نورموذرميك خارج الجسم الحي آلة الكبد التروية في الماوس

تمثل زراعة الكبد العلاج القياسي الذهبي للأفراد المصابين بأمراض الكبد في المرحلة النهائية. ومما يؤسف له أن الطلب على الأعضاء المانحة يتجاوز العرض المتاح، مما يؤدي إلى نقص كبير. في عام 2021 ، كان ما يقرب من 24,936 مريضا على قائمة الانتظار للحصول على ترقيع الكبد ، بينما تم إجراء 9,234 عملية زرع فقط بنجاح¹. يسلط التفاوت الكبير بين العرض والطلب على ترقيع الكبد الضوء على الضرورة الملحة للتحقيق في استراتيجيات بديلة لتوسيع مجموعة المانحين وتعزيز إمكانية الوصول إلى ترقيع الكبد. تتمثل إحدى طرق توسيع مجموعة المانحين في استخدام المانحين^{الهامشيين 2}. يشمل المتبرعون الهامشيون أولئك الذين يعانون من تقدم العمر أو التنكس الدهني المعتدل أو الشديد. على الرغم من أن زرع الأعضاء الهامشية قد يؤدي إلى نتائج إيجابية ، إلا أن النتائج الإجمالية تظل دون المستوى الأمثل. ونتيجة لذلك ، يجري حاليا تطوير استراتيجيات علاجية تهدف إلى تعزيز وظيفة المانحين الهامشيين ^3,4.

تتمثل إحدى الاستراتيجيات في استخدام التروية الآلية ، وخاصة التروية الآلية المؤكسجة ذات الحرارة العادية ، لتحسين وظيفة هذه الأعضاء الهامشية⁵. ومع ذلك ، لا يزال هناك فهم محدود للآليات الجزيئية التي تكمن وراء الآثار المفيدة للنضح الآلي المؤكسج الطبيعي الحرارة (NEVLP). الفئران ، مع توافرها الوفير من السلالات المعدلة وراثيا ، بمثابة نماذج قيمة للتحقيق في المسارات الجزيئية. على سبيل المثال ، تم التعرف بشكل متزايد على أهمية مسارات الالتهام الذاتي في التخفيف من إصابة نقص التروية الكبدية ^6,7. أحد المسارات الجزيئية المهمة في إصابة نقص التروية الكبدية هو مسار miR-20b-5p / ATG7⁸. حاليا ، هناك عدد من سلالات ATG بالضربة القاضية والضربة القاضية الشرطية المتاحة ولكن لا توجد سلالات الفئران المقابلة⁹.

بناء على هذه الخلفية ، كان الهدف هو إنشاء منصة NEVLP مصغرة لترقيع كبد الفئران. ستسهل هذه المنصة استكشاف وتقييم الاستراتيجيات المعدلة وراثيا المحتملة التي تهدف إلى تحسين وظائف كبد المتبرع. بالإضافة إلى ذلك ، كان من الضروري أن يكون النظام مناسبا للتروية على المدى الطويل ، مما يتيح العلاج خارج الجسم الحي للكبد ، والذي يشار إليه عادة باسم "إصلاح الأعضاء".

بالنظر إلى محدودية توافر البيانات ذات الصلة في المختبر حول نضح كبد الفئران ، ركزت مراجعة الأدبيات على الدراسات التي أجريت على الفئران. تم إجراء بحث منهجي للأدبيات يمتد من عام 2010 إلى عام 2022 باستخدام كلمات رئيسية مثل "نضح الكبد الطبيعي الحرارة" و "خارج الجسم الحي أو في المختبر" و "الفئران". يهدف هذا البحث إلى تحديد الظروف المثلى في القوارض ، مما يسمح لنا بتحديد النهج الأنسب.

