يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء مزارع مختلطة للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران الجنينية لدراسة العدوى والمناعة الفطرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يجب أن تلخص نماذج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الشبكة المعقدة للخلايا المترابطة الموجودة في الجسم الحي. يتكون الجهاز العصبي المركزي بشكل أساسي من الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا للجهود المتزايدة لاستبدال وتقليل استخدام الحيوانات ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لاستكشاف خصائص الخلايا الفطرية ، والتي تسمح بتطوير علاجات لعدوى الجهاز العصبي المركزي وأمراضه. في حين أن بعض الأسئلة البحثية يمكن معالجتها من خلال أنظمة زراعة الخلايا البشرية ، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المستحثة) ، فإن العمل مع الخلايا البشرية له حدوده الخاصة فيما يتعلق بالتوافر والتكاليف والأخلاق. هنا ، نصف بروتوكولا فريدا لعزل الخلايا وزراعتها من أدمغة الفئران الجنينية. تحاكي ثقافات الخلايا العصبية المختلطة الناتجة العديد من مجموعات الخلايا والتفاعلات الموجودة في الدماغ في الجسم الحي. بالمقارنة مع الطرق المكافئة الحالية ، يحاكي هذا البروتوكول بشكل أوثق خصائص الدماغ ويحصل أيضا على المزيد من الخلايا ، مما يسمح بفحص المزيد من الحالات التجريبية من فأر حامل واحد. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول سهل نسبيا وقابل للتكرار بدرجة كبيرة. تم تحسين هذه الثقافات للاستخدام على مستويات مختلفة ، بما في ذلك شاشات عالية الإنتاجية ذات 96 بئرا ، وتحليل مجهري 24 بئرا ، ومزارع 6 آبار لقياس التدفق الخلوي وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR). طريقة الاستزراع هذه هي أداة قوية للتحقيق في العدوى والمناعة في سياق بعض تعقيدات الجهاز العصبي المركزي مع راحة الطرق في المختبر .
المقدمة
يعد تحسين فهمنا للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا بالغ الأهمية لتحسين الخيارات العلاجية للعديد من الأمراض الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. يتكون الجهاز العصبي المركزي ، وهو شبكة معقدة من الخلايا المترابطة داخل الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب البصرية ، من الخلايا العصبية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، وخلاياها المناعية الفطرية ، الخلايا الدبقية الصغيرة1. يمكن للنهج في المختبر في كثير من الأحيان أن يقلل بشكل كبير من عدد الفئران المطلوبة لإجراء أبحاث ذات مغزى. ومع ذلك ، فإن الطبيعة المعقدة للجهاز العصبي المركزي تجعل من المستحيل تلخيص الوضع في الجسم الحي باستخدام خطوط الخلايا. توفر مزارع الخلايا العصبية المختلطة أداة بحث قيمة للغاية للتحقيق في أسئلة علم الأعصاب (المناعي) في نموذج ذي صلة ، بما يتماشى مع مبادئ الاستبدال والتخفيض والصقل (3Rs) 2,3.
وصف طومسون وآخرون طريقة زراعة الخلايا باستخدام خلايا الحبل الشوكي قبل الولادة التي تتمايز إلى جميع أنواع خلايا الجهاز العصبي المركزي الرئيسية المذكورة أعلاه4. يحتوي هذا النظام أيضا على تكوين المشبك العصبي ، ومحاور الميالين ، وعقد رانفييه. القيد الرئيسي لطريقة الزراعة هذه هو أنه ، كونه الحبل الشوكي ، فإنه لا يصمم الدماغ بشكل مفيد ، وتنتج الخلية من الحبل الشوكي الجنيني في اليوم 13 (E13) تضيق. وبالتالي ، فإن هذا يحد من عدد الحالات التجريبية التي يمكن التحقيق فيها. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نظام جديد لزراعة الخلايا يلخص خصائص الدماغ مع زيادة إنتاجية الخلايا لتقليل متطلبات الحيوانات.
