مقالة منهجية

قياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة الميلانية باستخدام قياس التنفس المجهري بقياس الكولوم

DOI:

10.3791/65379

⸱

يوليو 7, 2023

 ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland, College Park, Universities at Shady Grove

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس التنفس بقياس الكولوم مثالي لقياس معدل الأيض للكائنات الحية الدقيقة. عند تكييفه مع ذبابة الفاكهة الميلانية في الدراسة الحالية ، كان استهلاك O2 المقاس ضمن النطاق الذي تم الإبلاغ عنه للنوع البري D. melanogaster من خلال الدراسات السابقة. كان استهلاك O2 لكل ذبابة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر حجما وأقل نشاطا ، أقل بكثير من النوع البري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس التنفس الدقيق للكولوم هو طريقة مباشرة وغير مكلفة لقياس استهلاك O2 للكائنات الحية الصغيرة مع الحفاظ على بيئة مستقرة. يتكون مقياس التنفس المجهري الكولوم من غرفة محكمة الإغلاق يتم فيها استهلاك O 2 ويتم إزالة CO2 الذي ينتجه الكائن الحي بواسطة وسيط ماص. يؤدي انخفاض الضغط الناتج إلى إنتاج O 2 كهربائيا ، ويتم قياس كمية O2 المنتجة عن طريق تسجيل كمية الشحنة المستخدمة لتوليدها. في هذه الدراسة ، تم تكييف الطريقة مع ذبابة الفاكهة الميلانية التي تم اختبارها في مجموعات صغيرة ، مع حساسية الجهاز والظروف البيئية المحسنة لتحقيق ثبات عالي. تتوافق كمية O2 التي يستهلكها الذباب البري في هذا الجهاز مع تلك التي تم قياسها بواسطة الدراسات السابقة. لم يكن استهلاك O2 الخاص بالكتلة بواسطة طفرات CASK ، وهي أصغر ومعروفة بأنها أقل نشاطا ، مختلفا عن الضوابط المتجانسة. ومع ذلك ، أدى صغر حجم طفرات CASK إلى انخفاض كبير في استهلاك O2 على أساس كل ذبابة. لذلك ، فإن مقياس التنفس الدقيق قادر على قياس استهلاك O2 في D. melanogaster ، ويمكنه التمييز بين الاختلافات المتواضعة بين الأنماط الجينية ، ويضيف أداة متعددة الاستخدامات لقياس معدلات الأيض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على قياس معدل الأيض أمر بالغ الأهمية لفهم كامل للكائن الحي في سياقه البيئي. على سبيل المثال ، من الضروري قياس معدل الأيض من أجل فهم دوره في العمر1 ، أو دور النظام الغذائي في التمثيل الغذائي2 ، أو عتبة الإجهاد نقص الأكسجين3.

هناك طريقتان عامتان لقياس معدل الأيض4. يقيس القياس الحراري المباشر إنفاق الطاقة مباشرة عن طريق قياس إنتاج الحرارة. يقيس القياس الحراري غير المباشر إنتاج الطاقة من خلال وسائل أخرى ، غالبا عن طريق القياس التنفسي لاستهلاك O2 (VO2) أو إنتاج CO2 أو كليهما. على الرغم من تطبيق القياس الحراري المباشر على الحرارة الخارجية الصغيرة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر5 ، إلا أن قياس التنفس أبسط تقنيا وأكثر استخداما.

تم استخدام عدة أشكال من قياس التنفس بنجاح لقياس معدل الأيض في النوع البري والمتحولة D. melanogaster وقدمت نظرة ثاقبة للتأثيرات الأيضية لدرجة الحرارة6 ، والبيئة الاجتماعية 3 ، والنظام الغذائي3،7 ، واضطرابات النمو العصبي8. تنقسم هذه إلى فئتين ، والتي تختلف اختلافا كبيرا في التكلفة والتعقيد. قياس الضغط هو أبسط وأقل تكلفة 9,10 ، حيث يتم وضع الذباب في غرفة مغلقة تحتوي على مادة ماصة CO2 والتي ترتبط عبر شعرية رقيقة بخزان السوائل. عندما يتم استهلاك O2 وامتصاص CO2 ، ينخفض الضغط في الغرفة ويتم سحب السائل إلى الشعيرات الدموية. ومن ثم، فإن حجم الشعيرات الدموية المملوء بالسائل يتناسب مع VO2. كما تم استخدام إصدارات أكثر تفصيلا ، والتي تعوض عن القوة التي يمارسها السائل في الشعيرات الدموية ، على D. melanogaster1. يتميز قياس الضغط بكونه بسيطا وغير مكلف ، ولكن لأنه حساس للضغط ، يتطلب ظروفا بيئية ثابتة. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم استبدال O2 المستهلك ، فإن الضغط الجزئي ل O2 (PO2) ينخفض تدريجيا داخل الغرف.

