يوفر هذا البروتوكول سير عمل سهل المتابعة لإجراء تنقية الحمض النووي الريبي poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة باستخدام معدات موحدة لعينة بيولوجية ذات أهمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إثراء مكتبة mRNA و Bisulfite-mRNA للجيل التالي من التسلسل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ترتبط تعديلات ما بعد النسخ للحمض النووي الريبي في أنواع مختلفة من نسخ الحمض النووي الريبي بتنظيم الحمض النووي الريبي المتنوع في الخلايا حقيقية النواة. وقد تبين أن تعديلات الحمض النووي الريبي الشاذ 5-ميثيل سيتوزين والتعبير غير المنظم لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي مرتبطة بأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطانات. تم تطوير تسلسل ثنائي الكبريتيت على نطاق النسخ لتوصيف المواضع ومستويات مثيلة السيتوزين الكمية في الحمض النووي الريبي المحول ثنائي الكبريتيت عند دقة زوج القاعدة. هنا ، يعرض هذا البروتوكول إجراءات جولتين من تنقية poly (A) RNA ، وثلاث دورات من تفاعل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة بالتفصيل للسماح برسم خرائط على مستوى النسخ لمواقع تعديل mRNA 5-methylcytosine. يعد تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي بعد التفاعل الرئيسي أمرا ضروريا لمراقبة سلامة الحمض النووي الريبي وهو خطوة حاسمة لضمان مكتبات تسلسل عالية الجودة. من الناحية المثالية ، يمكن إكمال الإجراءات في غضون ثلاثة أيام. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن أن يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة كمدخل عمليا إلى بناء مكتبات ثنائية الكبريتيت-mRNA قوية لتسلسل الجيل التالي من عينة الاهتمام.
المقدمة
من بين أكثر من 150 نوعا من تعديلات ما بعد النسخ1 ، تم تحديد تعديل 5-methylcytosine (m5C) في أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي ، والحمض النووي الريبي المنقول ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الصغير ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبي القبو ، والحمض النووي الريبي المحسن ، والحمض النووي الريبي الصغير الخاص بالجسم2. يرتبط الحمض النووي الريبي m 5 C بآليات بيولوجية ومرضية متنوعة مثل تنظيم نمو جذر النبات3 ، والتعبير الجيني الفيروسي4 ، وتطور السرطان5.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. بولي (أ) تنقية الحمض النووي الريبي
ملاحظة: استخدم إجمالي الحمض النووي الريبي المعالج ب DNase I وافحص جودة وسلامة الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق تقييم الرحلان الكهربائي للهلام الشعري أو التقليدي قبل الشروع في تنقية poly (A) RNA. يجب أن يكون الباحثون قادرين على تحديد نطاقات الريبوسوم 28S و 18S rRNA في مجال الوزن الجزيئي العالي ونطاق 5.8S rRNA في مجال الوزن الجزيئي المنخفض دون أي نطاقات مسحة كبيرة في مخطط كهربي. تتبع خطوات التنقية بشكل أساسي تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة موضحة في الخطوات المحددة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إنشاء سلسلة من مكتبات bsRNA-seq من خطوط الخلية19 باتباع الإجراءات الواردة في هذا التقرير (الشكل 1). بعد تنقية الحمض النووي الريبي الكلي مصحوبة بمعالجة DNase التي يتم إجراؤها على عينات خط الخلية وفحص الجودة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي وقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية (A260 / A280) ، يمكن لعينة الحمض النووي الريبي المضي قدما في إثراء poly (A) RNA. لتحديد ما إذا كان التنقية المزدوجة يمكن أن يزيل غالبية الحمض النووي الريبوزي الريبو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، تم تحقيق خط أنابيب مفصل لإثراء poly (A) ، وتحويل ثنائي الكبريتيت ، وإعداد المكتبة من خلال استخدام مكونات موحدة. قدم تحليل التسلسل الإضافي تحديد mRNA 5-methylcytosine في العينات ذات الأهمية.
الخطوة الحاسمة هي جودة بدء المواد - إجمالي الحمض النووي الريبي - لأن تدهور الحمض النووي الريبي سيؤثر على معدل استرداد تنقية poly (A) RNA. يجب التعامل مع العينة بعناية وتجنب تلوث RNase قبل إجراء خطوة تنقية poly (A) RNA. جزء آخر مهم من الإجراء هو عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل في إعد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان. [NSTC 111-2314-B-006-003]
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 نظام التحليل الحيوي للرحلان الكهربائي | Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا | RNA الكشف عن جودة | |
| حبات AMpure XP | Beckman Coulter | A63881 | تنقية الحمض النووي |
| الحيوي محلل الحمض النووي طقم حساسية عالية | Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا | 5067-4626 | الكشف عن جودة الحمض النووي |
| المحلل الحيوي RNA 6000 طقم بيكو | Agilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا | 5067-1513 | RNA الكشف عن الجودة |
| DiaMag02 - الرف المغناطيسي | Diagenode ، Denville ، NJ | B04000001 | مساعدة إعداد |
| المكتبة DiaMag1.5 - الرف المغناطيسي | Diagenode ، Denville ، NJ | B04000003 | مساعدة poly (A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT طقم تنقية | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA | 61011 | poly (A) RNA purificaion ؛ Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | JTBaker | 64-17-5 | |
| EZ RNA مثيلة | Kit Zymo ، Irvine ، CA | R5002 | معالجة ثنائي الكبريتيت |
| Firefly luciferase mRNA | Promega ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية | L4561 | ارتفاع في التحكم seqeunce ؛ |
| مجموعات القياس الكمي لمكتبة KAPA | روش ، سويسرا | مكتبة | KK4824 |
| قياس الطيف الضوئي النانوي | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA | إجمالي الكشف عن كمية الحمض النووي الريبي | |
| NEBNext متعدد الإرسال Oligos ل illumina (مجموعة الفهرس التمهيدي 1) | إنجلاند بيولوجيس ، إبسويتش ، ماساتشوستس | إعداد | |
مكتبة E7335SNEBNext Ultra  مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الاتجاهي ل Illumina | New England Biolabs ، إبسويتش ، MA | إعداد مكتبة E7760S | |
| Nuclease Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer ؛ | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA | الكشف عن كمية الحمض النووي | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA | Q32854 | الكشف عن كمية الحمض |
| النووي Qubit RNA HS Assay | Kit Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA | Q32852 | الكشف عن كمية الحمض النووي الريبي |
المراجع
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Me....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
