Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

تمتلك Agrobacterium tumefaciens، وهي بكتيريا سالبة الجرام تنقلها التربة، قدرة فريدة على نقل الجينات بين المملكة، مما أكسبها لقب "مهندس وراثي طبيعي^"1. يمكن لهذه البكتيريا نقل الحمض النووي (T-DNA) من البلازميد الذي يحفز الورم (Ti-Plasmid) إلى الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز من النوع الرابع ، مما يؤدي إلى تكامل الحمض النووي التائي والتعبير عنه داخل جينوم المضيف¹،²،^3،4. في البيئة الطبيعية ، تؤدي هذه العملية إلى تكوين الورم في النباتات ، والمعروف باسم مرض المرارة التاجية. ومع ذلك ، يمكن ل Agrobacterium أيضا نقل T-DNA إلى كائنات حية أخرى مختلفة ، بما في ذلك الخميرة والفطريات والطحالب وأجنة قنفذ البحر وحتى الخلايا البشرية في ظل ظروف المختبر⁵،⁶،^7،8.

باستغلال هذا النظام الطبيعي ، يتيح التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) التكامل العشوائي للجين (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للخلية المضيفة عن طريق تعديل منطقة T-DNA في Ti-plasmid. لهذا الغرض ، فإن ناقل التعبير النباتي AMT المستخدم على نطاق واسع هو pCAMBIA1302⁹. يمكن للباحثين استخدام تدفقات عمل استنساخ بسيطة في الإشريكية القولونية قبل نقل المتجه المطلوب إلى A. tumefaciens لنقله لاحقا إلى المضيف محل الاهتمام.

الطحالب الدقيقة الخضراء هي حقيقيات النوى التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع النباتات البرية ولكنها متمردة للغاية على التعديل الوراثي. ومع ذلك ، يلعب التحول الجيني دورا حاسما في كل من البحوث الأساسية والتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة. في العديد من أنواع الطحالب الدقيقة ، وخاصة Chlamydomonas reinhardtii ، نجح التحول الجيني عبر AMT في إدخال جينات محورة مثل إنترلوكين -2 البشري (hIL-2) ، ومجال ربط مستقبلات فيروس كورونا 2 للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2 RBD) ، واثنين من الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) ¹⁰،¹¹،^12،13. من بين هذه الأنواع ، شلوريلا الشائع ، وهو نوع من الطحالب الخضراء أقل سرعة وأسرع نموا ، يحمل إمكانات كبيرة للإنتاج المستدام للكربوهيدرات والبروتينات والمغذيات والأصباغ وغيرها من المركبات عالية القيمة¹⁴. ومع ذلك ، فإن عدم وجود أدوات موثوقة لإنشاء سلالات معدلة وراثيا من C. vulgaris يعوق تقدمها التجاري. نظرا لوجود عدد محدود فقط من الأعمال المنشورة التي تستخدم AMT في C. vulgaris¹⁵ ، وبالنظر إلى الاختلافات الكبيرة بين زراعة النباتات والطحالب الدقيقة ، يصبح تحسين بروتوكول AMT ضروريا.

في هذه الدراسة ، أدخل الباحثون بروتين الفلورسنت الأخضر (mGFP5) في اتجاه مجرى فيروس فسيفساء القرنبيط (CamV) 35S المروج وأضافوا علامة الهستيدين لاستخدامها كجين مراسل للتعبير عن البروتين. تم اختيار المحولات باستخدام Hygromycin B ، وبعد الاستزراع الفرعي لأكثر من عشرين جيلا ، ظل التحول مستقرا. يمكن تكييف بلازميد pCAMBIA1302 المستخدم في هذا العمل بسهولة لاحتواء أي جين مهم. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل الطريقة والمواد المقدمة لأنواع الطحالب الخضراء الأخرى باستخدام مروج CamV35S نشط ، حيث يتم استخدام هذا المروج لاختيار Hygromycin.

يجب تعقيم جميع الوسائط والحلول قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب أن تكون جميع أنابيب الطرد المركزي ، وأطراف الماصة ، وما إلى ذلك ، معقمة أو معقمة قبل الاستخدام. لسهولة الرجوع إليها ، يتم سرد وصفات الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.