كما يستخدم قياس التنفس باستخدام تحليل الغاز بانتظام ل D. melanogaster. في هذه الحالة ، يتم أخذ عينات من الغازات على فترات منتظمة من غرف محكمة الغلق تحتوي على الذباب وإرسالها إلى محلل الأشعة تحت الحمراء2،6،11. يتميز هذا النوع من الأجهزة بمزايا أنه متاح تجاريا ، وهو أقل حساسية للظروف البيئية ، ويتم تحديث الغازات أثناء أخذ العينات بحيث يظل PO2 مستقرا. ومع ذلك ، يمكن أن تكون المعدات باهظة الثمن ومعقدة للعمل.

يوفر مقياس التنفس المجهري12 الكولومتري الذي تم تطويره مؤخرا بديلا غير مكلف وحساس ومستقر للأنظمة الحالية. في الممارسة العملية ، يتم وضع الكائن الحي في غرفة محكمة الإغلاق حيث يستهلك O2 ويتم إزالة ثاني أكسيد الكربون الزفير2 بواسطة مادة ماصة ، مما يؤدي إلى انخفاض صاف في ضغط الغرفة. عندما ينخفض الضغط الداخلي إلى عتبة محددة مسبقا (ON-bit) ، يتم تمرير التيار عبر مولد O2 كهربائيا ، مما يعيد الضغط إلى عتبة ثانية (عتبة OFF) توقف التحليل الكهربائي. يتناسب نقل الشحنة عبر مولد O 2 طرديا مع كمية O 2 المطلوبة لإعادة ضغط الغرفة وبالتالي يمكن استخدامه لقياس O2 الذي يستهلكه الكائن الحي4. الطريقة حساسة للغاية ، وتقيس V O2 بدقة ، ويمكن للاستبدال المنتظم ل O2 الحفاظ على PO2 عند مستوى ثابت تقريبا لساعات أو أيام.

يستخدم مقياس التنفس المجهري الكولوم المستخدم في هذه الدراسة مستشعرا إلكترونيا متعدد الوسائط (الضغط ودرجة الحرارة والرطوبة). يتم تشغيل المستشعر بواسطة متحكم دقيق يكتشف التغيرات الصغيرة في الضغط وينشط جيل O2 عند الوصول إلى عتبة الضغط المنخفض12. يتم تجميع هذا الجهاز من خارج أجزاء الرف ، ويمكن استخدامه مع مجموعة متنوعة من الغرف والبيئات التجريبية ، وقد تم استخدامه بنجاح لفحص تأثيرات كتلة الجسم ودرجة الحرارة على خنفساء Tenebrio molitor. في الدراسة الحالية ، تم تكييف مقياس التنفس الدقيق لقياس استهلاك O2 في D. melanogaster ، الذي يحتوي على ما يقرب من 1 ٪ من كتلة T. molitor. تمت زيادة حساسية الجهاز عن طريق تقليل عتبة تنشيط جيلO 2 ، وتم تعزيز الاستقرار البيئي من خلال إجراء تجارب في حمام مائي يتم التحكم في درجة حرارته والحفاظ على الرطوبة داخل الغرف عند أو بالقرب من 100٪.

بروتين CASK (بروتين سيرين كيناز المعتمد على الكالمودولين) ، وهو جزء من عائلة كينازات غوانيلات المرتبطة بالغشاء (MAGUK) ، هو سقالة جزيئية في مجمعات متعددة البروتينات مختلفة ، وترتبط الطفرات في CASK باضطرابات النمو العصبي لدى البشر وفي D. melanogaster13,14. متحولة D. melanogaster قابلة للحياة ، CASKΔ18 ، تعطل نشاط الخلايا العصبية الدوبامينية 15 وتقلل من مستويات النشاط بأكثر من 50٪ مقارنة بالضوابط الخلقية14,16. بسبب انخفاض مستويات نشاط طفرات CASK ودور الكاتيكولامينات في تنظيم عملية التمثيل الغذائي17 افترضنا أن معدل الأيض القياسي ، وبالتالي استهلاك O2 ، سينخفض بشكل كبير مقارنة بالضوابط.

