يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

النشاط المساعد للمتفطرة نظيرة السل في تعزيز مناعة المستضدات الذاتية أثناء التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65422

⸱

مايو 12, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا بديلا للحث بنشاط على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 ، باستخدام البروتين السكري قليل التغصن قليل التغصن المناعي (MOG) 35-55 المعلق في مساعد فرويند غير المكتمل الذي يحتوي على المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة paratuberculosis.

الملخص

يتطلب التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الناجم عن البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) التحصين بواسطة ببتيد MOG المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA) الذي يحتوي على المتفطرة السلية المعطلة. تعمل المكونات المستضدية للمتفطرة على تنشيط الخلايا المتغصنة لتحفيز الخلايا التائية لإنتاج السيتوكينات التي تعزز استجابة Th1 عبر مستقبلات تشبه الرسوم. لذلك ، ترتبط كمية وأنواع المتفطرات الموجودة خلال التحدي المستضد ارتباطا مباشرا بتطور EAE. تقدم ورقة الطرق هذه بروتوكولا بديلا للحث على EAE في الفئران C57BL / 6 باستخدام مساعد Freund غير مكتمل معدل يحتوي على سلالة المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة سلالة السل K-10.

المتفطرة السلية، وهي عضو في مجمع المتفطرة الطيرية (Mycobacterium avium)، هي العامل المسبب لمرض جون في المجترات، وقد تم تحديدها كعامل خطر للعديد من الاضطرابات البشرية بوساطة الخلايا التائية، بما في ذلك التصلب المتعدد. وعموما، أظهرت الفئران المحصنة بالمتفطرة نظيرة السل بداية مبكرة وشدة مرض أكبر من الفئران المحصنة بداء السل الذي يحتوي على سلالة المتفطرة السلية H37Ra عند نفس الجرعات البالغة 4 ملغم/مل. تمكنت المحددات المستضدية لسلالة المتفطرة الطيرية (MAP) من سلالة K-10 من إحداث استجابة خلوية قوية Th1 خلال مرحلة المستجيب ، والتي تتميز بأعداد أكبر بكثير من الخلايا اللمفاوية التائية (CD4 + CD27 +) ، والخلايا المتغصنة (CD11c + I-A / I-E +) ، والوحيدات (CD11b + CD115 +) في الطحال مقارنة بالفئران المحصنة ب CFA. علاوة على ذلك ، يبدو أن استجابة الخلايا التائية التكاثرية لببتيد MOG هي الأعلى في الفئران المحصنة ضد السل. قد يكون استخدام الدماغ الليتفوت (على سبيل المثال ، MOG35-55) المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis في التركيبة طريقة بديلة ومثبتة لتنشيط الخلايا المتغصنة لتحضير الخلايا التائية CD4 + T الخاصة بالمايلين أثناء مرحلة تحريض EAE.

المقدمة

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع لدراسة اضطرابات إزالة الميالين البشرية1. هناك عدة نماذج من EAE: التحصين النشط باستخدام ببتيدات المايلين المختلفة مع المواد المساعدة القوية ، والتحصين السلبي عن طريق النقل في المختبر للخلايا الليمفاوية CD4 + الخاصة بالمايلين ، والنماذج المعدلة وراثيا ل EAE2 التلقائي. يحتوي كل نموذج من هذه النماذج على ميزات محددة تسمح بدراسة جوانب مختلفة من EAE ، مثل مرحلة البداية أو المستجيب أو المرحلة المزمنة. يعد نموذج البروتين السكري قليل التغصن النخاعي (MOG) ل EAE نموذجا جيدا لدراسة الآليات المناعية للالتهاب العصبي المزمن وإزالة الميالين ، حيث يتميز بتسلل التهابي أحادي النواة ، وإزالة الميالين في المادة البيضاء المحيطية ، وتقليل الشفاء بعد ذروة المرض1.

