فحص القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية

تعد بروتينات النقل الغشائي ضرورية للتواصل بين الخلايا، وكذلك للحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. من بين بروتينات نقل الأغشية ، تعمل القنوات الأيونية على دفع نمو الخلايا وتطورها والحفاظ على حالة الخلايا في البيئات الصعبة والمتغيرة. كما تم الإبلاغ عن القنوات الأيونية لدفع ودعم تطور الأورام الصلبة ، سواء بشكل منهجي أو في الجهاز العصبي المركزي (CNS)^1,2. على سبيل المثال ، قنوات KCa3.1 مسؤولة عن تنظيم إمكانات الغشاء والتحكم في حجم الخلية ، وهو أمر مهم في تنظيم دورة الخلية. تم الإبلاغ عن قنوات KCa3.1 المعيبة للمساهمة في الانتشار غير الطبيعي للخلايا السرطانية³. علاوة على ذلك ، قد تساهم القنوات الأيونية في الانتشار النقيلي للسرطانات. على سبيل المثال ، تشارك قنوات إمكانات المستقبلات العابرة (TRP) في تدفق الكالسيوم 2+ والمغنيسيوم²⁺. ينشط هذا التدفق العديد من الكينازات وبروتينات الصدمة الحرارية التي تعمل على تنظيم المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالورم ، والتي بدورها مهمة لبدء ورم خبيث للسرطان⁴.

نظرا لأن القنوات الأيونية يمكن أن تساهم في تطور السرطانات ، فقد تكون أيضا أهدافا لعلاج السرطان المرتبط بالأدوية. على سبيل المثال ، ترتبط مقاومة طرق العلاج ، بما في ذلك العلاج الكيميائي والعلاج المناعي الجديد ، بعدم تنظيم وظيفة القناة الأيونية⁵،^6،7. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر القنوات الأيونية كأهداف دوائية مهمة لإعاقة نمو وتطور السرطانات ، مع فحص الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة المعاد استخدامها (المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء) ، وكذلك البوليمرات الحيوية ، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة¹،²،^8،9. في حين كان هناك تقدم كبير على هذه الجبهة ، لا يزال اكتشاف دواء سرطان القناة الأيونية متخلفا. ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات الفريدة لدراسة القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية. على سبيل المثال ، هناك قيود تقنية في إعداد مقايسات الفيزيولوجيا الكهربية للمركبات بطيئة المفعول والاختلافات الزمنية في تنشيط القناة وعمل الدواء. علاوة على ذلك ، يمكن أن تعيق قابلية ذوبان المركبات التقدم أيضا ، حيث أن معظم أنظمة الفيزيولوجيا الكهربية الآلية المستخدمة عادة اليوم تستخدم ركائز كارهة للماء ، والتي قد تساهم في القطع الأثرية نتيجة الامتزاز المركب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاجات الجزيئية العضوية الحيوية الكبيرة مثل المنتجات الطبيعية والببتيدات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة تمثل تحديا تقنيا للفحص باستخدام فحوصات الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية¹⁰. أخيرا ، تظل الخصائص الكهربائية الحيوية للخلايا السرطانية غير مفهومة^{بشكل جيد 11}.

وفي الوقت نفسه ، غالبا ما يكون تلطيخ التألق المناعي للقنوات الأيونية أمرا صعبا. ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد هياكلها وسياقها في الغشاء ، مما يؤثر على القدرة على توليد واستخدام الأجسام المضادة لدراسات الفحص المجهري. من المهم بشكل خاص التحقق من صحة الأجسام المضادة المستخدمة لتلطيخ القنوات الأيونية للتأكد من خصوصيتها وتقاربها وقابليتها للتكاثر. يجب النظر في الأجسام المضادة التجارية للقنوات الأيونية بناء على استراتيجية التحقق من صحتها وسجل النشر. يجب أن تتضمن التجارب ضوابط سلبية لإثبات عدم وجود ارتباط غير محدد إما عن طريق ضربة قاضية أو خروج المغلوب من البروتين المستهدف. بدلا من ذلك ، قد تكون خطوط الخلايا التي يكون فيها البروتين المستهدف غائبا أو بوفرة منخفضة بناء على تحديد mRNA أو البروتين بمثابة ضوابط سلبية. على سبيل المثال ، تظهر هذه الدراسة توطين الوحدة الفرعية لمستقبلات (GABA) Gabra5 في خط خلايا الورم الأرومي النخاعي (D283). تم تلطيخ خلايا D283 ذات ضربة قاضية siRNA وخلايا Daoy ، وهي خط آخر من خلايا الورم الأرومي النخاعي المخيخي ، ل Gabra5 ولم تظهر أي تلطيخ ملموس (البيانات غير معروضة).

هنا ، يتم تقديم طرق لتحليل وفحص وظيفة القناة الأيونية ، وكذلك تأثير معدلات القناة الأيونية على الخلايا السرطانية. يتم توفير بروتوكولات ل (1) خلايا تلطيخ لقناة أيونية ، (2) اختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا ، (3) إنشاء وظيفة القناة الأيونية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية ، و (4) التحقق من صحة الأدوية في المختبر. تؤكد هذه البروتوكولات على دراسات مستقبلات حمض جاما أمينوبتيريك من النوع A (GABA_A)²،¹²،^13،14،¹⁵،^{16 ،} وقناة أنيون كلوريد ومستقبلات ناقل عصبي مثبط رئيسي. ومع ذلك ، فإن الطرق المعروضة هنا تنطبق على دراسة العديد من الخلايا السرطانية والقنوات الأيونية الأخرى.