باستخدام Thomson et al. كنقطة انطلاق ، قمنا بتطوير نموذج زراعة الخلايا المستمد فقط من أدمغة الفئران قبل الولادة. تحتوي هذه الثقافات على نفس مجموعات الخلايا والترابط وخيارات العلاج مثل مزارع الحبل الشوكي ، باستثناء وجود ميالين أقل بالمقارنة. ومع ذلك ، فإن وجود نموذج الجهاز العصبي المركزي في المختبر مع إنتاجية خلايا أعلى بثلاثة أضعاف تقريبا هو أكثر كفاءة ، ويتطلب عددا أقل من الفئران ووقتا أقل في معالجة الأجنة. لقد قمنا بتحسين نظام الاستزراع الفريد هذا للعديد من التطبيقات والمقاييس النهائية ، بما في ذلك استخدام أغطية زجاجية للتحليل المجهري وأحجام مختلفة من ألواح الآبار البلاستيكية ، بما في ذلك ألواح 96 بئرا للأبحاث عالية الإنتاجية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
امتثلت جميع التجارب على الحيوانات للقوانين والمبادئ التوجيهية المحلية لاستخدام الحيوانات ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية المحلية في جامعة غلاسكو. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وفقا لقانون الإجراءات العلمية للحيوانات في المملكة المتحدة لعام 1986 ، تحت رعاية ترخيص مشروع وزارة الداخلية في المملكة المتحدة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6J المرباة في المنزل. يوصى باستخدام الإناث الشابات (8-12 أسبوعا) بسبب ارتفاع معدل نجاح الحمل ؛ يمكن إعادة استخدام الذكور لجولات متعددة من التكاثر. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية للطريقة الموصوفة لتوليد ثقافات عصبية ودبقية مختلطة.
1. إعداد مستهلكات زراعة الأنسجة
- قم بإعداد الأطباق و / أو الأطباق التي تحتوي على أغطية مجهرية داخل خزانة أمان من الفئة 2. تعقيم جميع الكواشف أو الأوتوكلاف لضمان العقم خلال فترة الاستزراع.
- أضف الحجم المناسب من BA-PLL (13.2 ميكروغرام / مل بولي-L-ليسين هيدروبروميد [PLL] في محلول حمض البوريك [BA] [50 mM حمض البوريك ، 12.5 mM رباعي الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.5] ؛ انظر جدول المواد) إلى كل بئر (1000 ميكرولتر / بئر في صفيحة 6 آبار ، 100 ميكرولتر / بئر في لوحة 96 بئر ؛ يتم تلخيص الأحجام في الجدول 1). بالنسبة لأغطية الفحص المجهري ، أضف 20 مل من BA-PLL إلى طبق زراعة الأنسجة بقطر 9 سم يحتوي على 200 غطاء معقم ، وقم بالدوران لتوزيعها بالتساوي.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
- قم بإزالة محلول BA-PLL من كل بئر أو طبق يحتوي على أغطية مجهرية ، واغسله بإضافة 20 مل من الماء المعقم ، وتحريك أغطية الغطاء ، ثم إزالة الماء. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. بالنسبة للطبق الذي يحتوي على أغطية ، اترك الماء المعقم في طبق زراعة الأنسجة في الغسيل النهائي لإزالة أغطية الغطاء بسهولة.
- قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل باستخدام ماصة معقمة واتركها تجف لمدة 2 ساعة على الأقل طوال الليل.
- تخزين لوحات المغلفة في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام حمض البوريك المحضر بمحلول بولي ل ليسين (BA-PLL) حتى ثلاث مرات ، مع إضافة PLL جديد في كل مرة. قم بتخزين BA-PLL في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يتم التعامل مع الأطباق باستخدام BA-PLL ، حيث يسمح PLL للخلايا بالالتصاق والنمو. بدون هذا العلاج ، سوف ترفع الخلايا بعد حوالي 1 أسبوع من الثقافة ولم تعد قادرة على التمايز.