يتكون نظام الإرواء من خزان عازل زجاجي مغلق مغلف بالماء ، ومضخة أسطوانية تمعجية ، وأكسجين ، ومصيدة فقاعات ، ومبادل حراري ، وغرفة عضو ، ونظام أنابيب ركوب دراجات مغلق (الشكل 1). يضمن النظام الصيانة الدقيقة لدرجة حرارة التروية الثابتة التي تبلغ 37 درجة مئوية باستخدام آلة ثابتة حراري مخصصة. تدفع المضخة الدوارة التمعجية تدفق البيرفوسات في جميع أنحاء الدائرة. تبدأ دائرة التروية في الخزان المعزول المغلف بالماء. بعد ذلك ، يتم توجيه perfusate من خلال جهاز الأكسجين ، الذي يتلقى خليط غاز من 95 ٪ من الأكسجين و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون من زجاجة غاز مخصصة. بعد الأوكسجين ، يمر البيروزيت عبر مصيدة الفقاعات ، حيث يتم إعادة توجيه أي فقاعات محاصرة مرة أخرى إلى الخزان بواسطة المضخة التمعجية. يتدفق البيرفوسات المتبقي عبر المبادل الحراري ويدخل غرفة العضو ، حيث يعود إلى الخزان.

هنا ، نبلغ عن تجاربنا في إنشاء NEVLP لكبد الفئران ونشارك النتائج الواعدة لتجربة تجريبية أجريت باستخدام الوسط المؤكسج بدون حاملات الأكسجين.

تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية الألمانية الحالية لرعاية الحيوان وإرشادات REACH للإبلاغ عن الأبحاث الحيوانية. تمت الموافقة على بروتوكول التجارب على الحيوانات من قبل Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz ، تورينجيا ، ألمانيا (رقم الموافقة: UKJ - 17 - 106).

ملاحظة: تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J التي تزن 34 ± 4 جم (متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط [SEM]) كمتبرعين بالكبد. تم الحفاظ عليها في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (50٪ رطوبة و 18-23 درجة مئوية) مع حرية الوصول إلى الفأر القياسي والماء. طوال العملية الجراحية ، تم الحفاظ على معدل تنفس يتجاوز 60 نفسا / دقيقة ، وتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم أعلى من 34 درجة مئوية.

1. التحضير

1. إعداد جدول العمليات
   1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية لأغراض التعقيم.
   2. قم بتشغيل جميع المعدات ، بما في ذلك لوحة الاحترار والتخثير الكهربائي.
   3. ضع حقنة واحدة سعة 50 مل مع محلول ملحي 25 مل من الهيبارين (2500 وحدة / لتر) في حاضنة دافئة (37 درجة مئوية).
   4. ضع الأدوات الجراحية ، وخياطة الحرير 6-0 ، وقضيب القطن الصغير المعقم ، والمحلول الملحي البيطري (500 مل) ، وإسفنج الشاش غير المنسوج (10 سم × 10 سم) على طاولة العمليات بشكل مناسب.
   5. ضع إبرة 26 جيجا على طاولة العمليات لإنشاء ثقب صغير في غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل لاستقبال الأنبوب الصفراوي لجمع الصفراء.
   6. ضع القنية (1 قنية بولي يوريثين Fr أو UT - 03 قنية بولي إيثيلين) وأنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 0.5 مل لجمع الصفراء على طاولة العمليات.
2. قنية الوريد البابي عصامي
   1. امسك قنية 2 Fr بالملقط وثقب الجدار بإبرة 30 جم على مسافة 1 سم من نهاية القنية. ادفع الإبرة عبر القنية حتى يصبح طرف الإبرة مرئيا.
   2. تقليم طرف القنية مما يؤدي إلى مثلث حاد.
3. تحضير محلول ملحي هيبارين
   1. تحضير 25 مل من محلول ملحي هيبارين بتركيز نهائي 2500 وحدة دولية / مل.
   2. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء ووضع المحقنة في حاضنة 40 درجة مئوية.
4. مظاهرة من نظام التروية
   1. انظر الشكل 1 لمعرفة المكونات الرئيسية لنظام نضح الماكينة.
5. إعداد غرفة الجهاز
   1. انظر الشكل 2 لتخطيط حجرة الأرغن.
6. إعداد نظام التروية
   1. قم بتشغيل برنامج مخطط المختبر لمراقبة الضغط.
   2. قم بتوصيل معاير الضغط ومستشعر الضغط على مستوى غرفة الجهاز.
   3. اضبط معاير الضغط لقراءة 0 مم زئبق وتحقق من القيمة المقابلة في برنامج التحكم في الضغط.
   4. اضبط معاير الضغط لقراءة 20 مم زئبق وتحقق مرة أخرى من القيمة المقابلة في برنامج التحكم في الضغط.
   5. قم بتشغيل الحمام المائي ، وقم بتسخين حجرة العضو إلى 40 درجة مئوية.
   6. اغسل نظام السباكة بالكامل مرتين بالماء المقطر منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة لكل منهما ، مما يضمن الإزالة الكاملة لمحلول التعقيم.
   7. ابدأ في تداول محلول التطهير في جميع أنحاء النظام بأكمله لمدة 20 دقيقة لضمان التطهير الشامل.
   8. قم بتشغيل خليط الغاز (95٪ أكسجين (O 2) و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
7. ملء البيرفوسات
   1. مكمل 250 مل من وسط ويليامز E مع 50 مل من مصل الجنين البقري ، و 3 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1 مجم / مل) ، و 0.17 مل من الأنسولين (100 IE / mL) ، و 0.34 مل من الهيبارين (5000 وحدة / مل) ، و 0.07 مل من الهيدروكورتيزون (100 مجم / 2 مل) لإعداد وسط Williams 'E الكامل.
   2. أضف كميات متساوية (150 مل) من البيرفوسات إلى الخزان وغرفة الجهاز لتجهيز النظام.
      ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على العقم أثناء عملية التعبئة. يتم ضخ البيرفوسات باستمرار من خلال هذين المكونين الرئيسيين لنضح آلة إعادة التدوير المغلقة.
   3. قم بتشغيل المضخة التمعجية بسرعة متوسطة (15 مل / دقيقة) لتجهيز نظام التروية بالوسط المؤكسج.

