + 10% Penicillin streptomycin). املأ الأنبوب رقم 1 بـ 100 mL من وسط الغسيل و 150 mL من الخلايا، والأنابيب من 2 إلى 12 بـ 225 mL من وسط الغسيل و 25 mL من الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم في البداية قياس تأثير معالج الخلايا المبرد على الغرفة النظيفة المعتمدة على ممارسات التصنيع الجيد (GMP). استخدمت الطرق الموحدة عداد جسيمات لقياس تلوث الجسيمات المحمولة جواً في بيئة غرفة نظيفة من الفئتين C وB وفقاً لمعايير GMP، وذلك عند نقاط حرجة بالقرب من معالج الخلايا ونظام تبريد الهواء المضغوط. وأظهرت النتائج عدم حدوث أي اضطرابات حول المعدات. كما بينت البيانات المسجلة عدم وجود زيادة في الجسيمات المحمولة جواً بحجم 0.5 µm و5 µm، وفقاً لمعايير الغرف النظيفة GMP من الفئتين C وB، ومعايير مستوى السلامة البيولوجية الثالث (B...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

اعتمدت مرافق عزل الجزر في جميع أنحاء العالم لعقود من الزمن تنقية الجزر البشرية في معالج خلوي معاد استخدامه. على الرغم من أن بعض مرافق إنتاج الجزر تستمر في معالجة الجزر الصغيرة في معالج خلوي غير مبرد ، إلا أن معظم المراكز تستخدم نسخة مبردة من معالج الخلية10،11،15. تقوم المراكز إما بوضع معالج الخلية في غرفة باردة لها عيب كبير يتمثل في التعرض للرطوبة والتكثيف ، أو تقوم تقنيا بإجراء تعديلات كبيرة على معالج الخلية نفسه ، بما في ذلك ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للمعهد الأوروبي لعلم الجينوم للسكري (ANR-10- LABEX-0046 to FP) ومعهد قطر لعملية التمثيل الغذائي - مؤسسة حمد الطبية ، قطر. يشكر المؤلفون أيضا مركز البحوث الطبية في مؤسسة حمد الطبية على دعم رسوم معالجة المقالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المعدات< / قوي>
عداد جزيئات الهواءLasair III & nbsp ؛
AirJet XR40  SP ScientificFTS system XR40
خزانة السلامةالحيوية الحرارية العلميةEQ-1301
مبرد التبريد الدائريJulaboCF30
COBE 2991   ؛Terumo BCT
BiorepCCT-01
صانع التدرج المزدوج المغلف  حسب الطلب في المنزل
KJT-Thermocouple ThermometerHanna InstrumentsHI93551Nلقياس درجة حرارة السوائل
المحرك المغناطيسي   ؛88880014العلمية الحرارية
 ميزان حرارة MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430لدرجة حرارة COBE
بدون ماء حبة حمامكول بارمر10122-00
المواد والكواشف< / قوي >
BD طقم تعداد الخلايا الجذعيةBD Biosciences 344563
طقم أنابيب COBE 2911Terumo BCT90819
أنابيب مخروطية 250 ملكورنينج430776
كثافة التدرج 1.1Biochrom   ؛L6155
زجاجات متدرجة يمكن التخلصمنها Thermo fisher382019-1000
ألبومين بشري 20٪   ؛كيدريون بيوفارما 8091600
M199 محلول الغسيل كورنينج 99-784-CM 
أنابيب MasterflexMasterflex96400-6
Medical Dry AirLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-Streptomycin Gibco 15140122
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan blue  سيجما ألدريتش15250061
جامعة ويسكونسن بيلزر (UW)  جسر الحياة RM / N 4055وسط الحفظ
علبة تبريد مخروطية المضخة التمعجية

المراجع

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

معالج خلايا مبردتنقية بالتدرج الكثافيحيوية الجزر البشريةمعدات العلاج الخلويمعايير التصنيع الجيد للغرف النظيفةجزء الخلايا أحادية النواةخطوة الطرد المركزيتقييم الجسيمات المحمولة جواًقياس حيوية الخلايا
تقييم تأثير نظام معالج خلايا التبريد الجديد على مرفق عزل الخلايا الجزرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.