تم قياس استهلاك O2 في CASKΔ18 ومتجانساتها البرية ، w (ex33). تم وضع مجموعات من الذباب في غرف قياس التنفس ، وتم قياس استهلاك O 2 ، وتم حساب استهلاك O2 والتعبير عنه على أساس الكتلة الخاصة ولكل ذبابة. سجل الجهاز VO2 في الذباب البري الذي كان متسقا مع الدراسات السابقة ، ويمكن أن يفرق بين استهلاك O2 لكل ذبابة من النوع البري والذباب الطافر CASK.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تربية الذباب والجمع

  1. الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية في قوارير ضيقة تحتوي على طعام ذبابة الفاكهة القياسية.
    ملاحظة: يجب أن يشتمل حجم العينة لكل نمط وراثي على تسع نسخ متماثلة على الأقل ، تتكون كل منها من غرفة قياس تنفس واحدة تحتوي على 15-25 ذبابة ، تم إعدادها على النحو المبين أدناه.
  2. نقل الذباب كل 2-3 أيام.
  3. تخدير الذباب باستخدام CO2 ، وجمع مجموعات من 15-25 ذكرا من كل نمط وراثي ، ووضع كل مجموعة في قوارير طعام طازجة غير مخبوزة.
    ملاحظة: تم استخدام الذكور لتقليل التباين بسبب الحالة الإنجابية. تنطبق الطريقة على كلا الجنسين.
  4. اسمح للذباب بالتعافي عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: بحلول وقت التجربة ، يجب أن يكون عمر الذباب 1-4 أيام. يمكن ضبط وتيرة المجموعات الموضحة في الخطوة 1.3 لتضييق النطاق العمري للذباب.