1. القنوات الأيونية المناعية في الخلايا المستزرعة

1. تحضير الخلايا والإعداد التجريبي
   1. الحفاظ على الخلايا كثقافة تنمو بنشاط في قوارير ثقافة 75 سم² . قم بتمرير الخلايا مرة واحدة حتى تصبح متقاربة بنسبة 50٪ -90٪ ، اعتمادا على وقت مضاعفة خط الخلية المستخدم.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام خلايا D283 ، وهي خط خلايا الورم الأرومي النخاعي من المجموعة 3.
   2. اجمع الخلايا من دورق المزرعة في أنبوب طرد مركزي (15 مل أو 50 مل) ، وأضف 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA لفصل الخلايا الملتصقة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد 5 دقائق ، اضغط على القارورة ثلاث إلى خمس مرات للمساعدة في فصل الخلايا. جمع الخلايا في 10 مل من المتوسط مع 10 ٪ FBS لوقف عمل التربسين.
   3. جهاز طرد مركزي عند 480 × جم لمدة 5 دقائق في RT. نضح الوسط برفق. لا تزعج بيليه الخلية.
   4. أعد تعليق الخلايا في 5 مل إلى 10 مل من الوسط ، اعتمادا على كثافة الثقافة.
      ملاحظة: يجب أن تكون الكثافة متسقة مع الخلايا النامية بنشاط وتعتمد على التقاء الخلايا في القارورة. يجب استخدام التقييم البصري لتقريب كثافة الخلية المثلى ؛ على وجه التحديد ، يجب أن تكون الخلايا بين 40٪ -90٪ متقاربة وموزعة بالتساوي.
   5. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الخلايا ، وأضفها إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق لتمييز الخلايا غير القابلة للحياة. احتضان 5-15 دقيقة في RT ، اعتمادا على خط الخلية.
   6. عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم (انظر جدول المواد) في 10 ميكرولتر من المحلول. عد الخلايا الحية غير الملوثة في كل زاوية من الزوايا الأربع للمربعات ال 16 لمقياس الدم. اضرب متوسط عدد الخلايا في عامل التخفيف وبمقدار 10000 لإعطاء الخلايا لكل ملليلتر (خلايا / مل). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام عداد الخلية الآلي.
   7. خفف الخلايا إلى 1 × 10⁵ خلايا / مل في وسط المزرعة المحدد لكل خط خلية. البذور 1. 8 مل من الخلايا في كل بئر من لوحة 6 آبار تحتوي على غطاء 22 مم × 22 مم مطلي مسبقا ب 0.1 مجم / مل بولي-د-ليسين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: قد يرغب المرء في اختبار استخدام كل من poly-D-Lysine و poly-L-Lysine ، حيث توجد تقارير عن تفضيلات خاصة بخط الخلية^17,18. تحتوي بعض خطوط الخلايا على البروتياز الذي يمكن أن يكسر poly-L-lysine ، في حين أن هناك تقارير تفيد بأن poly-D-lysine سامة لبعض خطوط الخلايا. في المقابل ، تم الإبلاغ عن أن الخلايا العصبية ، مثل PC12 ، أكثر صحة على أسطح poly-D-lysine.
   8. قم بزراعة الخلايا في حاضنة ذات بيئة CO₂ مرطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للخلايا بالالتصاق بغطاء الغطاء. افحص ارتباط الخلايا تحت مجهر مقلوب بهدف 20x.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا متصلة بالكامل بغطاء الغطاء قبل العلاج أو التلوين المناعي المباشر. في هذا الوقت ، يمكن معالجة الخلايا بالأدوية (أو التحكم في السيارة) إما عن طريق إضافة مخزون مركز (على سبيل المثال ، 600 ميكرولتر من محلول مخزون 4x) أو استبدال الوسط بوسط جديد يحتوي على الدواء بتركيز 1x المطلوب ؛ يمكن بعد ذلك إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة تصل إلى 48 ساعة إضافية. يتم تضمين الخلايا المعالجة بالمذيبات لتقييم آثار الدواء على مستوى وتوطين الجزيء المستهدف. في الدراسة الحالية ، تمت معالجة خلايا D283 ب 600 ميكرولتر من محلول 3.2 ميكرومتر من المغير الخيفي الإيجابي لمستقبلات GABA_A ، QH-II-066¹⁴ (انظر جدول المواد) ، لمدة 48 ساعة. تمت معالجة الخلايا الضابطة بحجم مكافئ من DMSO.
2. التحضير لوضع العلامات المناعية: التثبيت والنفاذية والحجب
   1. شطف الخلايا مع 2.5 مل من 1x PBS (137 mM كلوريد الصوديوم ، 2.7 mM KCl ، 8 mM_Na2 HPO 4 ، 2 mM KH₂PO₄ ، انظر جدول المواد) ، ونضح الحل على الفور.
   2. إصلاح الخلايا باستخدام 1 مل من 4٪ PFA في 1x PBS لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: في حين أن 4٪ PFA هو المثبت القياسي للتلطيخ المناعي ، يمكن أيضا استخدام الجلوتارالدهيد أو الجليوكسال لإصلاح بروتينات الغشاء للتألق المناعي. قد تؤدي طرق التثبيت القائمة على الكحول ، مثل العلاجات بالميثانول المثلج البارد ، إلى مورفولوجيا أقل حفظا وفقدان بروتينات الغشاء^19,20.
   3. اغسل ست مرات باستخدام 2.0 مل من 1x PBS (5 دقائق لكل غسلة) عن طريق التقليب على شاكر. احتضان لمدة 1 ساعة في RT في مخزن مؤقت مانع يتكون من 1x PBS مع 0.8٪ Triton X-100 و 10٪ مصل طبيعي مطابق للأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي (بدلا من ذلك ، يمكن استخدام 3٪ BSA أو جزء مصل البقري V من الألبومين بدلا من المصل الطبيعي).