2. زرع الكبد

1. التحضير قبل الجراحة
   1. وزن الحيوان. تحضير البوبرينورفين المسكن (0.3 مجم / مل) (0.05 مجم / كجم من وزن الجسم).
   2. قم بتوصيل غرفة الحث بمقبس الحائط. تحويل الأكسجين إلى 0.5 لتر / دقيقة. بدوره إيزوفلوران إلى 3 ٪.
   3. ضع الحيوان في الغرفة حتى يتم الوصول إلى التخدير العميق (تصحيح رد الفعل الإيجابي).
   4. استخدم حقنة صغيرة لتطبيق جرعة متكيفة مع وزن الجسم من التسكين تحت الجلد.
   5. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لتقليم الفراء على جلد البطن.
   6. انقل الماوس إلى طاولة العمليات وقم بتشغيل مبخر الأيزوفلوران إلى 2.5٪ للحفاظ على التخدير. تأكد من عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس إصبع القدم بين الأصابع.
2. إعداد بطن الفأر
   1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
   2. اختبر المنعكس بين الأصابع لمضاعفة تأكيد عمق التخدير المناسب. إصلاح جميع الأطراف الأربعة مع الشريط.
   3. تطهير جانبي البطن إلى خط منتصف الإبط باستخدام ثلاث جولات متتالية من كحول اليود. استخدم شاشا معقم غير منسوج لتغطية المنطقة المحيطة بالمجال الجراحي.
   4. قم بعمل شق عرضي 3 سم 1 سم تحت الخنجري في منطقة البطن من الفأر باستخدام مقص الأطفال Metzenbaum والملقط الجراحي.
   5. قم بتمديد شق الجلد بشكل ثنائي إلى خط منتصف الإبط على كلا الجانبين.
   6. قم بعمل شق طولي بطول 2 سم بعناية على طول خط ألبا باستخدام مقص الربيع.
   7. قطع من خلال طبقة العضلات في البطن مع التخثير الكهربائي ومقص الربيع فاناس.
   8. ضع بعناية قطعة من الشاش الرطب لحماية الكبد من التخثير الكهربائي.
   9. استخدم خياطة حريرية 6-0 مع الإبرة المستديرة لسحب عملية الخنجري من أجل تعرض أفضل للرباط التاجي.
   10. استخدم اثنين من مبعدات الأضلاع لفضح تجويف البطن للفأر بالكامل.
   11. حرك الأمعاء الدقيقة بعناية من تجويف البطن باستخدام قطعة قطن مبللة لفضح الهيلوم بالكامل.
3. إعداد القناة الصفراوية المشتركة
   1. قم بتحويل الأربطة المنجلية والفرينية والمعدية الكبدية بمقص حاد.
   2. حرر القناة الصفراوية المشتركة بعناية باستخدام ملقط منحني ناعم بدون أسنان.
      ملاحظة: القناة الصفراوية المشتركة تتلف بسهولة وتتكسر. بمجرد أن ينكسر ، لا يمكن تقليبه. بسبب اتجاه الموضع التشريحي ، من الأفضل استخدام الملقط المنحني.
   3. ضع حلقتين من الحرير 6 - 0 فوق القناة الصفراوية المشتركة استعدادا للخطوة التالية.