2. إعداد وتجميع غرفة مقياس التنفس

  1. قم بتشغيل الحمام المائي واضبطه على درجة الحرارة المطلوبة للتجربة.
    ملاحظة: أجريت التجارب أدناه عند 25 درجة مئوية باستخدام أنابيب شلينك سعة 50 مل كغرف. يجب تجميع المكونات كما هو موضح في الأشكال 1 أ و 1 ب و 1 ج.
  2. نظف الوصلات الزجاجية الأرضية للغرف ومقابس المستشعر جيدا عن طريق رش 70٪ من الإيثانول على منديل المختبر (وليس مباشرة على المفصل) ومسح الغبار والشحوم القديمة من قابس المستشعر (الشكل 1 أ). امسح الإيثانول بمسح مختبر جديد.
  3. ضع قطعة 1 سم من لفائف القطن المنقوعة في الماء النقي في قاع الحجرة لتثبيت الرطوبة.
    1. أضف كمية كافية من الماء (~ 0.5 مل) لتشكيل بركة صغيرة في الجزء السفلي من لفة القطن.
  4. امسح أي ماء انسكب على مفصل الغرفة.
  5. انقل الذباب إلى أنابيب البولي بروبلين الموسومة باستخدام قمع.
    1. قم بتوصيل الأنبوب بلفافة قطنية.
      ملاحظة: تتكون الأنابيب من أنبوب اختبار بولي بروبيلين سعة 5 مل ، مشذب إلى 5.5 سم في الطول ومثقوب بسكين ساخن للسماح بالتبادل الحر للهواء مع غرفة التجربة. من المعروف أن تخدير CO2 يسبب تشوهات التمثيل الغذائي ، لذلك يتم نقل الذباب بدون تخدير مما يتطلب مزيدا من العناية لتجنب فقدان الذباب.
  6. أضف أنبوبا واحدا جيد التهوية مع الذباب في كل حجرة لقياس التنفس (فوق القطن المبلل).
  7. املأ خراطيش جير الصودا (4-5 كريات لكل أنبوب) وضعها في الجزء العلوي من الأنبوب الذي يحتوي على الذباب داخل الغرفة.
    ملاحظة: تتكون خراطيش الجير الصودا من أنابيب طرد مركزي سعة 800 ميكرولتر مثقبة 4-5 مرات باستخدام مثقاب كهربائي.
  8. املأ مولدات O2 بمحلول كبريتات النحاس المشبع (CuSO4) تحت مستوى فتحات التهوية
    ملاحظة: تتكون مولدات O2 من أنابيب طرد مركزي ذات غطاء لولبي مع 4 ثقوب محفورة أسفل الخيوط. يتم لحام أقطاب البلاتين (Pt) والنحاس (Cu) بموصل ثنائي السنون ، ويتم إدخالها في ثقوب محفورة في الغطاء ، ويتم لصقها بالإيبوكسي. يولد التحليل الكهربائي ل CuSO4 O2 الذي يستهلكه الكائن التجريبي. CuSO4 سام لللافقاريات ، وتجنب الانسكابات أو التسرب ونظف على الفور.
  9. قم بتوصيل مولد O2 المملوء بموصل ثنائي السنون على قابس المستشعر.
    ملاحظة: يجب أن يتصل الكاثود النحاسي بالإخراج السالب لوحدة التحكم وأنود البلاتين بالسلك الموجب. ستؤدي الاتصالات المعكوسة إلى فشل التجربة.
  10. ضع قطعتين صغيرتين من شحم السيليكون الشفاف على جوانب متقابلة من المفصل الزجاجي الأرضي لقابس المستشعر.
  11. أدخل القابس في الحجرة وقم بتدوير القابس (أو الحجرة) بضغط معتدل لنشر الشحوم في المفصل.
    1. امسح الشحوم الزائدة بمسح المختبر.
  12. قم بتثبيت مثبتات Keck البلاستيكية على المفاصل لتثبيت المقابس في الغرف. يجب أن تبدو الغرفة المجمعة مثل الشكل 1C.
  13. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لعدد الغرف المستخدمة لتجربة اليوم.
    ملاحظة: عدد الغرف التي يمكن تسجيلها محدود بعدد الغرف ووحدات التحكم ومدخلات USB المتوفرة على الكمبيوتر. بالنسبة للتجارب الحالية ، تم تشغيل سبع غرف بشكل متواز. يجب مطابقة الذباب التجريبي مثل الطفرات مع الضوابط المناسبة. يجب تضمين غرفة تم إنشاؤها بشكل مماثل ولكن بدون ذباب في كل تجربة كعنصر تحكم في التباين البيئي. يجب تدوير الغرف التي تحتوي على علاجات مختلفة (متحولة ، برية ، حظر طيران) بين التجارب.
  14. ضع الغرف المجمعة في رف في حمام مائي مع فتح محبس (الشكل 1E).
    ملاحظة: لتجنب اختلاف الساعة البيولوجية ، تم وضع الغرف في الحمام بين الساعة 9:30 و 9:50 صباحا لجميع التجارب الموضحة هنا.
  15. اترك محبس الإغلاق مفتوحا (حافظ على المقبض موازيا لمحبس المحابس).
    ملاحظة: احرص على عدم السماح للماء بدخول المحبس.
  16. اسمح للغرف بالتوازن مع فتح محبس لمدة 30 دقيقة تقريبا.
    ملاحظة: أثناء توازن الحجرة ، قم بتوصيل الإلكترونيات وإعداد الحصول على البيانات كما هو موضح أدناه.