2. تشريح الأدمغة الجنينية E17
- شارك في إيواء واحد أو عدة فئران أنثى مع فأر ذكر. تحقق من الإناث يوميا بحثا عن سدادة مخاطية ، مما يشير إلى حدوث التزاوج.
ملاحظة: يجب فصل أي إناث فئران "مسدودة" عن الذكر لضمان تاريخ البدء الصحيح للحمل. يمكن وزن الفئران لتأكيد الحمل أو مراقبتها بصريا. - إعدام الفأر الحامل في E17 باستخدام الطرق المناسبة وفقا لإرشادات وقوانين رعاية الحيوان المحلية ، على سبيل المثال ، عن طريق رفع تركيز ثاني أكسيد الكربون (CO2) ، أو جرعة زائدة من مخدر مميت ، أو خلع الرقبة.
ملاحظة: يجب ألا تؤدي الطريقة المختارة إلى تعطيل الأجنة. في هذه الدراسة ، تم استخدام التعرض لتركيز متزايد من غاز ثاني أكسيد الكربون متبوعا بتأكيد الوفاة عن طريق قطع الشريان الفخذي لإعدام السدود الحامل. - ضع الفأر الحامل الذي تم إعدامه على ظهره على لوح التشريح ؛ في حين أن تثبيته ليس مطلوبا ، إلا أنه قد يسهل الأمر على الباحثين عديمي الخبرة. قرصة خط الوسط من البطن باستخدام ملقط. باستخدام مقص حاد ، قم بفتح البطن من خلال الجلد والبريتوني فوق خط الوسط من الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري ، مع الحرص على عدم ثقب الرحم.
- يحتوي رحم الفأر على قرنين ، يحتوي كل منهما عادة على واحد إلى خمسة أجنة. قم بإزالة الرحم الذي يحتوي على الأجنة من الأم وضعه على الفور على الجليد.
- قطع كيس الصفار على جانب المشيمة ، مع الحرص على عدم إتلاف الأجنة ، وإزالة الأجنة من كيس صفار البيض.
- قطع رأس الأجنة على الفور. أضف الرؤوس مقطوعة الرأس إلى طبق مع محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) بدون الكالسيوم (Ca 2+) والمغنيسيوم (Mg2+) (HBSS-/-) على الثلج.
ملاحظة: إذا كان التنميط الجيني مطلوبا ، يمكن للمرء إزالة الذيل في هذه المرحلة للتحليل الجيني. عندما يتوقع وجود أنماط وراثية متعددة ، يجب الاحتفاظ برؤوس كل جنين بشكل منفصل للزراعة. - باستخدام ملقط بزاوية ، ضع الرأس على جانبه المواجه لليسار.
- بيرس العين مع حافة واحدة من ملقط ، عقد بقوة الذقن مع الآخر.
- بدءا من القفا ، قم بتمزيق جلد فروة الرأس برفق على طول خط الوسط باتجاه طرف الخطم.
- عند الدخول من خلال الحبل الشوكي ، الذي يمكن ملاحظته كشكل بيضاوي أبيض ، استخدم الملقط المائل لفتح الجمجمة على طول خط الوسط ، مما يؤدي إلى كشف الدماغ.
- قشر الجمجمة برفق بعيدا على الجانب المواجه لأعلى ، وكشف الدماغ.
- ارفع الدماغ من الجمجمة ، وتخلص من الجمجمة بمجرد إزالة الدماغ بالكامل.
- باستخدام الملقط ، قم بإزالة السحايا ، والتي يمكن ملاحظتها كغشاء رقيق مع أوعية دموية كثيفة.
- ضع الأدمغة في بيجو (انظر جدول المواد) يحتوي على 2 مل من HBSS-/- على الثلج.