4. قنية القناة الصفراوية الشائعة
   1. ثقب بعناية القناة الصفراوية بإبرة 30 غرام. استخدم ملقط منحني مدبب لتكبير الفتحة الصغيرة لتناسب قنية القناة الصفراوية.
   2. استخدم ملقط قنية الأوعية الدموية للإمساك بقنية القناة الصفراوية ودفعها إلى القناة الصفراوية.
   3. قم بتأمين القنية مرتين باستخدام حلقات خياطة 6-0 المحددة مسبقا.
      ملاحظة: أثناء القنية ، يتم الشعور بمقاومة الصفراء. إذا لم يتم التحكم في القوة بشكل جيد ، دفع القنية خارج القناة الصفراوية عن طريق ضغط تدفق الصفراء. ضبط بعناية عمق القنية. إذا كان عميقا جدا ، فقد يؤدي إلى تلف القناة الصفراوية ، وإذا لم يكن عميقا بدرجة كافية ، فقد ينزلق.
   4. مراقبة تدفق الصفراء في القنية بعد القنية الناجحة.
5. إعداد الوريد البابي
   1. قم بتثبيت الوريد البابي بالملقط المسطح وحرر النسيج الضام بعناية باستخدام ملقط منحني. لا تسحب بقوة لتجنب التسبب في تمزق الوريد البابي. بمجرد تلف الوريد البابي ، من الصعب إعادة تقليب الوريد البابي.
   2. تشريح PV فقط أعلى من التشعب ووضع حلقة خياطة الأولى باستخدام 6-0 خياطة الحرير على PV بالقرب من التقاء لاستخدامها لاحقا.
   3. ضع حلقة الخياطة الثانية للتثبيت اللاحق لل PV بالقرب من الهيلوم الكبدي قدر الإمكان.
6. قنية الوريد البابي
   1. استخدم مشبكا شريانيا لإغلاق الوريد البابي البعيد.
   2. بعناية فائقة ، ثقب الوريد البابي بأحد قنيات الوريد البابي أعلاه. يمكن ملاحظة تدفق الدم بوضوح داخل القنية بعد ثقب ناجح.
   3. قم بتأمين القنية الكهروضوئية بحلقة خياطة 6-0 الموضوعة مسبقا.
7. احمرار الكبد
   1. زيادة الأيزوفلوران إلى 5 ٪ والقتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من استنشاق الأيزوفلوران.
   2. خذ محلول ملحي من الهيبارين من الحاضنة. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء المتكونة داخل محلول ملحي هيبارين.
   3. ثبت المحقنة بمحلول ملحي مسخن مسبقا في مضخة المحقنة.
   4. قم بتوصيل أنبوب تمديد مضخة المحقنة بقنية الوريد البابي ، واضبط السرعة على 2 مل / دقيقة ، وابدأ في تنظيف الكبد.
   5. راقب لون الكبد في نهاية عملية التنظيف. استأصل الكبد بمجرد أن يتحول اللون إلى أصفر متجانس.
   6. عبر الحجاب الحاجز ، الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي ، الوريد الأجوف تحت الكبدي ، الشريان الكبدي ، الوريد البابي البعيد ، وأي نسيج ضام متبقي.
   7. ضع الكبد في طبق بتري.