      ملاحظة: يتم استخدام هذه الخطوة لمنع الربط غير المحدد.
3. وضع العلامات المناعية
   ملاحظة: بعد إضافة الأجسام المضادة المترافقة إلى الفلوروفورات ، يجب إجراء القياسات قريبا لمنع التبييض الضوئي. يجب حماية الحضانات ذات الأجسام المضادة المترافقة من الضوء. إن استخدام وسيط تركيب يحتوي على عوامل تتخلص من الجذور الحرة سيقلل من التبييض الضوئي. قم بتخزين الشرائح في حاوية غير شفافة محكمة الغلق (عند 4 درجات مئوية) بعد إغلاق أغطية الغطاء. عند التصوير ، يمكن تقليل التبييض الضوئي عن طريق الحد من شدة إضاءة الإثارة وأوقات التعرض.
   1. قم بإعداد غرفة مرطبة عن طريق تبطين قاع طبق ثقافة 150 مم بورق الترشيح. بلل ورق الترشيح بالماء المقطر المعقم. ارسم شبكة 3 × 2 على قطعة من فيلم المختبر مقطوعة لتناسب أعلى ورق الترشيح ، وقم بتسميتها للحفاظ على اتجاه أغطية الغطاء في اللوحة المكونة من 6 آبار. ضع فيلم المختبر أعلى ورق الترشيح ، مع تعريض الحواف العلوية والسفلية لترطيب الغرفة.
   2. قم بإعداد 100 ميكرولتر لكل غطاء من التخفيف المطلوب للأجسام المضادة الأولية في 1x PBS مع 3٪ BSA. للكشف عن منتج البروتين الجيني GABRA ، استخدم الجسم المضاد الأولي أحادي النسيلة المؤتلف للأرانب بتخفيف 1: 200 (الجسم المضاد Gabra5 ، المنطقة الوسطى ؛ انظر جدول المواد).
      ملاحظة: لتحديد تركيز الجسم المضاد الأساسي الذي ينتج الإشارة المثلى على الخلفية تجريبيا ، استخدم سلسلة تخفيف للجسم المضاد الأساسي مع الحفاظ على التركيز الثانوي ثابتا. يوصى باستخدام تخفيفات 1: 100 و 1: 250 و 1: 500 و 1: 750 و 1: 1,000 لإنشاء تركيزات الأجسام المضادة الأولية المثلى.
   3. انقل قسيمة الغطاء من محلول الكتلة في لوحة 6 آبار إلى الموقع المناسب على الشبكة المرسومة على فيلم المختبر. تخلص من محلول الكتلة من اللوحة المكونة من 6 آبار ، واحتفظ باللوحة لخطوات الغسيل.
   4. أضف بعناية 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف إلى مركز كل غطاء. تجنب وضع المحلول على حافة غطاء الغطاء. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
   5. أضف 2.5 مل من 1x PBS إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. انقل قسيمة الغطاء مرة أخرى إلى الموقع المناسب في اللوحة المكونة من 6 آبار.
   6. أداء ست غسلات لمدة 5 دقائق لكل منها مع 2.5 مل من 1x PBS.
      ملاحظة: لا تدع أغطية الغطاء تجف أثناء خطوات الشطف ، حيث يمكن أن يساهم ذلك في ظهور إشارة مضان في الخلفية.
   7. أعد قسائم الغطاء إلى الموقع المناسب على فيلم المختبر. لكل غطاء ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في 1x PBS + 1٪ -5٪ BSA.
      ملاحظة: في البداية ، يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع Alexa Fluor 488 (انظر جدول المواد) بتخفيف 1: 1,000 في 1x PBS + 3٪ BSA. يمكن تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية عن طريق زيادة التركيز للكشف عن البروتينات المستهدفة منخفضة الوفرة أو تقليل التركيز لتقليل الخلفية ، إذا لزم الأمر.
   8. بالنسبة للخطوات المتبقية ، قلل من التعرض للضوء لمنع التبييض الضوئي للجسم المضاد الثانوي المقترن. غطي طبق الثقافة بورق الألمنيوم ، واحتضنه لمدة 1 ساعة في RT.
   9. انقل أغطية الغطاء مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 6 آبار. باستخدام شاكر ، قم بإجراء ست غسلات لمدة 5 دقائق لكل منها 2.5 مل من 1x PBS. قم بإزالة PBS عن طريق قلب اللوحة فوق الحوض أو وعاء النفايات. بعد الغسيل الأخير ، اترك برنامج تلفزيوني في البئر لتسهيل إزالة الغطاء.
   10. قم بتسمية شريحة مجهر لكل قسيمة غطاء. أضف قطرة من وسط التثبيت المحتوي على الجلسرين باستخدام DAPI (لتلطيخ النوى) (انظر جدول المواد) إلى وسط الشريحة.
   11. باستخدام الملقط ، قم بإزالة غطاء الغطاء من البئر ، وضعه برفق على قطرة وسيط التثبيت في وسط الشريحة.
       ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء في وسط التركيب.
   12. استخدم قطعا صغيرة من ورق الترشيح لإزالة وسط التركيب الزائد. أغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر ، واترك الملمع يجف تماما قبل التصوير. قم بتخزين الشرائح الزجاجية على حرارة 4 درجات مئوية في صندوق بلاستيكي غير شفاف.
4. التصوير والتحليل
   1. احصل على صور باستخدام مجهر مضان تحت هدف 40x باستخدام زيت الغمر (انظر جدول المواد).
   2. تصور الصور الفلورية باستخدام المرشحات المناسبة.
   3. ملاحظة: بالنسبة إلى Alexa Fluor 488 ، استخدم إثارة / انبعاث 496 نانومتر / 519 نانومتر ؛ بالنسبة إلى DAPI ، استخدم إثارة / انبعاث 358 نانومتر / 461 نانومتر.
   4. التقاط وحفظ ملفات الصور الرقمية. يتم استخدام قيمة binning 4 × 4 لتسهيل معدلات جمع الصور وتقليل الخلفية.
   5. تحضير الصور النهائية. يمكن معالجة الصور باستخدام ImageJ أو البرامج المتاحة تجاريا. النتائج موضحة في الشكل 1.

2. اختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مقايسة TMRE (رباعي ميثيل رودامين ، إيثيل استر) لتسمية إمكانات الغشاء في الميتوكوندريا النشطة ، مع الحفاظ على شحنة سالبة^21,22. TMRE عبارة عن صبغة نفاذة للخلايا ، حمراء برتقالية ، موجبة الشحنة تتراكم في الميتوكوندريا النشطة بسبب شحنتها السالبة النسبية. وقد قللت الميتوكوندريا غير النشطة أو غير المستقطبة من إمكانات الغشاء وفشلت في عزل TMRE بشكل متناسب. FCCP (سيانيد الكربونيل 4- [ثلاثي فلورو روميثوكسي] فينيل هيدرازون) ، وهو مفكك الأيونوفور للفسفرة التأكسدية (OXPHOS) ، يزيل استقطاب أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي يمنع تراكم وعزل TMRE²³. وهذا موضح في الشكل 2.

1. تحضير الخلايا والإعداد التجريبي
   1. الحفاظ على الخلايا في 75 سم² قوارير الثقافة. نضح وسط الثقافة ، وشطف الخلايا مع 1x PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
   2. أضف 2 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA لفصل الخلايا الملتصقة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من المتوسط.
   3. اجمع الخلايا من قارورة الثقافة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 480 × ز لمدة 5 دقائق في RT. نضح الوسط.
   4. أعد تعليق الخلايا في 5 مل إلى 10 مل من الوسط ، اعتمادا على الالتقاء الأصلي للثقافة ، بحيث يكون تركيز الخلية 50-100 خلية لكل مربع على مقياس الدم. اضبط مستوى الصوت ، إذا لزم الأمر ، لتوفير كثافة الخلية المطلوبة للعد الدقيق.
   5. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الخلايا ، وأضفها إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي. خفف الخلايا إلى 3 × 10⁴ خلايا / مل في وسط الاستزراع بدون الفينول الأحمر.
      ملاحظة: يستخدم وسط DMEM الذي يفتقر إلى الفينول الأحمر لأن التعرض للفينول الأحمر يمنع نفاذية الغشاء وقد يساهم في التألق الذاتي في الخلفية.
   6. بذر 2.5 مل من معلق الخلية (75000 خلية) لكل بئر في لوحة 6 آبار تحتوي على غطاء 22 × 22 مم مطلي مسبقا ببولي-د-ليسين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   7. قم بزراعة الخلايا في حاضنة مع ترطيب 5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للخلايا بالالتصاق بغطاء الغطاء.
   8. افحص ارتباط الخلايا تحت مجهر مقلوب بهدف 20x. يجب أن تكون الخلايا متصلة بالكامل بغطاء الغطاء قبل المضي قدما.
2. إعداد حلول الأسهم
   1. لتحضير محلول مخزون 1 مللي متر (1000x) من TMRE (MW = 514.96 جم / مول) (انظر جدول المواد) ، قم بإذابة 1 مجم من TMRE في 1.94 مل من DMSO. يحفظ القسمة ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية محمية من الضوء. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة.
   2. لتحضير محلول مخزون 50 مللي متر (2500x) من FCCP (MW = 254.17 جم / مول) (مفكك فسفرة مؤكسدة الميتوكوندريا) ، قم بإذابة 10 مجم من FCCP في 786.9 ميكرولتر من DMSO. يحفظ القسمة ويخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية محمية من الضوء. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة.
   3. ملاحظة: تعد محاليل المخزون المحضرة جزءا من مجموعة فحص غشاء الميتوكوندريا TMRE (انظر جدول المواد).
3. تحديد تركيز TMRE لخطوط الخلايا
   1. قم بإعداد محلول TMRE يعمل 500 نانومتر في وسط زراعة الخلايا. حماية حل العمل من الضوء.
   2. أضف TMRE إلى الخلايا المزروعة على أغطية الغطاء في نطاق تركيز متوسط إلى نهائي بين 50-200 نانومتر. قم بذلك عن طريق استنشاق وسط الاستزراع أولا واستبداله بوسط استزراع يحتوي على TMRE.
   3. احتضان لمدة 20 دقيقة على 37 درجة مئوية. تأكد من ترتيب أوقات العلاج للسماح بالتصوير ، حيث يتم عرض الخلايا مباشرة.
   4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS ، واقلب الغطاء على شريحة مجهرية تحمل علامة تركيز TMRE النهائي.
   5. قم بتصوير الخلايا الحية على الفور (الذروة E_x / E_m = 549 نانومتر / 575 نانومتر).
      ملاحظة: قم على الفور بتصوير العينات بمجرد إزالتها من ظروف المزرعة ، حيث تتعرض صحة الميتوكوندريا للخطر بمجرد إزالة الخلايا من الوسط ووضعها على شريحة مجهرية. كبديل لأغطية الغطاء ، يمكن تصوير الخلايا في أطباق ذات قاع زجاجي.
   6. التقط الصور باستخدام المجهر والبرامج المتاحة.
      ملاحظة: وضع معلمات تجريبية للتصوير المجهري أثناء عملية تحسين تركيز TMRE ، والحفاظ على نفس الظروف في التجارب اللاحقة لضمان مقارنة البيانات بدقة. استخدم البروتوكول المفصل مجهرا متحد البؤر وبرنامجا متوافقا (انظر جدول المواد).
   7. حدد التركيز الأمثل TMRE ، والذي يعتمد على خط الخلية.
      ملاحظة: تركيز TMRE الذي يوفر أفضل إشارة لحل التغيرات في مستويات TMRE الميتوكوندريا هو عموما أدنى تركيز TMRE ، مما يعطي إشارة مضان متساوية ويمكن اكتشافها بسهولة.
4. اختبار الحالة المستقطبة للخلية
   1. إعداد الفحص
      1. تحضير محاليل مخزون المعالجة بالتركيزات المطلوبة، وإعداد الأوساط بتركيز المركب النهائي المراد فحصه. بالنسبة ل FCCP ، يجب أن يكون محلول المخزون 20 mM (محضر باستخدام DMSO من محلول مخزون 50 mM).
      2. من خلال العمل على غطاء واحد في كل مرة ، أضف 1.8 مل من الوسط بالإضافة إلى مركب الاختبار إلى الخلايا.
      3. احتضان الخلايا بمركب الاختبار عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في بيئة رطبة للفترة الزمنية المطلوبة.
         ملاحظة: ستختلف أوقات العلاج اعتمادا على الآلية التي قد يغير بها مركب الاختبار إمكانات غشاء الميتوكوندريا. تتطلب البروتونوفورات القوية مثل FCCP التي تزيل الاستقطاب بسرعة وبشكل مباشر إمكانات غشاء الميتوكوندريا التحليل بعد فترة وجيزة من العلاج (في غضون دقائق). في المقابل ، قد تستغرق تأثيرات العلاج بالمركبات التي تؤثر بشكل غير مباشر على وظيفة سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا ، مثل تلك التي تغير تنشيط البروتين أو دوران البروتين أو تتطلب تخليق البروتين ، وقتا أطول لإظهار التأثير.
      4. أثناء الحضانة ، قم بتشغيل المجهر ، واضبطه على معلمات التصوير المثلى المحددة مسبقا ، بما في ذلك من حيث الكسب وكثافة الليزر ومعدل التقاط الصور والمتوسط ووقت التعرض.
      5. بعد فترة العلاج الدوائي ، أضف 200 ميكرولتر من 10x TMRE (التركيز الأمثل المحدد أعلاه) إلى الخلايا الضابطة والمعالجة بالعقاقير.
      6. احتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ في بيئة رطبة. نضح الوسط برفق ، وشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
      7. كرر خطوة شطف 1x PBS لتجنب الخلفية التي تسببها وسط زراعة الخلايا أو مركبات العلاج ، واقلب الغطاء على شريحة مجهر تحمل علامة ظروف العلاج.
      8. تخيل الخلايا التي تعيش عند E_x / E_m = 549 نانومتر / 575 نانومتر. باستخدام مجهر متحد البؤر ، اجمع العديد من حقول z-stack مع التقاط صور عالي السرعة (512 بكسل × 512 بكسل ، متوسط = 4) قبل فقدان سلامة الخلية.
      9. حفظ وتخزين ملف الصورة للتحليل. يتم تكرار الإجراء للحالة التجريبية التالية.
   2. الضوابط التجريبية
      1. استخدم عنصر تحكم بدون علاج (سلبي) ، يتم إجراؤه على النحو المبين أعلاه (الخطوات 3.1.1-3.1.8) ، يفتقر إلى مركب الاختبار في الوسط.
      2. استخدم عنصر تحكم محتمل في تعطيل غشاء الميتوكوندريا (إيجابي) يتكون من مركب البروتونوفور FCCP. أضف 1.8 مل من 20 ميكرومتر FCCP (انظر جدول المواد) في الوسط إلى الخلايا. كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3.1.1-3.1.2؛ والتصوير الخلوي، على النحو المبين في الخطوات 3.1.3-3.1.8)، احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ في بيئة رطبة قبل تلطيخها ب TMRE.
         ملاحظة: كل من الضوابط الإيجابية والسلبية مطلوبة لهذه التجارب.
   3. التحديد الكمي
      1. قم بقياس كثافة البكسل الملتقطة للخلايا الفردية من صورة تمثيلية واحدة من المنطقة المركزية لكل مكدس z. في هذا العمل ، تم اختيار مستوى تركيز واحد لتسهيل التحليل.
      2. تحليل كثافة البكسل من 30 خلية على الأقل (في مجملها) لكل علاج. استخدم Excel أو Prism لمتوسط كثافة البكسل لكل معالجة ، وتقديمها بتنسيق الرسم البياني الشريطي مع الخطأ القياسي للمتوسط.
         ملاحظة: يمكن أيضا استخدام ImageJ للقياس الكمي الفلوري. بدلا من ذلك ، يمكن قياس مضان تلطيخ TMRE باستخدام منصات البرامج التجارية.