3. إعداد وحدات التحكم والكمبيوتر

  1. تأكد من أن المفاتيح التي تزود مولدات O2 بالتيار في وضع إيقاف التشغيل (بعيدا عن الموصل ؛ الشكل 1 د).
  2. قم بتوصيل كل صندوق وحدة تحكم بمنفذ ناقل تسلسلي عالمي (USB) متوفر.
    ملاحظة: بناء وبرمجة وحدات التحكم الموصوفة في مكان آخر12.
  3. قم بتوصيل وحدات التحكم بغرف مقياس التنفس باستخدام كابلات ذات 6 موصلات.
  4. تأكد من أن شاشات الصمام الثنائي العضوي الباعث للضوء (OLED) لوحدات التحكم (الشكل 1D) تعرض المعلمات البيئية.
  5. قم بتشغيل مولدات O2 لفترة وجيزة باستخدام المفتاح الموجود على وحدة التحكم (الشكل 1D).
    1. إذا زادت القيمة الحالية من صفر إلى ما بين 35 و 55 مللي أمبير ، فإن وحدة التحكم والغرفة جاهزتان للتجارب.
  6. تحديد منافذ COM التي تستخدمها وحدات التحكم، كما هو موضح أدناه.,
    1. انقر فوق رمز ابدأ في Microsoft Windows.
    2. انقر فوق رمز الإعدادات .
    3. انقر فوق البلوتوث والأجهزة.
    4. تأكد من ظهور وحدات التحكم ومنافذ COM الخاصة بها في قائمة الأجهزة.
  7. افتح PuTTY على سطح المكتب وقم بإعداد ملف سجل لكل قناة من مقياس التنفس كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: PuTTY هو عميل shell و telnet آمن مجاني يستخدم لنقل البيانات إلى الكمبيوتر عبر منافذ COM.
    1. حدد منفذ COM لوحدة تحكم عن طريق كتابة رقم المنفذ في مربع "الخط التسلسلي" (الشكل 2A).
    2. انقر فوق تسجيل.
    3. حدد الإخراج القابل للطباعة في "تسجيل الجلسة" (الشكل 2 ب).
    4. ضمن اسم ملف السجل، انقر فوق استعراض.
    5. في المجلد الذي تختاره ، قم بإنشاء اسم ملف يحتوي على معلومات وصفية (على سبيل المثال ، التاريخ والأنواع ورقم منفذ COM).
    6. انقر على حفظ.
    7. انقر فوق فتح. سيتم فتح نافذة تعرض البيانات المحددة بفواصل التي يتم تسجيلها (الشكل 2C).
    8. كرر ذلك مع جميع وحدات التحكم الأخرى المستخدمة في التجربة. سيظهر الإدخال إلى كل منفذ COM كنافذة منفصلة (الشكل 2D).

4. تشغيل التجارب

  1. بمجرد توازن الغرف لمدة 30 دقيقة ، قم بإغلاقها عن طريق إغلاق المحبس.
  2. قم بتغطية الحمام والغرف بصندوق رغوة البوليسترين للحفاظ على بيئة مستقرة.
  3. السماح لتحقيق التوازن لمدة ساعة أخرى.
  4. قم بتشغيل التيار إلى مولد O2 لكل غرفة باستخدام المفتاح الموجود في صندوق التحكم.
  5. بمجرد تنشيط مولدات O2 ، تأكد من زيادة الضغط إلى ضغط إيقاف التشغيل مسبقا.
    ملاحظة: تم استخدام 1017 هيكتوباسكال ، وهو أعلى بقليل من الضغط الجوي ، كضغط "OFF" في هذه السلسلة من التجارب. ستشير العودة إلى الضغط المحيط إلى تسرب الغاز من الغرف. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح باستخدام نفس الضغط عبر التجارب بغض النظر عن الضغط الجوي المحيط. كان ضغط "ON" 1016 hPa ، مما يعني أن الضغط يحتاج فقط إلى انخفاض 1 hPa قبل تنشيط مولد O2 . هذا يوفر حساسية كافية لقياس استهلاك O2 في ذبابة الفاكهة. بمجرد ضغط الغرفة إلى إعداد "OFF" ، يجب أن ينخفض التيار إلى الصفر.
  6. دع التجربة تستمر لمدة 3 ساعات أو أكثر.
    ملاحظة: يمكن أن يسمح ارتفاع VO2 في درجات حرارة مرتفعة بأوقات تجربة أقصر. راقب من حين لآخر للتأكد من أن المعدات تعمل ولكن تجنب النشاط المفرط بالقرب من الغرف التي قد تؤثر على استقرار درجة الحرارة.