- كرر الخطوات من 2.6 إلى 2.13 مع الأدمغة المتبقية ، مع إضافة ما يصل إلى أربعة أدمغة لكل بيجو.
- أضف 250 ميكرولتر من 10x تربسين إلى بيجو وسحن الأدمغة عن طريق هز بيجو. احتضان لمدة 15 دقيقة على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة فصاعدا في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة. - ذوبان 2 مل من مثبطات تربسين فول الصويا (Leibovitz L-15، 0.52 ملغ/مل مثبط التربسين من فول الصويا، 40 ميكروغرام/مل DNase I، 3 ملغ/مل من ألبومين مصل البقر [BSA] الجزء الخامس؛ انظر جدول المواد) من -20 درجة مئوية بوضعه عند 37 درجة مئوية.
- أضف 2 مل من مثبطات SD إلى كل بيجو يحتوي على أدمغة (لكل بيجو يحتوي على ما يصل إلى أربعة أدمغة) ، وهز بيجو مرة أخرى لتفريقه بالتساوي.
ملاحظة: يقلل مثبط SD من نشاط التربسين لمنع الهضم غير الضروري للعينات والحفاظ على صلاحية الخلية. - بدون طرد مركزي ، قم بإزالة 2 مل من المادة الطافية من كل بيجو وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم نقل كتل الخلايا.
- سحن الخلايا المتبقية في بيجو بإبرة 19 جم متصلة بحقنة سعة 5 مل عن طريق استنشاق المعلق مرتين. سيؤدي ذلك إلى إنشاء خليط سميك يشبه المخاط.
- كرر مرتين أخريين باستخدام إبرة 21 جرام. إذا كانت هناك كتل متبقية ، فقم بالسحن مرة أخرى بإبرة 21 جرام.
- انقل الخلايا من bijou إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل (من الخطوة 2.18) باستخدام إبرة 23 جرام.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات السائبة في الجزء السفلي التي تحتوي على الخلايا المطلوبة.
- أجهزة الطرد المركزي الطافية مرة أخرى في 200 × غرام في RT لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية ، ولكن إذا كان المرء يحتاج إلى العديد من الخلايا أو لديه عدد قليل من الأجنة ، فيمكن للمرء تنفيذ هذه الخطوة لاستعادة أكبر عدد ممكن من الخلايا من المادة الطافية. - باستخدام 10 مل من وسائط الطلاء (PM) (49٪ وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين [قلم / سترب] ، 25٪ مصل حصان ، 25٪ HBSS مع Ca 2+ و Mg2+ [HBSS +/+] ؛ انظر جدول المواد) ، ادمج الكريتين وأعد تعليقهما معا لإنشاء تعليق خلية كاملة.
- عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وإما مقياس الدم أو عداد الخلايا الرقمية ، وقم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام PM إلى تركيز 1.8 × 106 خلايا / مل.
3. تصفيح الخلايا
- أضف الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى التنسيق المطلوب كما هو مفصل في الجدول 1: 1000 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر في شكل 96 بئرا ، أو 100 ميكرولتر لكل غطاء جانبي.
- احتضان لمدة 2-4 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ -7٪ CO2. تحقق من أن الخلايا قد التصقت باستخدام مجهر مقلوب.
- قم بإزالة الوسائط وقم بتعبئتها بوسائط تمايز جديدة (DM +: DM- بما في ذلك 10 ميكروغرام / مل من الأنسولين. DM-: DMEM ، 1٪ قلم / بكتيريا ، 50 نانومتر هيدروكورتيزون ، 10 نانوغرام / مل بيوتين ، 2.5 مل 100x N1 مكمل إعلامي ؛ انظر جدول المواد). المجلدات مفصلة في الجدول 1. اضغط لأسفل على أي أغطية عائمة باستخدام طرف ماصة معقم.