3. إنشاء وظيفة القناة الأيونية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية

ملاحظة: يصف الإجراء الوارد في هذا القسم استخدام مقايسة الفيزيولوجيا الكهربية الآلية لفحص مركبات الاختبار في خط الخلايا السرطانية (الشكل 3).

1. تحضير الخلايا
   1. حصاد الخلايا من ثقافة صحية تفتقر إلى الخلايا الميتة و / أو فرط نمو الخلايا. استخدم إما محلول فصل الخلايا الكيميائية TrypLE أو مكشطة الخلايا اليدوية لحصاد الخلايا الملتصقة والعنقودية. فصل الخلايا التي تنمو في كتل أو كرات ، والتي هي شائعة بشكل خاص بين الخلايا السرطانية في الجهاز العصبي المركزي.
      ملاحظة: يساعد التفكك اللطيف للخلايا في الحفاظ على سلامة بروتينات الغشاء الضرورية لتوصيل الأيونات.
   2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 561 × جم لمدة 10 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية ، وقم بتعليق الحبيبات في DMEM (بدون الفينول الأحمر) ، HEPES ، والبنسلين / الستربتومايسين مع 20٪ FBS و 4 mM L-glutamine (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتم استخدام وسط DMEM الذي يفتقر إلى الفينول الأحمر لأن التعرض للفينول الأحمر يمنع نفاذية الغشاء.
   3. قم بطلاء الخلايا على غطاء مطلي بطبقة بولي-L-lysine بكثافة منخفضة ، بحيث يكون هناك فصل بين الخلايا المفردة.
      ملاحظة: يتم استخدام Poly-L-lysine هنا ، وليس poly-D-lysine ، حيث أن poly-L-lysine له خصائص طلاء أفضل.
   4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في غرفة مرطبة لمدة 12 ساعة إلى 24 ساعة (يجب تحديد الوقت الأمثل) قبل أخذ التسجيل.
2. تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية
   1. قم بإزالة الوسيط من أغطية الغطاء. اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 1x PBS. أضف ~ 300 ميكرولتر من محلول TrypLE. باستخدام الماصة ، ماصة برفق لأعلى / لأسفل أربع إلى خمس مرات حتى يتم فصل الخلايا.
   2. أضف وسطا خاليا من المصل (DMEM) (خال من الفينول الأحمر) ، وحافظ على عدد الخلايا النهائي لكل حجم لا يقل عن 1 مليون خلية / مل. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، قم بإزالة الفوضى من الخلايا للحصول على تعليق خلية يفتقر إلى مجموعات الخلايا.
   3. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 1 مل. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لتثبيت غشاء الخلية. حافظ على دوران الخلايا على شاكر (دورة لطيفة) لتجنب تكوين كتل الخلايا.
   4. قم بإعداد Port-a-Patch (انظر جدول المواد). قم بتشغيل الكمبيوتر ومكبر الصوت ونظام التروية. افتح برنامج Patch-Master ، وقم بإنشاء ملف جديد.
   5. أحضر المخازن المؤقتة (خارج الخلية والداخلية) إلى RT ، ثم قم بتحميل المخازن المؤقتة في أنابيب التروية المعنية.
      ملاحظة: تتطلب تسجيلات مستقبلات GABA_A كلا من "محلول (حمام) خارج الخلية" يحتوي على 161 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 3 مللي مول KCl ، 1 مللي مول MgCl 2 ، 1.5 مللي مول CaCl 2 ، 10 mM HEPES ، و 6 mM D-glucose (يتم تعديل الأس الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام NaOH) و "محلول داخلي" يحتوي على 120 mM KCl ، 2 mM MgCl ₂ ، 10 mM EGTA ، و 10 mM HEPES (تم تعديل درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام NaOH).
   6. املأ الجزء السفلي من شريحة القطب الكهربائي (المقدمة من الشركة المصنعة) ب 5 ميكرولتر من المحلول الداخلي ، وضع شريحة القطب على قمة فاراداي من Port-a-Patch. أضف 10 ميكرولتر من المحلول الخارجي إلى الشريحة ، ولاحظ النبض المستطيل على راسم الذبذبات باستخدام برنامج Patch-Master (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: قد تكون المقاومة في حدود 2-3 MΩ ، ولكن هذا يعتمد على خط الخلية.
   7. ابدأ التسجيل بمجرد ظهور النبضة المستطيلة ، وبعد التعديلات الإلكترونية الأولية ، وبعد أن يطالب البرنامج المستخدم بإضافة خلايا.
   8. أضف برفق 20 ميكرولتر من التعليق أحادي الخلية على الجزء المركزي من القطب ، وانتظر رقعة الخلية متبوعة بختم جيجا أوم من خلال مراقبة قيم المقاومة في البرنامج.
   9. يمكن ملاحظة التقدم المباشر لتصحيح الخلايا في العمود الأيسر من البرنامج. بمجرد "الاحتفاظ بالخلية في وضع الخلية بالكامل" ، ابدأ التسجيلات عن طريق فتح بروتوكول داخل البرنامج.
   10. اضبط إمكانات الاحتفاظ على -80 مللي فولت. قم بتشغيل بروتوكول تسجيل مستمر خال من الفجوات باستخدام برنامج Patch-Master لتسجيل التيار من الخلية.
   11. احصل على خط أساس مستقر ، وقم بالتبديل إلى ligand والتطبيق المركب المعني لمدة محددة باستخدام علامة تبويب التروية الآلية على اللوحة اليسرى من البرنامج.
   12. الحصول على البيانات باستخدام برنامج Patch-Master.
       ملاحظة: يتم ترشيح البيانات ذات الترددات المنخفضة عند 1 كيلو هرتز ورقمنتها عند 100 كيلو هرتز.
   13. قم بإجراء تحليل البيانات عن طريق حساب السعة القصوى للاستجابة الحالية باستخدام برنامج Nest-o-Patch (انظر جدول المواد).