5. الانتهاء من التجربة

  1. قم بإيقاف تشغيل مولدات O2 على جميع وحدات التحكم.
    ملاحظة: قم أولا بتجنب تشغيل مولدات O2 أثناء فتح الغرف.
  2. افتح المحبس لفتح الغرف.
  3. اترك نوافذ PuTTY مفتوحة لمدة 5-15 دقيقة أخرى لتوفير خط أساس نهائي.
  4. أغلق نافذة PuTTY لكل وحدة تحكم ، مع إنهاء التسجيلات.
    ملاحظة: انتهت جميع التجارب بين الساعة 4:50 و 5:10 مساء.
  5. افصل المستشعرات عن الكابلات.
  6. انقل الغرف إلى الرف الجاف.
  7. قم بإزالة مقابس المستشعر واحدة تلو الأخرى من الغرف.
  8. افصل مولدات O2 وضعها في رف الأنبوب.
  9. امسح الشحوم من قابس المستشعر واحتفظ بها في الحامل.
  10. تنظيف الشحوم من وصلات الغرفة وإزالة الأنابيب مع الذباب والجير الصودا.
  11. تخدير الذباب في كل أنبوب باستخدام CO2 ، واضغط على قارب وزن ووزن على ميزان دقيق.
    1. سجل وزن وعدد الذباب لكل أنبوب.
  12. تخلص من الذباب أو ضعه جانبا لإجراءات إضافية.
  13. تفريغ الجير الصودا من الخراطيش في حاوية النفايات.
  14. افتح مولد O2 وتخلص من محلول CuSO4 في حاوية النفايات.
    1. شطف الأقطاب الكهربائية والأنبوب بالماء النقي.
    2. ضع رفوف الأنبوب للتجفيف.

6. تحليل بيانات تحويل الرسوم

  1. استيراد البيانات كنص مفصول بفواصل إلى جدول بيانات، بحيث يشتمل كل سجل على ورقة عمل منفصلة.
  2. سجل بيانات التيار والوقت لكل نبضة من مولد O2 . بدءا من النبضة الأولى بعد ضغط الغرفة ، سجل وقت البدء ووقت الانتهاء (كأرقام صفوف) لكل نبضة حالية. هذا هو رقم الصف عندما يتجاوز التيار الصفر (عادة إلى حوالي 45-50 مللي أمبير) إلى الصف الأخير الذي يزيد عن الصفر.
  3. قم بعمل جدول على ورقة العمل لتسجيل البيانات التالية:
    1. متوسط سعة التيار أثناء النبضة: = AVERAGE ([الصف الأول من النبض]: [الصف الأخير من النبضة]) لكل نبضة (من العمود الحالي).
    2. مدة النبض: ([الصف الأخير من النبض] - [الصف الأول من النبضة [-صف واحد]])/1000 لكل نبضة (من الوقت بالمللي ثانية العمود).
    3. إجمالي وقت التجربة: [الوقت في بداية النبضة الأخيرة] - [الوقت في نهاية النبضة الأولى بعد ضغط الغرفة] (من عمود الوقت بالدقائق).
  4. ثم احسب نقل الشحنة (Q) لكل نبضة (متوسط المدة الحالية X)
  5. اجمع الشحنة من جميع النبضات لحساب إجمالي الشحن (Qtot).

7. تحليل استهلاك O2

  1. قم بإعداد جدول بيانات جديد لجميع البيانات وأدخل أو احسب ما يلي لكل غرفة:
    1. Qtot (إجمالي الرسوم)
    2. الشامات (= س ÷ 96485 × 4)
    3. مل O2 (= مول × 22413 مل / مول)
    4. إجمالي الوقت (من تحليل البيانات أعلاه)
    5. مل دقيقة -1 (= مل O2 ÷ الوقت الإجمالي)
    6. الوزن بالجرام (الذباب المخدر ووزنه يقاس بعد التجربة)
    7. مل دقيقة-1 g-1 (= مل دقيقة-1 وزن ÷ بالجرام)
    8. مل / ساعة / ز (× أعلاه 60)
    9. ملغم / ذبابة (= وزن الذباب ÷ عدد الذباب)
    10. μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ عدد الذباب).
  2. جدولة البيانات لكل علاج (النمط الجيني ، على سبيل المثال)
  3. قارن بين العلاجات باستخدام ANOVA أو t-test أو Mann-Whitney u-test 13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض الضغط ومخرجات التيار لوحدة التحكم في مقياس التنفس لغرفة واحدة في تجربة واحدة في الشكل 3 أ. ضغطت النبضة الأولى الطويلة الحالية على الغرفة من الضغط المحيط (حوالي 992 هيكتوباسكال) إلى عتبة إيقاف التشغيل المحددة مسبقا البالغة 1017 هيكتوباسكال. عندما استهلك الذباب O 2 وتم امتصاص CO 2 ، انخفض الضغط ببطء حتى وصل إلى عتبة ON البالغة 1016 hPa ، والتي نشطت التيار من خلال مولد O2. في المثال الموضح، متوسط سعة كل نبضة هو 50.1 mA، والمدة 16.1 s، مما ينتج عنه نقل شح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الإجراء أعلاه قياس استهلاك O2 في D. Melanogaster باستخدام مقياس التنفس المجهري الكولومتري الإلكتروني. كانت البيانات الناتجة عن استهلاك O2 في D. melanogaster من النوع البري ضمن النطاقات الموصوفة في معظم المنشورات السابقة باستخدام طرق متنوعة (الجدول 1) على الرغم من أنها أقل إلى حد ما من تلك التي أبلغ عنها الآخرون 3,6.