يتم تحفيز MOG-EAE عن طريق تحصين الفئران الحساسة مع الببتيد MOG35-55 في مساعد فرويند الكامل (CFA) ، يليه حقن داخل الصفاق من سم السعال الديكي. هذا يزيد من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي ويسمح للخلايا التائية الخاصة بالمايلين التي يتم تنشيطها في المحيط بالوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث سيتم إعادة تنشيطها3. يلعب CFA دورا رئيسيا في تحريض EAE من خلال تعزيز امتصاص المستضد بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد والتعبير عن السيتوكينات المتعلقة بالاستجابات الخلطية والخلوية4. هذه الآلية ترجع أساسا إلى وجود المتفطرة السلية المقتولة المستحلبة في الزيت ، والتي توفر مكوناتها حافزا قويا لجهاز المناعة5. في الواقع ، يرتبط تحريض EAE ارتباطا مباشرا بكمية المتفطرة الموجودة خلال التحدي المستضد6.

إن إضافة المتفطرات المقتولة الأخرى ، مثل المتفطرة الزبدية ، إلى مساعدفرويند 7 غير المكتمل ، وكذلك تأثير المجموعات المساعدة8 ، يمكن أن يعدل المسار السريري ل EAE وبالتالي يؤثر على استنساخ النتائج. ارتبطت سلالات المتفطرة الطيرية نظير السل (MAP) ، العامل المسبب لمرض جون في المجترات ، بالاضطرابات الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي البشري 9 ، حيث أن مكوناته المستضدية قادرة على إثارة استجابة قوية بوساطة الخلط والخلايا في المرضى الذين يعانون من التصلب المتعدد واضطراب طيف التهاب النخاع والعصبالبصري 9. لذلك ، في هذا البروتوكول ، نعرض طريقة بديلة وقابلة للتكرار للحث على MOG-EAE عن طريق استبدال M. السل في CFA ب M. paratuberculosis.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لكلية الطب بجامعة جونتيندو (رقم الموافقة 290238) وأجريت وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة للتجارب على الحيوانات.

1. تعليقات عامة على التجربة

  1. إيواء الفئران في أقفاص فردية في منشأة حيوانية في ظل ظروف خاضعة للرقابة وخالية من مسببات الأمراض عند 23 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ ± 10٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
  2. حقن الفئران بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون مستضد و CFA ، واستخدمها كضوابط سلبية وإيجابية ، على التوالي.

2. إعداد المستضدات الفطرية

  1. تنمو سلالة M. paratuberculosis K-10 في وسط ميدلبروك السائل 7H9 المخصب ب 10٪ OADC (حمض الأوليك ، الألبومين ، سكر العنب ، الكاتالاز) ، 0.005٪ توين 80 ، و 2 مجم / لتر من الميكوباكتين J لمدة أسبوعين في قوارير زراعة الأنسجة T25 عند 37 درجة مئوية. تقييم نمو المستعمرة بانتظام عن طريق الفحص البصري.
    تنبيه: التعامل مع المتفطرة نظيرة السل في مرفق السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2).
  2. قم بتنمية دورق Erlenmeyer 500 مل من التخصيب مع تعليق 1.7 × 105 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل في حجم نهائي قدره 200 مل (نفس الوسط مثل الخطوة 2.1) في حاضنة اهتزاز لمدة أسبوع واحد.
    ملاحظة: نظرا لأن الكائنات الملوثة قد تؤثر على النتائج ، يجب تلقيح البكتيريا على الوسائط الصلبة Middlebrook 7H10 لتحديد مورفولوجيا المستعمرة والتحقق من النقاء بواسطة مجموعات الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR) ل M. paratuberculosis.
  3. قم بتعطيل المعلقات البكتيرية لمدة 5-10 دقائق عند 70 درجة مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق. اغسل الحبيبات الموزونة في برنامج تلفزيوني مرتين ، وقم بتعطيلها عن طريق الصوتنة ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  4. نقل بيليه إلى وعاء معقم وتجميدها مع الثلج الجاف أو النيتروجين السائل. نقل على الفور إلى غرفة التجفيف بالتجميد.
  5. تجميد جاف (4 ساعات عند -50 درجة مئوية تحت الفراغ) M. paratuberculosis وفقا لدليل الجهاز.
  6. في نهاية التجفيد ، قم بإزالة الحاوية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من مجفف التجميد ونقلها إلى مقعد التنظيف الحيوي. استخدم ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ لإزاحة كتل MAP المجففة الملتصقة بالجدار الداخلي للحاوية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ وسحقها بأكبر قدر ممكن من الدقة.
  7. وزن الخلايا المسحوقة باستخدام ميزان إلكتروني ووضعها يدويا في قنينة معقمة سعة 10 مل بتركيز 10 مجم / مل.
    ملاحظة: تم تحديد كثافة الخلية كجرام من الوزن الجاف لكل لتر من العينة. بعد 3 أسابيع ، يحتوي 1 ملغ (الوزن الرطب) من حبيبات الخلايا البكتيرية على حوالي 2.5 × 108 CFU.