4. في قوة المختبر

ملاحظة: يفصل هذا الإجراء مقايسة MTS لتحديد فعالية الدواء. يجمع فحص تكاثر الخلايا ذو الحل الواحد بين جميع كواشف الفحص المطلوبة في محلول معد يمكن إضافته في خطوة واحدة إلى آبار زراعة الخلايا لتقييم صلاحية الخلية وانتشارها بعد العلاج بالمركبات التجريبية. يتم إعادة تشكيل الكاشف وفقا لتوصيات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، ويتم اقتباسه وتخزينه عند -20 درجة مئوية. يصف القسم استخدام الفحص لتحديد IC₅₀ لمركبات الاختبار في خط خلية معين (الشكل 4). يمكن أيضا استخدام كاشف MTS هذا للفحص عالي الإنتاجية لأعداد كبيرة من المركبات بتركيزات معروفة.

1. تحضير الخلايا
   ملاحظة: يعتمد رقم الخلية على نمو واستقلاب كل خط خلية على حدة. تحديد رقم الخلية الأمثل تجريبيا قبل استخدام الفحص لتقييم أي علاجات بحثية.
   1. حصاد الخلايا الملتصقة من المزرعة عن طريق التربسين ، واستخدام Accutase (انظر جدول المواد) لفصل الخلايا التي تنمو في كتل أو مجالات.
      ملاحظة: غالبا ما تتطلب خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي والورم الأرومي النخاعي الأولي Accutase لأنها تميل إلى النمو في كتل أو مجالات.
   2. عد الخلايا ، واصنع محلولا خلويا يحتوي على 10000 خلية لكل بئر بحجم 75 ميكرولتر. قم بتخفيف المخزون لأرقام الخلايا المراد اختبارها. تحضير ما لا يقل عن 1 مل لكل تخفيف.
   3. لوحة 75 ميكرولتر من كل تخفيف إلى مجموعات من خمسة آبار متتالية في لوحة 96 بئر. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO₂ بين عشية وضحاها في بيئة رطبة (أي حاضنة).
      ملاحظة: قد تتطلب خطوط الخلايا ذات النمو البطيء أو التمثيل الغذائي (التي تحمض وسط نموها في أكثر من 3 أيام) أكثر من 10000 خلية كنطاق عدد الخلايا العلوي ، بينما تتطلب خطوط الخلايا التي تنمو بسرعة (بشكل عام أسرع من 20 ساعة مضاعفة الوقت) خلايا أقل. قد تتطلب خطوط الخلايا ذات التمثيل الغذائي العالي أقل من 1000 خلية لكل بئر. يمكن ضبط نطاق الخلايا لتحديد كثافة الطلاء المثلى لمقايسة MTS لخطوط الخلايا هذه.
2. التحكم في العلاج الوهمي
   1. أضف 25 ميكرولتر من الوسط لكل بئر لمحاكاة إضافة مركب الاختبار في فحص MTS.
      ملاحظة: في اختبار MTS الفعلي ، ستتم إضافة 25 ميكرولتر من مخزون 4x من تركيز المعالجة المختار لمركب الاختبار (هنا معدل مستقبلات GABA_A ، QH-II-066) إلى الخلايا لإعطاء تركيز المعالجة النهائية 1x في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر لكل بئر.
   2. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO₂ في بيئة رطبة لمدة 48 ساعة. هذا يحاكي الحضانة القياسية في وجود دواء.
3. مقايسة MTS
   1. قم بإذابة الحصص المطلوبة من كاشف MTS. أضف 20 ميكرولتر من كاشف MTS لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في بيئة رطبة لمدة 1 ساعة.
   2. قم بطرد اللوحة (1350 × جم لمدة 5 دقائق) في درجة حرارة الغرفة لإزالة الفقاعات ، والتي يمكن أن تتداخل مع قراءة الامتصاص.
      ملاحظة: قم بإزالة أي فقاعات بإبرة دقيقة.
   3. اقرأ الامتصاص عند 490 نانومتر. احفظ البيانات كملف Excel.
   4. أعد الألواح إلى 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ ، واقرأ بشكل متكرر خلال فترة النطاق الخطي 4 ساعات للفحص.
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لإعادة الطرد المركزي قبل قراءة الامتصاص. قد تكون البيانات من القراءات اللاحقة ، وخاصة قراءة 2 ساعة ، مهمة لفحص مدى سرعة استقلاب خط الخلية لكاشف MTS وهي مفيدة في اختيار عدد الخلايا إلى اللوحة للفحص.
   5. ارسم الكثافة البصرية للامتصاص (OD) عند 490 نانومتر (OD₄₉₀) مقابل رقم الخلية المطلي باستخدام Excel أو Prism.
   6. حدد رقم الخلية للفحص. سيكون العدد الأمثل للخلايا في النطاق الخطي وأقل من التشبع (OD₄₉₀ = 1).
      ملاحظة: بالنسبة للخلايا ذات النمو البطيء ، يمكن تعديل أعلى رقم خلية مطلي إلى 20000 خلية لكل بئر ، ويمكن ترك 500 خلية لكل بئر خارج الفحص.
4. تحديد IC₅₀
   1. اليوم 1: لوحة الخلايا لمقايسة MTS
      1. سجل اسم خط الخلية ورقم المقطع لكل سطر في الدراسة. لمواجهة التبخر أثناء الفحص ، على الأقل ، املأ الصفوف العلوية والسفلية للمحيط الخارجي وأعمدة المحيط الأيسر والأيمن للوحة 96 بئرا ب 1x PBS ، 100 ميكرولتر لكل بئر ، لمواجهة التبخر أثناء الفحص.
      2. ضع العدد الأمثل للخلايا لكل خط خلية كما هو محدد قبل بدء الفحص. قم بطلاء الخلايا في 75 ميكرولتر لكل بئر من وسط خال من الفينول الأحمر وخالي من المضادات الحيوية لا يحتوي على مخزن HEPES المؤقت. يمكن زيادة FBS إلى 20٪ لدعم نمو خطوط الخلايا.
         ملاحظة: يتم استخدام الفينول الأحمر الذي يفتقر إلى المتوسط لأن التعرض للفينول الأحمر يمنع نفاذية الغشاء.
      3. ضع العينة في خمس نسخ على الأقل لتركيز العلاج. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم اليدوي أو الآلي.
         ملاحظة: لاستخدام مقياس الدم اليدوي ، (1) إعداد تخفيف 1: 1 من الخلايا المعاد تعليقها في وسط باللون الأزرق المثقب. (2) احتضان 5-15 دقيقة ، اعتمادا على خط الخلية ؛ (3) تحميل 10 ميكرولتر من الخلايا باللون الأزرق المثقب في غرفة عد مقياس الدم ؛ (4) عد الخلايا القابلة للحياة في الزوايا الأربع والمربعات الوسطى ، وحدد متوسط عدد الخلايا لكل مربع ؛ (5) احسب الخلايا القابلة للحياة لكل ملليلتر على النحو التالي:
         الخلايا القابلة للحياة لكل مل = متوسط الخلايا القابلة للحياة × 2 (عامل التخفيف) × 10⁴
      4. استخدم حجما كافيا لتحضير التركيز المطلوب للخلايا في وسط خال من الفينول الأحمر وخالي من المضادات الحيوية لا يحتوي على مخزن HEPES المؤقت (أي 75 ميكرولتر لكل بئر × 60 بئرا لكل لوحة = 4.5 مل من الخلايا لكل لوحة).
         ملاحظة: يجب أن تحتوي كل لوحة على عنصر تحكم متوسط فقط لطرح الخلفية. يمكن أن يحل التحكم المتوسط محل آبار PBS إذا لزم الأمر.
   2. اليوم 2: إضافة مركب العلاج
      1. تحضير معالجات التجارب عند 4 أضعاف التركيز النهائي المطلوب لإعطاء التركيز النهائي المطلوب عند إضافة 25 ميكرولتر من محاليل المعالجة إلى الخلايا المطلية ب 75 ميكرولتر من الوسط (= 100 ميكرولتر الحجم الكلي لكل بئر).
      2. قم بإعداد حلول الاختبار (في هذه الحالة ، معدل مستقبلات GABA_A QH-II-066) عن طريق التخفيف التسلسلي للمخزونات ذات التركيز الأعلى. على سبيل المثال ، إذا كانت تركيزات الدواء النهائية ستكون 5.0 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر و 1.25 ميكرومتر و 0.625 ميكرومتر و 0.3125 ميكرومتر ، فقم بإعداد تخفيفات تسلسلية 1: 1 تبدأ ب 20 ميكرومتر للحصول على تركيزات 10 ميكرومتر و 5 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر و 1.25 ميكرومتر على التوالي.
         ملاحظة: تتطلب كل لوحة اثنين من عناصر التحكم القائمة على الخلية بالإضافة إلى عنصر التحكم المتوسط فقط: الخلايا غير المعالجة (المتوسطة وحدها) والخلايا المعالجة بالمذيبات (غالبا DMSO) بتركيز معروف. من الممارسات الجيدة التأكد من أن السيارة لا تؤثر على تكاثر الخلايا في النطاق النشط للمركب.
      3. بمجرد إضافة مركب الاختبار ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في بيئة رطبة لمدة 48 ساعة.
   3. اليوم 3: إجراء مقايسة تكاثر الخلايا (MTS)
      1. احسب حجم كاشف MTS المطلوب (20 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر من ثقافة الاختبار) ، وقم بإذابة الحجم المطلوب من كاشف MTS المقتبس (انظر جدول المواد).
      2. دوامة ، والتأكد من أن الكاشف في محلول تماما قبل الاستخدام. ماصة الكاشف المذاب في خزان كاشف معقم سعة 25 مل.
      3. ماصة 20 ميكرولتر من كاشف MTS (باستخدام ماصة متعددة القنوات) في كل بئر من لوحة 96 بئر تحتوي على عينات في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
      4. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في بيئة رطبة لمدة 1 ساعة إلى 4 ساعات. يمكن قراءة اللوحات في نقاط زمنية متعددة. بشكل عام ، تتم قراءة اللوحات في 1 ساعة و 2 ساعة أو 3 ساعات.
      5. يمكن أن تؤدي الفقاعات في الوسط إلى نتائج خاطئة. قبل القراءة في قارئ اللوحة ، قم بتدوير اللوحة عند 1350 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكن استخدام إبرة أو طرف ماصة لإزالة أي فقاعات تبقى بعد الطرد المركزي.
      6. قم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة مجهرية مناسب أو مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد).
      7. احفظ البيانات كملف Excel.
         ملاحظة: سيختلف وقت الحضانة في وجود مركب الاختبار اعتمادا على معدل التمثيل الغذائي ونمو خط الخلية قيد الدراسة ، بالإضافة إلى المركب الذي يتم اختباره. فترة الحضانة 48 ساعة هي نقطة انطلاق جيدة لمعظم خطوط الخلايا ومركبات الاختبار.
5. تحليل البيانات
   1. انقل البيانات في ملف Excel ، وقم بتنظيم البيانات لكل نسخة متماثلة عن طريق زيادة تركيز مركب الاختبار. حساب متوسط قيمة عنصر التحكم المتوسط فقط، واطرح هذه القيمة من البيانات التجريبية.
   2. حدد النسبة المئوية لتكاثر الخلايا في آبار المعالجة مقارنة بآبار المركبات (أو آبار التحكم المعالجة بالمذيبات) عن طريق ضبط التحكم على انتشار 100٪ لكل نسخة مكررة.
   3. انقل البيانات التي تم إنشاؤها في Excel إلى برنامج من اختيارك. يستخدم المؤلفون عموما برنامج Prism (انظر جدول المواد) لتحديد تركيز الدواء الذي يمنع تكاثر الخلايا بنسبة 50٪ (IC₅₀).
   4. في برنامج Prism ، قم بإنشاء جدول بيانات يحتوي على العمود X كأرقام خلايا وعمود Y كمتوسط OD لخمس قيم متماثلة في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب.
   5. أدخل قيم تركيز العلاج في العمود X عند تحليل العلاج الدوائي. قم بتسمية المحور السيني باسم مركب المعالجة ووحدات التركيز.
   6. أدخل قيم صلاحية الخلية المتماثلة المحسوبة من تحليل Excel في الأعمدة الفرعية Y. قم بتسمية المحور ص على أنه تكاثر الخلايا (٪).
   7. باستخدام أداة التحليل، حدد الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) ضمن تحليلات XY.
   8. حدد استجابة الجرعة [تثبيط] مقابل الاستجابة الطبيعية - المنحدر المتغير.
   9. أداء وظيفة التحليل. اعرض جدول النتائج للاطلاع على قيم أفضل ملاءمة محسوبة ل IC₅₀ والرسم البياني لملاءمة المنحنى. يمكن تغيير المحور السيني للرسم البياني إلى مقياس لوغاريتمي إذا رغبت في ذلك.