1. تحضير خلايا A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية

1. تلقيح Agrobacterium (AGL-1) في دورق شاكر معقم سعة 25 مل من وسائط LB (مكمل بالريفامبيسين ، 20 مجم / لتر -1) من مخزون الجلسرين المجمد وينمو طوال الليل عند ^28-30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: سلالة Agrobacterium AGL-1 (انظر جدول المواد) مقاومة للريفامبيسين والأمبيسلين والكلورامفينيكول والستربتومايسين ويمكن الحصول عليها من العديد من الموردين.
2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف المزرعة بمقدار 1،00،000 ضعف عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من الاستزراع الليلي إلى 50 مل من الماء النقي للغاية المعقم ونشر 10 ميكرولتر من هذه المزرعة المخففة على طبق LB ، ثم احتضانها عند 28-30 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
3. اختر مستعمرة وابدأ استزراع 20 مل بين عشية وضحاها في LB مع ريفامبيسين عند 28-30 درجة مئوية.
4. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 500 مل LB media (بدون مضاد حيوي) في دورق شاكر مع 9 مل من المزرعة الليلية وتنمو عند 28-30 درجة مئوية حتى يصل OD₆₀₀ إلى 0.5.
5. قسم المزرعة بالتساوي إلى عشرة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل واتركها تبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
6. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحبيبات في كل أنبوب في 50 مل من الماء المثلج.
7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 25 مل من الماء المثلج في كل أنبوب.
8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجات مئوية و 4000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الجلسرين المثلج البارد 10٪ (وزن / حجم) في كل أنبوب.
9. الجمع بين جميع الأنابيب في أنبوب واحد 50 مل وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4 °C و 4000 × غرام لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من الجلسرين المثلج البارد بنسبة 10٪ (وزن / حجم). يجب أن يكون تركيز الخلية حوالي 1-3 × 10¹⁰ خلايا / مل.
10. قم بتوزيع الخلايا على شكل حصص 50 ميكرولتر في أنابيب دقيقة معقمة مبردة. تجمد في النيتروجين السائل وتخزن في فريزر -80 درجة مئوية.

2. التثقيب الكهربائي ل A. tumefaciens

1. أضف 50 ميكرولتر من خلايا AGL-1 A. tumefaciens ذات الكفاءة الكهربائية إلى كوفيت 0.1 مم مبرد مسبقا وأضف 2 ميكرولتر من pCAMBIA1302 أو بلازميد مماثل (conc 15 نانوغرام / ميكرولتر) (انظر جدول المواد).
2. إلكتروبورات عند 2400 فولت باستخدام مثقاب كهربائي (200 Ω ، موسع السعة 250 μFD ، السعة 25 μFD ، الاضمحلال الأسي ، انظر جدول المواد). يجب أن يكون ثابت الوقت >4.5 مللي ثانية للتثقيب الكهربائي الناجح مع الاضمحلال الأسي.
3. أضف على الفور 1 مل من وسائط LB إلى الكوفيت وماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. انقل 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل واحتضانه عند 28-30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل للتعافي.
4. ضع الخلايا على أجار LB الذي يحتوي على المضاد الحيوي المناسب (أي 50 مجم / لتر من الكانامايسين ل pCAMBIA1302 للانتقاء بدائي النواة).
5. احتضان في 28-30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
6. اختر مستعمرة واحدة ، وتنمو بين عشية وضحاها في LB مع الاختيار المناسب (50 مجم / لتر من الكانامايسين ل pCAMBIA1302) ، وتحفظ السلالة المحتوية على البلازميد بالتبريد باستخدام 50٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. AMT من C. الشائع

ملاحظة: قم بإعداد C. vulgaris (UTEX 395 ، انظر جدول المواد) و A. tumefaciens الثقافات بالتوازي للزراعة المشتركة. يجب أن تبدأ ثقافات C. vulgariقبل 3 أيام من إعداد ثقافات A. tumefaciens. تم تعديل البروتوكول بناء على البروتوكول الذي نشره Kumar et ^al.7.