تناولت الخطوات الحاسمة الشرطين المطلقين للطريقة: الختم المح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة ليندا ريستيفو في جامعة أريزونا على اقتراحها اختبار استهلاك O2 من طفرات CASK ولإرسال طفرات CASK وضوابطها الملائمة. تم توفير رسوم النشر من قبل صندوق إعادة الاستثمار الإداري من قسم الأحياء في جامعة كوليدج بارك. تم توفير المساحة وبعض المعدات من قبل الجامعات في Shady Grove.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
19/22 محول ميزان الحرارةWilmad-LabglassML-280-702قابس مستشعر
2 مل أنابيب لولبيةفيشر3464O2< / sub> مولد
2 دبوسZyamy40PIN-RFB10O2< / sub> مولد: قطع إلى 2 دبوس
4 دبوس أنثى موصلTE Connectivity215299-4قابس مستشعر
5 مل 352063 قطع أنبوب البولي بروبلينفالكونإلى 5.5 سم ومثقوب   ؛
50 مل Schlenk Tube 19/22 JointLaboyHMF050804Chamber
6-Conductor CableZenith6-Conductor 26 gaCable
6-Pin أنثى الحاجز موصلSwitchcraft17982-6SG-300وحدة تحكم
6-دبوس أنثى موصلSwitchcraft18982-6SG-522قابس الاستشعار
6-دبوس ذكر موصلSwitchcraft16982-6PG-522كابل
800 ul أنبوب الطرد المركزيفيشر05-408-120خرطوشة الجير الصودا
ABS الضميمة البلاستيكيةبرعم الصناعاتPS-11533-Gوحدة تحكم
Arduino Nano كلوحدة تحكم Arduino LLCABX00028
BME 280 SensorDIYMallFZ1639-BME280لوحة دوائر الاستشعار
Lheng5 × 7 سموحدة تحكم
كبريتات النحاسBioPharmBC2045O2< / sub> مولد
الكمبيوترAzulleByte4اكتساب البيانات
لفات القطنKajukajudo# 2قطع إلى نصفين لتوصيل أنابيب الذبابة
قطع في أرباع للرطوبة
غرفة بيئيةPercivalI30 VLC8Fly Care
EpoxyJB WeldPlastic Bonderأقطاب كهربائية آمنة في O2< / sub> مولد
يطير الغذاءمختبر ExpressType RFly Care
Keck Clampsuxcella20092300ux0418يؤمن المفصل الزجاجي للغرفة لتوصيل
قابس مستشعر الإيبوكسي منخفض اللزوجةE-30CLشاشة
OLEDIZOKEEIZKE31-IIC-WH-3تحكم
سلك بلاتيني 24 gauGems14349O2< / sub> مولد
شحم سيليكونداو كورنينجأختام الشحوم عالية الفراغوصلة الغرفة
توصيل الصودا الجيرJorvetJO553CO2< / sub> امتصاص
التبديلE-Switch100SP1T1B1M1QEHتحكم
كابل USBSabrentCB-UM63وحدة تحكم
USB HubAtollaHub 3.0قم بتوصيل وحدات التحكم بالكمبيوتر
حمام مائيAmersham56-1165-33التحكم في درجة الحرارة
خزان حمام المياهأقفاص زجاجية15 لتر حمام أكريليك بدون إطارلمقاييس التنفس
وحدة تبديل وحدة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
  2. Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626(2020).
  3. Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
  4. Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. , Oxford University Press. Oxford. (2019).
  5. Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452(2018).
  6. Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
  7. Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
  8. Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285(2021).
  9. Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681(2014).
  10. Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
  11. Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606(2022).
  12. Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966(2022).
  13. Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312(2020).
  14. Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
  15. Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
  16. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
  17. Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513(2012).
  18. Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
  19. Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
  20. Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
  21. Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
  22. Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
  23. Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة