Method Article

النشاط المساعد للمتفطرة نظيرة السل في تعزيز مناعة المستضدات الذاتية أثناء التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

DOI:

10.3791/65422

⸱

May 12th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا بديلا للحث بنشاط على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 ، باستخدام البروتين السكري قليل التغصن قليل التغصن المناعي (MOG) 35-55 المعلق في مساعد فرويند غير المكتمل الذي يحتوي على المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة paratuberculosis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الناجم عن البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) التحصين بواسطة ببتيد MOG المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA) الذي يحتوي على المتفطرة السلية المعطلة. تعمل المكونات المستضدية للمتفطرة على تنشيط الخلايا المتغصنة لتحفيز الخلايا التائية لإنتاج السيتوكينات التي تعزز استجابة Th1 عبر مستقبلات تشبه الرسوم. لذلك ، ترتبط كمية وأنواع المتفطرات الموجودة خلال التحدي المستضد ارتباطا مباشرا بتطور EAE. تقدم ورقة الطرق هذه بروتوكولا بديلا للحث على EAE في الفئران C57BL / 6 باستخدام مساعد Freund غير مكتمل معدل يحتوي على سلالة المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة سلالة السل K-10.

المتفطرة السلية، وهي عضو في مجمع المتفطرة الطيرية (Mycobacterium avium)، هي العامل المسبب لمرض جون في المجترات، وقد تم تحديدها كعامل خطر للعديد من الاضطرابات البشرية بوساطة الخلايا التائية، بما في ذلك التصلب المتعدد. وعموما، أظهرت الفئران المحصنة بالمتفطرة نظيرة السل بداية مبكرة وشدة مرض أكبر من الفئران المحصنة بداء السل الذي يحتوي على سلالة المتفطرة السلية H37Ra عند نفس الجرعات البالغة 4 ملغم/مل. تمكنت المحددات المستضدية لسلالة المتفطرة الطيرية (MAP) من سلالة K-10 من إحداث استجابة خلوية قوية Th1 خلال مرحلة المستجيب ، والتي تتميز بأعداد أكبر بكثير من الخلايا اللمفاوية التائية (CD4 + CD27 +) ، والخلايا المتغصنة (CD11c + I-A / I-E +) ، والوحيدات (CD11b + CD115 +) في الطحال مقارنة بالفئران المحصنة ب CFA. علاوة على ذلك ، يبدو أن استجابة الخلايا التائية التكاثرية لببتيد MOG هي الأعلى في الفئران المحصنة ضد السل. قد يكون استخدام الدماغ الليتفوت (على سبيل المثال ، MOG35-55) المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis في التركيبة طريقة بديلة ومثبتة لتنشيط الخلايا المتغصنة لتحضير الخلايا التائية CD4 + T الخاصة بالمايلين أثناء مرحلة تحريض EAE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع لدراسة اضطرابات إزالة الميالين البشرية1. هناك عدة نماذج من EAE: التحصين النشط باستخدام ببتيدات المايلين المختلفة مع المواد المساعدة القوية ، والتحصين السلبي عن طريق النقل في المختبر للخلايا الليمفاوية CD4 + الخاصة بالمايلين ، والنماذج المعدلة وراثيا ل EAE2 التلقائي. يحتوي كل نموذج من هذه النماذج على ميزات محددة تسمح بدراسة جوانب مختلفة من EAE ، مثل مرحلة البداية أو المستجيب أو المرحلة المزمنة. يعد نموذج البروتين السكري قليل التغصن النخاعي (MOG) ل EAE نموذجا جيدا لدراسة الآليات المناعية للالتهاب العصبي المزمن وإزالة الميالين ، حيث يتميز ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لكلية الطب بجامعة جونتيندو (رقم الموافقة 290238) وأجريت وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة للتجارب على الحيوانات.

1. تعليقات عامة على التجربة

  1. إيواء الفئران في أقفاص فردية في منشأة حيوانية في ظل ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض عند 23 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ ± 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
  2. حقن الفئران بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون مستضد و CFA ، واستخدمها كضوابط سلبية وإيجابية ، على التوالي.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحصين مجموعات من الفئران C57BL / 6 (المجموع n = 15 / مجموعة) مع MOG35-55 في مستحلب يحتوي على M. paratuberculosis أو بالطريقة الشائعة مع CFA. أظهرت جميع مجموعات الفئران مرضا أحادي الطور حادا يتميز بذروة واحدة من الإعاقة لوحظت في 14-17 يوما ، يليها انتعاش جزئي للأعراض خلال الأيام العشرة التالية (الشكل 1 أ). أظهرت الفئران المحصنة بالمادة المساعدة التي تحتوي على المتفطرة نظيرة السل ، بغض النظر عن الجنس ، بداية مبكرة من 8 إلى 9 أيام.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أظهرنا بروتوكولا بديلا قويا للحث بنشاط على EAE الشديد في الفئران C57BL / 6J باستخدام الببتيد MOG35-55 المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis10. أدى تحريض EAE بهذه الطريقة إلى مرض أكثر حدة من ذلك الناجم عن البروتوكول المشترك مع CFA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب المكونات الدهنية المختلفة في جدار الخلية من المتفطرات11. في الواقع ، على عكس المتفطرات الأخرى ، تنتج M. paratuberculosis مستضد ليبونستابيبتيد على سطح جدار الخلية بدلا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتلقى هذا العمل دعما من منحة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (المنحة رقم. JP 23K14675).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الأجسام المضادة CD115 المضادة للفأرBiolegend ، الولايات المتحدةالأمريكية 135505لقياس الفلور الخلوي 1: 1,000
الجسم المضاد CD11b المضادللفأر Biolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية101215لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
الجسم المضاد CD11c المضاد للفأرBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية117313لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
مضاد للفأر CD16 / 32   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية101302ل قياس الفلور الخلوي 1: 1,000
الأجسام المضادة للفأر CD4   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية116004لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
CD8a   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية100753لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
الأجسام المضادة I-A / I-E المضادة للفأرBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية107635لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
الأجسام المضادة للفأر Ly-6C   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية128023لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةBD 211886لعزل وزراعة البكتيريا
C57BL / 6J الفئرانمختبر نهر تشارلز ، اليابان3 أسابيع ، ذكور وإناث
FBS 10279-106Gibco Life Techologies ، الولايات المتحدة الأمريكية42F9155Kلزراعة الخلايا ، دافئة عند 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
تجميد التجفيفEyela ، طوكيو ، اليابانFDU-1200للتجميد بالبكتيريا
غير مكتمل e Freund' مختبرات ديفكو المساعدة ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدةالأمريكية 263810للاستخدام في مختبرات
Middlebrook 7H9 BrothDifco المساعدة ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية90003-876تساعد في نمو البكتيريا
المتفطرة الطيرية subsp. السل K-10ATCC ، الولايات المتحدة الأمريكيةBAA-968البكتيريا من أصل بقري
المتفطرة السلية H37 Ra ، المجففةBD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية743-26880-EAللاستخدام في
Mycobactin Jالمساعد ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةمحفز النمو
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55AnaSpec ، الولايات المتحدة الأمريكيةAS-60130-10الببتيد
Ovalbumin (257-264)Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةS7951-1MGمستضد التحكم السلبي   ؛ لمحلول
سموم السعال الديكيالتكاثري Fujifilm Wako ، أوساكا اليابان168-22471من البكتيريا سالبة الجرام Bordetella pertussi ، يزيد من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي
خيط Polytron PT 3100Kinematicaلخلط المستضد مع المساعد
RPMI 1640 مع L-glutamineGibco Life Techologies ، الولايات المتحدةالأمريكية 11875093لزراعة الخلايا
الثايميدين ، [Methyl-3< / sup>H] ، في 2٪ إيثانول ، 1 mCiPerkinElmer ، Waltham، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةNET027W001MCلفحص الانتشار ، الاستخدام (1 & mu; Ci / well)
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية423105  ؛ قياس الفلور الخلوي ، لصلاحية الخلية
الفطرية آلة الفطرية مختبر الدماغي للفحص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisMycobacterium ParatuberculosisAdjuvant ActivityMOG PeptideIncomplete Freund s AdjuvantDendritic Cell ActivationTh1 ResponseT Lymphocyte ProliferationNeuroinflammation ModelCytokine Production

Related Articles