1. إعداد ثقافة C. الشائع
   1. يتم تخزين C. vulgaris تقليديا على المنحدرات أو الاحتفاظ بها في ثقافات المرحلة اللوغاريتمية في ظروف مضيئة. من استزراع طور اللوغاريتم عند OD₆₀₀ = 1.0 ، انشر 0.5 مل على ألواح أجار Tris-Acetate-Phosphate (TAP ، انظر الجدول 1) (1.2٪ وزن / v agar A) وتنمو لمدة 5 أيام عند 25 درجة مئوية مع الإضاءة (50 μE / m²s). هذا سوف ينتج ما يقرب من 5 × 10⁶ خلايا.
2. تحضير ثقافة A. tumefaciens
   1. تنمو سلالة A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 في دورق شاكر عن طريق تلقيح 10 مل من وسائط LB المكملة ب 15 مللي مول من الجلوكوز و 20 مجم / لتر ريفامبيسين و 50 مجم / لتر كاناميسين (انظر جدول المواد) باستخدام مخزون الجلسرين. احتضان في 28-30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
   2. تلقيح 1 مل من الاستزراع الليلي إلى 50 مل من LB مع 15 مللي مول من الجلوكوز و 20 ملغ / لتر ريفامبيسين و 50 ملغ / لتر كاناميسين واحتضانها عند 28-30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD₆₀₀ إلى 1.0.
3. Cocultivate C. vulgaris و A. tumefaciens
   1. لتحضير استزراع A. tumefaciens للزراعة المشتركة ، انقل الاستزراع المزروع إلى أنبوب 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة واغسل الخلايا مرتين بوسط الحث.
      ملاحظة: وسائط الحث المستخدمة هي وسائط TAP معدلة على الرقم الهيدروجيني 5.5 وتستكمل بمعادن وفيتامينات متوسطة F/2 مع 200 ميكرومتر أسيتوسيرينجون (AS، انظر جدول المواد). أعد تعليق الخلايا في وسائط الحث بحيث يكون OD₆₀₀ = 0.5.
   2. لتحضير ثقافة C. vulgaris للزراعة المشتركة ، أضف 25 مل من وسائط الحث إلى لوحة C. vulgaris التي تحتوي على ~ 5 × 10⁶ خلايا. نقل إلى أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4000 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من المادة الطافية.
   3. امزج حبيبات الخلايا الطحلبية مع 200 ميكرولتر من المعلق البكتيري (OD₆₀₀: 0.5) واحتضانها في شاكر دوار عند 21-25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
   4. انشر المستنبتة المختلطة (200 ميكرولتر) على ألواح وسائط الحث المكملة بجلوكوز 15 مللي متر واحتضانها عند 21-25 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 أيام.
   5. بعد 3 أيام، استخدم 10 مل من وسائط TAP المكملة ب 400 ملغم/لتر سيفوتاكسيم أو 20 ملغ/لتر من التتراسيكلين (انظر جدول المواد) لجمع الطحالب الدقيقة وحضنها في الظلام عند 21-25 درجة مئوية لمدة يومين للقضاء على A. tumefaciens من المستزرع.
   6. صفيحة 500 ميكرولتر من المستنبتة على وسائط انتقائية ، على سبيل المثال ، وسائط TAP مكملة ب 20-70 مجم / لتر من Hygromycin B (عند استخدام pCAMBIA1302) و 400 مجم / لتر -¹ سيفوتاكسيم أو 20 مجم / لتر من التتراسيكلين. احتضان 21-25 درجة مئوية في الظلام لمدة يومين قبل وضعها في غرفة مضيئة.
      ملاحظة: ستظهر المستعمرات المقاومة بعد 5-7 أيام من التعرض للضوء.
   7. اختر مستعمرات مفردة من لوحة التحويل وأعد ربطها على ألواح أجار TAP مكملة ب 400 مجم / لتر من سيفوتاكسيم أو 20 مجم / لتر من التتراسيكلين و 20-70 مجم / لتر من Hygromycin B.