3. إعداد مستحلب MOG 35-55

  1. قم بطحن محتويات قارورة واحدة من المتصورة السلية المجففة (10 ملغ) إلى مسحوق ناعم مع هاون ومدقة وأضف 10 مل إلى مساعد فرويند غير المكتمل للحصول على محلول مخزون 10 مجم / مل. يحفظ في درجة حرارة -4 درجة مئوية.
  2. قبل التحصين، خفف محلول المرق إلى تركيز نهائي قدره 4 ملغم/مل.
  3. خفف الببتيد MOG35-55 في ddH 2 O إلى تركيز نهائي قدره2ملغ / مل وخزن في -20 درجة مئوية.
  4. باستخدام الخالط ، امزج محلول MOG35-55 (2 مجم / مل) مع حجم متساو من المواد المساعدة (4 مجم / مل) من الخطوة 3.2 في أنبوب سعة 5 مل حتى يتم تشكيل مستحلب سميك. بعد كل 10 ثوان من الخلط ، ضع المحلول على الثلج لمدة 20 ثانية ، وقم بتدوير الأنبوب لاستعادة كل المحلول.
  5. انقل المستحلب إلى حقنة سعة 1 مل ، وأزل كل الهواء ، وأضف إبرة 27 جرام. المستحلب جاهز الآن للحقن.
    ملاحظه. نظرا لأن بعض فقدان المستحلب اللزج ل MOG35-55 يحدث أثناء التحضير ، فمن الأفضل تحضير 1.5 ضعف الكمية المطلوبة.

4. تحصين الحيوانات

  1. تخدير الحيوانات باستنشاق الأيزوفلوران لتقليل الضغط على الحيوانات.
  2. حقن المستحلب (200 ميكرولتر يحتوي على 200 ميكروغرام / فأر من MOG35-55) تحت الجلد في أسفل الظهر.
  3. تطبيق جرعة من سم السعال الديكي (100 ميكرولتر تحتوي على 200 نانوغرام/فأر) داخل الصفاق في اليومين 0 و2 بعد التحصين.
    تنبيه: سم السعال الديكي له تأثير قمعي متعدد على الجهاز المناعي. تجنب الابتلاع والتلامس مع العينين والجلد.

5. التقييم السريري

  1. مراقبة الفئران يوميا للوزن والعلامات السريرية. استخدم نظام التسجيل التالي: 0 = لا توجد علامات سريرية ؛ 1 = ذيل رخو ؛ 2 = ضعف منعكس التصحيح وضعف الأطراف الخلفية ؛ 3 = شلل كامل في الأطراف الخلفية ؛ 4 = شلل كامل في الأطراف الخلفية مع شلل جزئي في الأطراف الأمامية ؛ 5 = محتضر.
    ملاحظة: عند الملاحظة الأولية للعلامات السريرية ، يتم تزويد الحيوانات بإمكانية متزايدة للحصول على الماء والغذاء. يتم تليين القوارض وترطيبها ، ثم وضعها على أرضية القفص من قادوس الطعام. في حالة الحيوانات المجففة ، يتم إعطاء مكملات السوائل تحت الجلد ، أو يتم إعطاء ملاط القوارض عن طريق التزويج الفموي. إذا احتاج الفأر إلى هذا النوع من المساعدة لأكثر من 3 أيام ، إجراء القتل الرحيم.
  2. لتجنب أو تقليل الألم والضيق الحيواني ، استخدم نقاط النهاية البشرية التالية: فقدان وزن الجسم أكبر من 20٪ ، والنتيجة السريرية ≥4.0 ، وغياب رد الفعل الصحيح عند الدرجة 3 ، وعندما يكون الحيوان غير قادر على الوصول إلى العلف أو الماء لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: تم القتل الرحيم للفئران في اليوم 30 بعد تحريض EAE عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (≥150 ملغم / كغم).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تحصين مجموعات من الفئران C57BL / 6 (المجموع n = 15 / مجموعة) مع MOG35-55 في مستحلب يحتوي على M. paratuberculosis أو بالطريقة الشائعة مع CFA. أظهرت جميع مجموعات الفئران مرضا أحادي الطور حادا يتميز بذروة واحدة من الإعاقة لوحظت في 14-17 يوما ، يليها انتعاش جزئي للأعراض خلال الأيام العشرة التالية (الشكل 1 أ). أظهرت الفئران المحصنة بالمادة المساعدة التي تحتوي على المتفطرة نظيرة السل ، بغض النظر عن الجنس ، بداية مبكرة من 8 إلى 9 أيام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد أظهرنا بروتوكولا بديلا قويا للحث بنشاط على EAE الشديد في الفئران C57BL / 6J باستخدام الببتيد MOG35-55 المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis10. أدى تحريض EAE بهذه الطريقة إلى مرض أكثر حدة من ذلك الناجم عن البروتوكول المشترك مع CFA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب المكونات الدهنية المختلفة في جدار الخلية من المتفطرات11. في الواقع ، على عكس المتفطرات الأخرى ، تنتج M. paratuberculosis مستضد ليبونستابيبتيد على سطح جدار الخلية بدلا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