4. الحفاظ على الثقافات
ملاحظة: تتطلب هذه الثقافات التغذية ثلاث مرات أسبوعيا لدعم النمو الأمثل والتمايز. ستصل الثقافات إلى الصحة والنضج الأمثل للتجارب على DIV (أيام في المختبر) 21. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى 28 يوما ، وبعد ذلك تتدهور الثقافات بسرعة.
- ثلاث مرات في الأسبوع حتى DIV12 ، استبدل جزءا من المادة الطافية ب DM + طازج عن طريق إزالة 500 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئرا ، أو 500 ميكرولتر لكل طبق يحتوي على ثلاث أغطية ، وإضافة 600 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، 60 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئر ، أو 600 ميكرولتر لكل طبق غطاء منزلق (الجدول 1).
- ثلاث مرات في الأسبوع من DIV13 فصاعدا ، استبدل جزءا من المادة الطافية ب DM- طازج عن طريق إزالة 500 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 6 آبار ، أو 50 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئرا ، أو 500 ميكرولتر لكل طبق يحتوي على ثلاث أغطية ، وإضافة 600 ميكرولتر لكل بئر في شكل 6 آبار ، 60 ميكرولتر لكل بئر بتنسيق 96 بئر ، أو 600 ميكرولتر لكل طبق غطاء منزلق (الجدول 1).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مجهريه
تعتبر الثقافات المزروعة على أغطية زجاجية مثالية للتحليل عن طريق الفحص المجهري. لتصور تطور الثقافات ، تم تثبيت قسائم الغطاء في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في نقاط زمنية متعددة من DIV0 (بمجرد إرفاق الخلايا) حتى DIV28. تم تلطيخ الثقافات للتصوير المناعي كما هو موضح سابقا5 باستخدام ثلاث مجموعات تلطيخ مختلفة: NG2 (الخلايا قليلة التغصن غير الناضجة) و nestin (الخلايا الجذعية العصبية / السلفية) كعلامات تنموية ، SMI31 (محاور) ، MBP (المايلين) ، و NeuN (جسم الخلية العصبية) كعلامات عصبي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجهاز العصبي المركزي عبارة عن شبكة معقدة تمتد من الدماغ وصولا إلى الحبل الشوكي وتتكون من العديد من أنواع الخلايا ، والخلايا العصبية في الغالب ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقيةالصغيرة 1. نظرا لأن كل خلية لها دور مهم في الحفاظ على التوازن وتوليد استجابات مناسبة للتحديات في الجهاز العصبي المركزي9،10،11 ، فإن نظام الثقافة الذي يحتوي على كل أنواع الخلايا هذه يعد أداة مفيدة ومتعددة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر أعضاء مختبرات إدغار ولينينجتون ، ولا سيما البروفيسور كريس لينينجتون ، والدكتورة ديانا أرسيني ، والدكتورة كاتيا موكليش ، على نصائحهم وتعليقاتهم المفيدة ومساعدتهم في تغذية الثقافات أثناء إنشاء هذه الثقافات. نتوجه بشكر خاص إلى الدكتور Muecklisch لتوفير نقاط البداية لخطوط أنابيب Cell Profiler. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية التصلب المتعدد (المنحة 122) ومؤسسة يوري ولورنا تشيرناجوفسكي إلى MP. تمويل جامعة غلاسكو ل JC و MP ؛ و Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRV0109721) إلى GJG.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | لهضم الأنسجة |
| 140 مم TC Dish | Fisher | 11339283 | ضع 8 أطباق 35 مم لكل طبق 1 140 مم |
| 15 مل Falcon | Sarstedt | 62554502 | لجمع الخلايا في بيليه لإعادة التعليق في وسائط الطلاء |
| 18 جرام إبرة | Henke Sass Wolf | 4710012040 | لتجربة عينة |
| 21 جرام إبرة | BD | 304432 | لمحاكمة عينة |
| 23 جم إبرة | Henke Sass Wolf | 4710006030 | لمحاكمة العينة |
| 35 مم TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 أغطية مطلية PLL لكل طبق 1 35 مم |
| 5 مل حقنة | فيشر | 15869152 | لاختبار عينة |
| 6 لوحة بئر | Corning | 3516 | لإخراج الخلايا ل RT-qPCR ، والتدفق قياس الخلايا |
| 7 مل Bijoux | Fisher | DIS080010R | لوضع الأدمغة intp |
| 96 لوحة البئر | Corning | 3596 | لإخراج الخلايا لاختبار الإنتاجية |
| العالية ACSA-2 الأجسام المضادة ، المضادة للفأر ، PE | Miltenyi | 130-123-284 | لقياس التدفق الخلوي تلطيخ الخلايا النجمية |
| ملقط بزاوية | Dumont | 0108-5 / 45-PO | لتشريح |
| البيوتين | سيجما | B4501 | ل DM +/- |
| حمض البوريك | Sigma | B6768-500G | لعازلة حمض البوريك |
| Brilliant Violet 421 الأجسام المضادة CD24 المضادة للفأر ، استنساخ M1-69 | Biolegend | 101825 | لقياس التدفق الخلوي تلطيخ الخلايا العصبية والخلايا النجمية |
| الجسم المضاد CD45 المضاد للفأر Brilliant Violet 605 ، استنساخ 30-F11 | Biolegend | 103139 | لتلطيخ قياس التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة |
| الأجسام المضادة للفيول اللامعنة 785 المضادة للفأر / الإنسان CD11b ، استنساخ M1 / 70 | Biolegend | 101243 | لتلطيخ قياس التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | لمثبط SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | قليلة التغصن الناضجة |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | للوحة الخلايا للفحص المجهري |
| مقص تشريح | سيجما | S3146-1EA | لتشريح |
| DMEM نسبة عالية من الجلوكوز ، بيروفات الصوديوم ، L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | ل DM +/- ، ولوسائط الطلاء |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | بالنسبة لمثبط SD ، يمكن استخدام هذا أو غيره من Dnase من sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | لمثبط SD ، يمكن استخدام هذا أو غيره من Dnase من صبغة |
| الجدوى القابلة للإصلاح في Thermofisher eBioscience eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | ملقط مباشر / ميت |
| ملقط ناعم | Dumont | 0102-SS135-PO | لتشريح |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | لوسائط الطلاء |
| HBSS بدون Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | لإضافة الأدمغة إلى |
| مصل | الحصانGibco | 26050-070 | لوسائط |
| الطلاء Hydrocortisone | Sigma | H0396 | ل DM +/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| الأنسولين | Sigma | I1882 | ل DM + |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | لمثبط SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | المايلين |
| الفأر CCL5 / RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | مجموعة ELISA لقياس تركيز CCL5 في المواد الطافية ل 96 لوحة بئر |
| N1 مكمل الوسائط | Sigma | N6530-5ML | ل DM +/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | الخلايا الجذعية / السلفية العصبية |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | جسم الخلية العصبية |
| NG2 | Sigma | AB5320 | للخلايا قليلة التغصن |
| O4 غير الناضجة ، مضادة للإنسان / الفأر / الفئران ، APC | Miltenyi | 130-119-155 | لتلطيخ قياس التدفق الخلوي للخلايا قليلة التغصن |
| القلم / البكتيريا العقدية | Sigma | P0781-100ML | ل DM + /- ، ولوسائط الطلاء |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | لحمض البوريك / محلول بولي إل ليسين لطلاء الأغطية |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | محاور |
| الصوديوم رباعي بورات | سيجما | 221732-100G | لعازلة حمض البوريك |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | لخلايا التحلل لمثبط RT-qPCR |
| Trypsin من فول الصويا | Sigma | T9003-100MG | لمثبط SD |
المراجع
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117(2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