4. مستعمرة PCR (cPCR) لتأكيد التكامل الجيني في محولات C. vulgaris

1. استخرج الحمض النووي الجينومي من محول C. vulgaris بعد الاستزراع الفرعي مرتين على الأقل من مستعمرة واحدة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي النباتي (انظر جدول المواد). باستخدام هذا كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم الاشعال لمنطقة mgfp5 من T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3 '، و M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
   1. باستخدام مجموعة مزيج بوليميراز الحمض النووي الرئيسي عالي الدقة Q5 (انظر جدول المواد) ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتحقق من تكامل الجينات المحورة.
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورة (98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدم pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي والحمض النووي الجيني C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي.
2. للتأكد من عدم وجود pCAMBIA1302 في العينة بسبب التلوث المتبقي بواسطة A. tumefaciens، استخدم مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل. أضف كمية صغيرة من الخلايا المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم واغلي عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم هذا كقالب ل PCR.
   1. تصميم الاشعال لمنطقة خارج T-DNA على pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' و B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 48 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) ؛ 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. استخدم مستعمرة مسلوقة من A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) كعنصر تحكم إيجابي ومستعمرة مسلوقة من النوع البري C. vulgaris كعنصر تحكم سلبي.
3. للتأكد من عدم وجود تلوث A. tumerfaciens في العينة ، استخدم مستعمرة PCR. أضف كمية صغيرة من الخلايا المحولة إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم واغلي عند 98 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم هذا كقالب ل PCR.
   1. تصميم الاشعال لجين virE2 الموجود على بلازميد الفوعة AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' و virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية لهذه الدراسة: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 30 دورة (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 53 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) ؛ 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. استخدم مستعمرة مسلوقة من A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) كعنصر تحكم إيجابي ومستعمرة مسلوقة من النوع البري C. vulgaris كعنصر تحكم سلبي.
4. قم بتشغيل عينات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أغاروز الحمض النووي جنبا إلى جنب مع سلم (سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت ، انظر جدول المواد) لتأكيد حجم الأجزاء الناتجة¹⁶.

5. قياس مضان المحولات

1. تلقيح كل محول من مزرعة صيانة في مرحلة السجل أو ميل أجار TAP إلى 50 مل من TAP المكمل ب 200 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم و 25 مجم / لتر -1 هيجروميسين ب بحيث يكون OD₆₀₀ = ^0.1. تلقيح مزرعة واحدة مع النوع البري C. vulgaris وفقط 200 ملغ / ^L-1 سيفوتاكسيم كعنصر تحكم سلبي. احتضان عند 25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة مع 150 ميكرومول / م²ثانية من الضوء النشط ضوئيا (انظر جدول المواد).
2. كل 24 ساعة ، خذ عينة 300 ميكرولتر وقم بقياس الامتصاص والتألق (الإثارة 488 نانومتر ، الانبعاث 526 نانومتر) في قارئ لوحة 96 بئرا أو مطياف الأشعة المرئية والأشعة المرئية ومقياس الفلور (انظر جدول المواد). استخدم صفيحة سوداء ذات قاع شفاف للقياسات المتزامنة.

6. استخراج البروتين الخام ، تنقية البروتين ، والرحلان الكهربائي SDS-PAGE

1. تلقيح المحول (# 50) من ثقافة صيانة لوغاريتمية المرحلة إلى 300 مل من TAP مكملة ب 200 مجم / لتر -1 سيفوتاكسيم و 25 مجم / لتر -1 هيجروميسين ب للوصول إلى OD₆₈₀ = ^0.1. تلقيح مزرعة واحدة مع النوع البري C. vulgaris وفقط 200 ملغ / ^L-1 سيفوتاكسيم كعنصر تحكم سلبي. احتضان عند 25 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة مع 150 ميكرومول / م²ثانية من الضوء النشط ضوئيا.
2. استخرج عينة البروتين الخام من المحول (# 50) والسلالات البرية باستخدام مخزن تحلل 5 مل (انظر الجدول 1) ، متبوعا بصوتنة لمدة 4 دقائق.
3. تنقية عينة البروتين الخام باستخدام راتنج Ni-NTA من خلال أعمدة البولي بروبلين سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
4. التجفيد لعينات البروتين المنقى 15 مل وإعادة تعليقها في محلول تحلل 1 مل لتحليل SDS-PAGE¹⁷.

لإظهار التحول الناجح باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه ، تم استزراع C. vulgaris إما مع AGL-1 الذي يحتوي على بلازميد pCAMBIA1302 أو بدون البلازميد (من النوع البري ومطلي على أجار TAP المكمل ب Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1 أ). تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليسار المستعمرات المحولة القادرة على النمو على ألواح Hygromycin B / cefotaxime ، وتظهر اللوحة الوسطى أن AGL-1 من النوع البري لا يمكن أن ينمو على ألواح Hygromycin B / cefotaxime. تظهر اللوحة الموجودة في أقصى اليمين أنه عند عدم استخدام أي اختيار (سيفوتاكسيم فقط) ، يمكن أن تنمو محولات C. vulgaris والنوع البري. تم وضع مستعمرات مفردة على أجار TAP مع Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1B). تم تلقيح المستعمرات الهاربة من الصفيحة الموجودة في أقصى اليمين (الشكل 1 ب) على سائل TAP باستخدام Hygromycin B و cefotaxime (الشكل 1C). بسبب مستويات التعبير المتغيرة بعد التكامل العشوائي ل T-DNA ، تم استرداد المحولات في الأصل على ألواح ذات تركيزات متزايدة من Hygromycin B تتراوح من 25-70 مجم / لتر. نمت مستعمرة واحدة من كل صفيحة في وسط TAP سائل يحتوي على نفس تركيز Hygromycin B جنبا إلى جنب مع النوع البري C. vulgaris عند أدنى تركيز (الشكل 1D). لا يمكن أن تنمو C. vulgaris من النوع البري في وجود Hygromycin ، بينما تم الحصول على مستعمرات مقاومة تصل إلى 70 مجم / لتر.

للتأكد من أن كاسيت T-DNA قد تم دمجه بثبات في جينوم C. vulgaris ، تم اختيار مستعمرة واحدة من كل من ألواح Hygromycin B 20 و 25 و 30 و 50 و 70 مجم / لتر عن طريق الخطوط المتكررة على ألواح أجار TAP مع الاختيار مرتين ثم تمت زراعتها بشكل روتيني في وسائط TAP أكثر من عشر مرات ، المسمى المحول # 20 و # 25 و # 30 و # 50 و # 50 و # 70 على التوالي. باستخدام هذه الثقافات ، تم إجراء كل من مستعمرة PCR لاستبعاد التلوث بواسطة pCAMBIA1302 في AGL1 ، وتم استخراج الحمض النووي الجينومي لتأكيد وجود جين mGFP5 في جينوم C. vulgaris. في الشكل 2 أ ، تم إجراء مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التي تستهدف منطقة 5 كيلو بايت خارج الحدود اليسرى واليمنى ل T-DNA وتمكنت من تضخيم هذه المنطقة من بلازميد pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي ، لكن هذه المنطقة لم تكن موجودة في أي من عينات C. vulgaris التي تشير إلى أن الحمض النووي pCAMBIA1302 لم يكن موجودا في أي من الثقافات. تم استخدام عينة C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي ، ولم يلاحظ أي تضخيم.

تم استخراج الحمض النووي الجينومي من المحولات # 25 و # 50 و # 70 ، وتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما أدى إلى تضخيم منطقة 1763 bp تحتوي على جين mgfp5 من T-DNA لتأكيد التكامل في المحولات (الشكل 2B). تم استخدام pCAMBIA1302 كعنصر تحكم إيجابي ، وتم الكشف عن التضخيم في جميع المحولات ، مما يشير إلى أن جين mgfp5 كان موجودا في جميع الحمض النووي الجيني للمحولات. تم استخدام C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي ، ولم يلاحظ أي تضخيم. يوضح الشكل 2C تضخيم جزء 600 bp من بروتين الفوعة E2 (VirE2) الموجود في البلازميد المسبب للورم (Ti plasmid) من سلالة AGl1. تم تضخيم السيطرة الإيجابية ، التي تتكون من سلالة AGl1 التي تحتوي على pCAMIA1302 ، بنجاح باستخدام الاشعال ، مما يشير إلى وجود A. tumefaciens في العينة. ومع ذلك ، فإن جميع عينات C. vulgaris كانت سلبية لهذه المنطقة ، مما يشير إلى أن الاستزراع الفرعي المتكرر على سيفوتاكسيم نجح في القضاء على تلوث AGL1 من الثقافة. تم استخدام عينة C. vulgaris من النوع البري كعنصر تحكم سلبي ، ولم يلاحظ أي تضخيم. مجتمعة ، تؤكد هذه الاختبارات الثلاثة أن T-DNA الذي يحتوي على mgpf5 قد تم إدخاله في جينوم C. vulgaris ، ولم تكن هذه النتائج بسبب تلوث AGL1 في العينات ولا بسبب وجود pCAMBIA1302 في الخلايا. تكررت هذه النتائج بعد 20 وحوالي 100 مزرعة فرعية من المحولات تؤكد التكامل طويل الأمد للحمض النووي التائي في الجينوم.