3. اتصال الكبد والغرفة

1. نقل الكبد
   1. نقل الكبد بعناية إلى غرفة الجهاز باستخدام طبق بتري.
   2. احتفظ بكمية صغيرة من المحلول الملحي في طبق بتري لمنع جفاف الكبد.
      ملاحظة: يمكن بسهولة التواء الوريد البابي والقناة الصفراوية أثناء هذا الإجراء ، مما قد يؤثر على تروية الكبد وجمع الصفراء.
2. اتصال قنية الوريد البابي
   1. قم بضخ محلول ملحي طبيعي ببطء في قنية الوريد البابي باستخدام حقنة لإخلاء فقاعات الهواء في القنية.
   2. قم بتوصيل قنية الوريد البابي بأنبوب التدفق الخارجي perfusate في غرفة الجهاز.
3. اتصال قنية القناة الصفراوية
   1. قم بتوجيه قنية القناة الصفراوية للفأر من خلال صمام غطاء مطاطي متصل بغرفة الجهاز.
   2. أدخل قنية القناة الصفراوية في أنبوب دقيق معد مسبقا سعة 0.5 مل مع وجود ثقب صغير في الغطاء.
   3. ضع الأنبوب الدقيق على الطين خارج حجرة الجهاز.

4. ضبط معدل التدفق وفقا للضغط الكهروضوئي

1. قم بتشغيل المضخة التمعجية من 1 مل / دقيقة.
2. تحقق من قراءة ضغط الوريد البابي لضبط معدل التدفق.
3. الحفاظ على ضغط الوريد البابي في النطاق الفسيولوجي بين 7 - 10 مم زئبق عن طريق ضبط معدل التدفق.
   ملاحظة: يمكن أن يختلف معدل التدفق الاسمي قليلا حسب استخدام الأنابيب وتحديد موضعها.

5. جمع العينات

1. الحصول على عينات مدخل perfusate من أنبوب تدفق الوريد البابي وعينات perfusate مخرج من غرفة الجهاز في فترات 3h.
2. جمع عينات من جميع فصوص الكبد للتحليل النسيجي في نهاية فترة التروية من 12 ساعة.

إنشاء العملية الجراحية
تم استخدام ما مجموعه 17 حيوانا لهذه التجربة: تم استخدام 14 فأرا لتحسين عملية شراء الأعضاء ، بما في ذلك قنية الوريد البابي (PV) والقناة الصفراوية (BD) ، بينما تم استخدام 3 فئران للتحقق من صحة الإجراء (الجدول 1). تمت مقارنة النتائج النسيجية (الشكل 3) لتسهيل تحديد حالة التروية المثلى.

اختيار البيرفوسات
تم اختيار وسط زراعة خلايا الكبد المستخدم سابقا لهذه الدراسة10,11. تم تصميم وسيط William E في البداية بواسطة Williams and Gunn كوسيط منخفض المصل للزراعة المطولة في المختبر للخلايا الظهارية الناضجة لكبد الفئران12. ومع ذلك ، فقد وجد أيضا فائدة في دعم نمو وصيانة خلايا الكبد القوارض13. مصل الجنين البقري (FBS) هو مكمل لزراعة الخلايا يستخدم على نطاق واسع نظرا لتكوينه الغني بالعناصر الغذائية الأساسية وعوامل النمو التي تسهل نمو الخلايا وتكاثرها وصلاحيتها14. تم استخدام وسط ويليام E الكامل كبروفوسات (الجدول 2) ، والذي يتم استكماله بمصل بقري جنيني بنسبة 20٪ ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 5000 وحدة / لتر هيبارين ، و 50 وحدة / لتر أنسولين ، و 0.010 جم / لتر هيدروكورتيزون.

اختيار القنية
تضمن إجراء القنية أولا قنية القناة الصفراوية (BD) لجمع السوائل الصفراوية ، تليها قنية الوريد البابي (PV). بالنسبة للقنية BD ، تم استخدام أنبوب البولي بروبلين UT-03 بقطر خارجي 0.3 مم وقطر داخلي 0.18 مم في البداية. ومع ذلك ، نظرا للمخاوف المتعلقة بتلف BD المحتمل وارتفاع خطر إزاحة القسطرة غير المقصودة المرتبطة بطرف UT-03 المشذب والصلب ، تم إعطاء الأفضلية لأنابيب البولي يوريثين 1 Fr. اعتبرت أنابيب البولي يوريثين ، بموادها الأكثر نعومة وتقليل الانزلاق ، أكثر ملاءمة لقنية BD.

في البداية ، تم استخدام قنية إبرة في الوريد 26 G من مادة البولي بروبيلين لقنية الوريد البابي (PV). ومع ذلك ، فإن إزالة الإبرة والتعلق اللاحق للقنية بأنبوب التروية أدى إلى تكوين فقاعات ، والتي كان لديها القدرة على عرقلة الجيوب الأنفية داخل الكبد. للتغلب على هذه المشكلة ، تم بناء قنية مسكن باستخدام إبرة 30 G يتم إدخالها في 1 سم البعيدة من قنية البولي يوريثين 2 Fr. ثم تم إدخال هذه "القنية الموجهة بالإبرة" ذاتية الصنع في PV البعيد فوق التقاء. عندما تم وضع القسطرة داخل الكهروضوئية ، تم سحب الإبرة ببطء أثناء دفع الأنبوب في نفس الوقت. تم توصيل نهاية القنية ذاتية الصنع بأنبوب التروية داخل الغرفة. يوفر استخدام مادة ناعمة في تقنية القنية هذه ميزة من خلال تقليل مخاطر إصابة الجدار الخلفي للسفينة.

دراسات التحقق من الصحة
خضعت عينات المدخل والمخرج لتحديد مستويات الأس الهيدروجيني والبوتاسيوم. ثم تمت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها (الشكل 4) بالنتائج المبلغ عنها في المنشورات الحديثة15،16،17. تم ترشيح ثلاثة أكباد فأر بالأكسجين واستكملت بوسط ويليام E لمدة 12 ساعة. طوال هذه الفترة ، تم تسجيل ضغط نضح مستقر من 7 إلى 10 مم زئبق بشكل مستمر. كان متوسط الرقم الهيدروجيني مستقرا نسبيا طوال فترة التروية لمدة 12 ساعة وتراوح بين 7.3 و 7.7. كان متوسط مستويات البوتاسيوم مستقرا أيضا طوال فترة التروية وتراوح بين 5.9 و 6.8 مليمول / لتر (الشكل 4). تم الحفاظ على معدل التدفق الكهروضوئي في نطاق 0.8 - 1.2 مل / دقيقة / جم اعتمادا على استخدام وتحديد موضع أنابيب المضخة أثناء الإجراءات التجريبية. أظهرت جميع النتائج التي لوحظت في تروية كبد الفأر أوجه تشابه مع الملاحظات المبلغ عنها سابقا في تروية كبد الفئران (الجدول 3).

تم جمع عينات الأنسجة من ثلاثة أكباد (N = 3) وخضعت للتروية لمدة 12 ساعة باستخدام البروتوكول الأمثل لتلطيخ HE، متبوعا بمسح الشريحة بالكامل. تم تسجيل كل فص كبد باستخدام درجة سوزوكي المعدلة (الجدول 4). تم تعزيز درجة سوزوكي الكلاسيكية18 من خلال دمج ثلاثة معلمات إضافية: pyknosis من النوى ، انفصال الأوعية ، ووجود كريات الدم الحمراء في الجيوب الأنفية والأوعية الكبيرة. تم تصنيف كل معلمة على أنها غائبة (0) وخفيفة (1) ومعتدلة (2) وشديدة (3). تم اعتبار النتيجة النهائية من 0 إلى 7 لتعكس الحفظ الجيد ، وتم اعتبار 8 - 14 بمثابة حفظ معتدل ، و 14 - 21 أشارت إلى حفظ سيء.

تم تقييم الحفاظ على كبد الفأر بناء على درجة سوزوكي المعدلة. أجرى خبيران طبيان تقييما مستقلا لمورفولوجيا الفصوص السبعة للكبد الثلاثة (الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7). تم حساب متوسط درجات الفص السبع لكل فص كبدي. تشير الدرجات المنخفضة إلى الحفاظ على الكبد بشكل أفضل. وأظهرت التقييمات التي أجراها الخبراء درجة عالية من التوافق. والجدير بالذكر أنه في حين لوحظت اختلافات طفيفة في الدرجات التي حددها الخبيران في تقييم pyknosis للنوى ، فإن هذه الاختلافات لم تؤثر على نتائج التسجيل الإجمالية بشكل كبير.

في أحسن الأحوال ، كانت حمة الكبد سليمة نسبيا مع بنية مفصصة نموذجية محفوظة جيدا ، بالكاد يمكن تمييزها عن الكبد الطبيعي. بدت خلايا الكبد قابلة للحياة مع أغشية خلايا مرئية بوضوح ونوى مستديرة. ومع ذلك ، خضعت بعض النوى ل pyknosis ، وتم توسيع بعض الجيوب الأنفية الكبدية قليلا ، مما أدى إلى درجة 4. (الشكل 3 ، الشكل 6)

في أسوأ الأحوال ، كان الهيكل الفصيصي مشوها ، مع فصل الأوعية عن الحمة ونخر متني متقارب. على المستوى الخلوي ، أصبح الفراغ الخلوي ، و pyknosis النوى واضحا ، خاصة في المنطقة المحيطة بالمركز. علاوة على ذلك ، لوحظ فراغ خفيف إلى معتدل. ما يصل إلى 30 ٪ من خلايا الكبد كانت تخضع للنخر مما أدى إلى درجة قصوى من 14. (الشكل 3 ، الشكل 7)

الجدول 1: إنشاء نموذج نضح كبد الفأر خطوة بخطوة. لوحظت مضاعفات مختلفة أثناء عملية التأسيس بسبب الاختلافات في حجم القنية والمواد وتحديد المواقع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مقارنة طرق حفظ الأعضاء في المختبر 15،17،19،20،21،22. يعد تحسين اختيار البيروسات واختيار حامل الأكسجين ومقارنة المكونات الغذائية أمرا بالغ الأهمية في ظل ظروف التخزين المختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: ديناميكا الدم وتحليل غازات الدم في الفئران الطبيعية والفئران NEVLP 11،15،16،17،18،20،21،23،24،25،26،27،28،29،30،31. تصف المعلومات المقدمة بشكل انتقائي السمات الديناميكية الدموية لكبد الفئران والمعلمات الرئيسية للنضح الطبيعي في المختبر. على وجه التحديد ، يمكن اعتبار نضح كبد الفئران الأمثل عندما يتراوح الضغط الكهروضوئي عادة من 4 إلى 10 مم زئبق ، ويتراوح الضغط الجزئي للأكسجين في البيرفوسات التي تدخل الكهروضوئية من 80 إلى 550 مم زئبق ، مما يلبي المعايير اللازمة للنجاح في نضح كبد الفئران في المختبر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: درجة سوزوكي المعدلة. تتوسع درجة سوزوكي المعدلة المستخدمة في هذه الدراسة في درجة سوزوكي الكلاسيكية من خلال دمج ثلاثة معلمات إضافية: pyknosis من النوى ، وانفصال الأوعية ، ووجود كريات الدم الحمراء في الجيوب الأنفية والأوعية الكبيرة. تم تعيين درجة لكل معلمة على مقياس من 0 (غائب) أو 1 (خفيف) أو 2 (معتدل) أو 3 (شديد). تشير النتيجة الإجمالية ، التي تتراوح من 0 إلى 8 ، إلى الحفاظ الجيد ؛ 9 إلى 16 تشير إلى حفظ معتدل ، و 17 إلى 24 تشير إلى سوء الحفظ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: اختيار وسط البيرفوسات وحجم البيرفوسات وضغط التروية بناء على دراسة أدبية ل NEVLP في الفئران (2010-2022) 3،8،10،14،17،19،27،30،31،32،33،34،35،3637,38,
39،40،41،42،43،44،45.يمكن أن يظهر نضح آلة Normothermic في كبد الفئران تباينا عبر الدراسات من حيث النوع المحدد وحجم البيروسات المستخدم ، وكذلك مدة التروية. قد تستخدم الدراسات المختلفة طرقا مختلفة ، مثل غسيل الكلى أو التروية بكميات كبيرة ، لفترات طويلة. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الاختلافات ، فإن المعلمات مثل ضغط البوابة ، ومعدل تدفق الوريد البابي ، والضغط الجزئي للأكسجين في البيرفوسات تظهر عموما الحد الأدنى من الاختلاف عبر الطرق المختلفة المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام التروية. المكونات الرئيسية هي غرفة الجهاز ، آلة ثرموستاتية ، مضخة الأسطوانة ، الأوكسجين ، والخزان. يتم ضخ perfusate من الخزان بواسطة مضخة تمعجية إلى جهاز الأكسجين. هناك تدفق غاز متواصل بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2 في جهاز الأكسجين. يمر perfusate عبر مصيدة الفقاعات ، حيث يتم التقاط أي فقاعات هواء موجودة في perfusate وضخها مرة أخرى إلى الخزان. يتدفق البيرفوسات المتبقي إلى غرفة العضو ، حيث يتم توصيل الأنبوب بالوريد البابي. يتم توجيه التدفق الخارجي من غرفة العضو مرة أخرى إلى الخزان بواسطة المضخة التمعجية. يتم توصيل أنبوب تصريف الصفراء بغرفة العضو لجمع الصفراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: لقطة مقربة لحجرة التروية. تتكون غرفة تروية الأعضاء من مدخل ومخرج معطل ، ومصيدة فقاعات ، ومبادل حراري ، ومنفذ تجميع الصفراء. يتم إجراء المراقبة في الوقت الفعلي لضغط مضخة البيروسات باستخدام مستشعر الضغط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النتائج النسيجية لكبد الفأر الطبيعي والمثقوب. (أ) مورفولوجيا كبد الفأر الطبيعي (التحكم). (ب) مثال على أفضل مورفولوجيا محفوظة كما تصورها تلطيخ HE-بعد 12 ساعة من التروية. (ج). مثال على التشكل الأسوأ حفظا كما هو موضح بواسطة تلطيخ HE-بعد 12 ساعة من التروية. يشير السهم الأسود إلى الفراغ ، ويشير السهم الأحمر إلى توسع الجيوب الأنفية ، ويظهر السهم الأصفر pyknosis من النوى والسهم الأخضر يحدد انفصال الأوعية الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل البيرفوسات. درجة الحموضة (أ) ومستويات البوتاسيوم (ب). كلتا المعلمتين مستقرتان طوال أوقات المراقبة البالغة 12 ساعة ، مما يشير إلى ظروف نضح ثابتة يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تلف طفيف في الكبد أدى إلى تعديل درجة سوزوكي 4-7. بعد 12 ساعة من NEVLP ، تم إجراء تقييم شبه كمي لمورفولوجيا الكبد. تم تقييم العينات من كل فص كبد وتصنيفها بشكل منفصل ، مما أدى إلى نطاق ومتوسط درجة لكل كبد ، مع أعلى درجة ممكنة هي 4. مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا بدرجة تتراوح من 4-7 اعتمادا على فص الكبد (المتوسط = 5) (النتيجة 0-7: مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا ، النتيجة 8-14 مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل ، الدرجة 15-21: مورفولوجيا الكبد المحفوظة بشكل سيئ) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تلف معتدل في الكبد يؤدي إلى تعديل درجة سوزوكي 7-14. تقييم شبه كمي لمورفولوجيا الكبد بعد 12 ساعة من نضح آلة الأكسجين الطبيعي الحرارة وفقا لدرجة سوزوكي المعدلة. مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل بدرجة تتراوح من 7 إلى 14 (المتوسط = 11). (النتيجة 0-7: مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا ، النتيجة 8-14 مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل ، النتيجة 15-21: مورفولوجيا الكبد المحفوظة بشكل سيئ) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تلف طفيف - معتدل في الكبد مما أدى إلى تعديل درجة سوزوكي 5-11. أدى التروية غير المتجانسة إلى مورفولوجيا طفيفة إلى معتدلة محفوظة في فصوص الكبد المختلفة ، مع درجات تتراوح من 5 إلى 11 (المتوسط = 8). (النتيجة 0-7: مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا ، النتيجة 8-14 مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل ، النتيجة 15-21: مورفولوجيا الكبد المحفوظة بشكل سيئ) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لا يوجد تضارب في المصالح المالية للإفصاح عنه.