وتلقى هذا العمل دعما من منحة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (المنحة رقم. JP 23K14675).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة CD115 المضادة للفأرBiolegend ، الولايات المتحدةالأمريكية 135505لقياس الفلور الخلوي 1: 1,000
الجسم المضاد CD11b المضادللفأر Biolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية101215لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
الجسم المضاد CD11c المضاد للفأرBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية117313لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
مضاد للفأر CD16 / 32   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية101302ل قياس الفلور الخلوي 1: 1,000
الأجسام المضادة للفأر CD4   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية116004لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
CD8a   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية100753لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
الأجسام المضادة I-A / I-E المضادة للفأرBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية107635لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
الأجسام المضادة للفأر Ly-6C   الأجسام المضادةBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية128023لقياس فلور الخلوي 1: 1,000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةBD 211886لعزل وزراعة البكتيريا
C57BL / 6J الفئرانمختبر نهر تشارلز ، اليابان3 أسابيع ، ذكور وإناث
FBS 10279-106Gibco Life Techologies ، الولايات المتحدة الأمريكية42F9155Kلزراعة الخلايا ، دافئة عند 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
تجميد التجفيفEyela ، طوكيو ، اليابانFDU-1200للتجميد بالبكتيريا
غير مكتمل e Freund' مختبرات ديفكو المساعدة ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدةالأمريكية 263810للاستخدام في مختبرات
Middlebrook 7H9 BrothDifco المساعدة ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية90003-876تساعد في نمو البكتيريا
المتفطرة الطيرية subsp. السل K-10ATCC ، الولايات المتحدة الأمريكيةBAA-968البكتيريا من أصل بقري
المتفطرة السلية H37 Ra ، المجففةBD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية743-26880-EAللاستخدام في
Mycobactin Jالمساعد ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةمحفز النمو
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55AnaSpec ، الولايات المتحدة الأمريكيةAS-60130-10الببتيد
Ovalbumin (257-264)Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةS7951-1MGمستضد التحكم السلبي   ؛ لمحلول
سموم السعال الديكيالتكاثري Fujifilm Wako ، أوساكا اليابان168-22471من البكتيريا سالبة الجرام Bordetella pertussi ، يزيد من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي
خيط Polytron PT 3100Kinematicaلخلط المستضد مع المساعد
RPMI 1640 مع L-glutamineGibco Life Techologies ، الولايات المتحدةالأمريكية 11875093لزراعة الخلايا
الثايميدين ، [Methyl-3< / sup>H] ، في 2٪ إيثانول ، 1 mCiPerkinElmer ، Waltham، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةNET027W001MCلفحص الانتشار ، الاستخدام (1 & mu; Ci / well)
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية423105  ؛ قياس الفلور الخلوي ، لصلاحية الخلية
الفطرية آلة الفطرية مختبر الدماغي للفحص

المراجع

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
  8. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MOG Th1
النشاط المساعد للمتفطرة نظيرة السل في تعزيز مناعة المستضدات الذاتية أثناء التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.