أخيرا ، تم تأكيد النمط الظاهري من خلال تنمية المحولات في وسائط TAP مع الاختيار وقياس التألق. تمت مقارنة هذا بالنوع البري C. vulgaris. بسبب امتصاص الخلفية / التألق الذاتي للكلوروفيل ، تمت مقارنة التألق عن طريق تطبيع البيانات إلى سلالة النوع البري. في الشكل 3 أ ، يمكن ملاحظة أن هناك فرقا ملحوظا في النمو بين المحولات والنوع البري C. vulgaris. يمكن أن يعزى ذلك إلى عمليات التكامل العشوائية المتعددة للحمض النووي التائي في الجينوم ، مما قد يؤثر على العمليات الخلوية الأخرى ويؤدي إلى تباطؤ النمو. ومع ذلك ، يسلط الشكل 3B الضوء على أنه على الرغم من انخفاض النمو ، فإن جميع السلالات المختارة تظهر مستويات مضان أعلى عند تطبيعها لكثافة الخلية. والجدير بالذكر أن السلالة # 70 أظهرت مستويات مضان أعلى بكثير من غيرها ، مع قيمة p تبلغ <0.01. هذا يؤكد على أهمية فحص العديد من المستعمرات لتحديد المحولات التي تعبر عن البروتين المطلوب دون التأثير سلبا على سلوك النمو العام.

لتأكيد تعبير mGFP5-6xHis، تم استخدام SDS-PAGE لتحليل مستخلص البروتين الخام والبروتينات المنقاة من كل من C. vulgaris (WT) و C. vulgaris transformant (# 50). بعد ذلك ، تم إجراء تنقية البروتين باستخدام مجموعة تدفق الجاذبية لراتنج Ni-NTA وفقا لبروتوكولالشركة المصنعة 18. يوضح الشكل 4 وجود بروتين mGFP5-6xHis (~ 30 كيلو دالتون) في عينة المحول # 50 ولا يوجد بروتين في التحكم السلبي (WT C. vulgaris).

الشكل 1: استعادة محولات C. vulgaris بعد AMT. (A) بعد الزراعة المشتركة ل C. vulgaris ، تكون المحولاتAGL-1 تحتوي على بلازميد pCAMBIA أو بدون البلازميد (AGL-1 فقط) على ألواح انتقائية. (ب) مستعمرات مفردة معاد تخطيطها مختارة من ألواح Hygromycin B (20 مجم / لتر) على أجار TAP انتقائي. (ج) تفتقر المستعمرات الهاربة إلى النمو من صفيحة AGL1 فقط على الوسائط السائلة Hygromycin B (20 مجم / لتر). (د) نمو المستعمرات الفردية # 25 و # 50 و # 50 من ألواح اختيار Hygromycin المزروعة في وسائط TAP السائلة التي تحتوي على Hygromycin و C. vulgaris من النوع البري والتي لا يمكن أن تنمو في وسائط Hygromycin. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الكشف عن تلوث pCAMBIA1302 . (أ) تكامل الحمض النووي التائي في المحولات (ب) والكشف عن تلوث A. tumefaciens (C). يشير WT إلى النوع البري C. vulgaris ، والكمبيوتر الشخصي هو عنصر التحكم الإيجابي (pCAMBIA1302) ويشير AGL1 إلى سلالة A. tumefaciens AGL1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نمو وتألق المحولات في 3 أيام بعد التلقيح. أ: النمو مقيسا بالامتصاص عند 680 nm. (ب) التألق الطبيعي للسلالة البرية. متوسط 3-4 مكررات بيولوجية ، تمثل أشرطة الخطأ 1 σ. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 عند مقارنتها بالنوع البري (WT). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل SDS-PAGE ل mGFP5-6xتعبيره في C. vulgaris (WT) وتحويل عينة C. vulgaris # 50. تم تحضير المستخلصات من الخام ، المنقى (الغسيل الأول) ، المنقى (المخفف) ، المنقى (المركز) من C. vulgaris (WT) ، الممرات 1-4 ، على التوالي. الخام ، المنقى (الغسيل الأول) ، المنقى (المثقوب) ، والمنقى (المجفف بالتجميد) من C. vulgaris (WT) ، الممرات 5-8 ، على التوالي. يشير المربع الأحمر إلى بروتين GFP-6xHis المنقى من المحول # 70. تم فصل البروتينات على هلام بولي أكريلاميد 12 ٪. تظهر الأوزان الجزيئية (MWs) لمعايير البروتين (Std.) على اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات الوسائط والمخزن المؤقت.

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.