أعلاه هي إجراءات مختارة يمكن استخدامها لتوصيف القنوات الأيونية في الخلايا السرطانية. يسلط البروتوكول الأول الضوء على تلطيخ قناة أيونية. كما هو مفصل ، هناك العديد من التحديات عند تلطيخ قناة أيونية أو ، في هذا الصدد ، أي بروتين موجود في الغشاء خارج الخلية. الموضح في الشكل 1 هو تلطيخ وحدة فرعية من مستقبل GABAA الخماسي. يسلط البروتوكول الثاني الضوء على نتائج اختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا في الخلايا السرطانية. تلعب الميتوكوندريا أدوارا أساسية لبقاء الخلية وتكاثرها ، وكذلك موت الخلايا. في خلايا الثدييات ، تعمل الميتوكوندريا على تنشيط موت الخلايا المبرمج استجابة للإجهاد الخلوي من خلال إطلاق بروتينات عائلة Bcl-2 الموجودة بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. في العصارة الخلوية ، تعمل بروتينات عائلة Bcl-2 على تنشيط بروتياز الكاسباز ، الذي يتوسط موت الخلايا المبرمج. يمكن أن تؤدي التغيرات في وظيفة القناة الأيونية لغشاء البلازما إلى تعطيل التوازن الأيوني داخل الخلايا ، بما في ذلك من حيث مستويات الأيونات داخل الميتوكوندريا ، مما قد يؤدي إلى فقدان إمكانات الغشاء ، وبالتالي يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج14. تعد مستويات Ca2+ و K + و Na + و H + محددات مهمة في الإشارة إلى الأحداث التي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا الذي بدأته الميتوكوندريا. كما هو موضح في الشكل 2 هو تلطيخ مع الصبغة TMRE المنفذة للخلية والموجبة الشحنة لتسمية وتصوير جهد الغشاء في الميتوكوندريا النشطة ، والتي تحافظ على شحنة سالبة21,22. TMRE هي صبغة حمراء برتقالية ترتبط بالميتوكوندريا النشطة بسبب شحنتها السالبة النسبية. وقد قللت الميتوكوندريا غير المستقطبة أو غير النشطة من إمكانات الغشاء، وبالتالي فشلت في عزل TMRE. في هذه التجربة ، يعد FCCP غير القابل للربط المتأين عنصر تحكم مهم ، لأنه يزيل استقطاب أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي يمنع تراكم TMRE23. يسلط البروتوكول الثالث الضوء على الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الخلية ذات المشبك الرقعي. يوضح الشكل 3 تسجيلات تمثيلية لأثر مسجل من خط خلايا الورم الأرومي النخاعي المشتق من المريض D283. أخيرا ، يسلط البروتوكول الرابع الضوء على اختبار لتحديد حالة تكاثر الخلايا السرطانية. يظهر في الشكل 4 تفاصيل حول كيفية عمل مقايسة MTS ورسم توضيحي للوحة وقراءات عند حضنها بعامل يضعف صلاحية الخلايا السرطانية قيد الدراسة (في هذه الحالة ، DAOY).

الشكل 1: تلطيخ الخلايا للقنوات الأيونية. أ: تلطيخ بروتين Gabra5، وهو وحدة فرعية من مستقبلات GABAA، في خلايا سرطان الورم الأرومي النخاعي D283. (ب) الخلايا الثابتة المعالجة بالصبغة الفلورية 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)، التي ترتبط بالحمض النووي. (ج) دمج خلايا سرطان الورم الأرومي النخاعي الملطخة لكل من Gabra5 و DAPI. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الشكل مقتبس من Kallay et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: اختبار الحالة المستقطبة للميتوكوندريا . (أ) تعالج خلايا سرطان الورم الأرومي النخاعي D283 الحية بتركيزات متزايدة من الدواء QH-II-066. ثم يتم التعامل مع الخلايا ب TMRE موجبة الشحنة ونفاذة للخلايا (رباعي ميثيل رودامين ، إيثيل استر) ، والتي تتراكم في الميتوكوندريا النشطة (سالبة الشحنة). وقد قللت الميتوكوندريا غير المستقطبة أو غير النشطة من إمكانات الغشاء، وبالتالي تفشل في الاحتفاظ بصبغة TMRE؛ نتيجة لذلك ، فإنها تظهر إشارة مضان منخفضة. يصورها المجهر الفلوري. FCCP (سيانيد الكربونيل 4- [ثلاثي فلوروميثوكسي] فينيل هيدرازون). الذروة: λex ، 549 نانومتر ؛ λم ، 575 نانومتر. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لتلطيخ TMRE (الصور الموضحة في اللوحة ألف) باستخدام منصة البرامجيات. يتم تقديم البيانات كمتوسط وخطأ قياسي للمتوسط. الشكل مقتبس من Kallay et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: إنشاء وظيفة القناة الأيونية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية. (أ) يظهر إعداد أو جهاز تصحيح Port-a-Patch ، يتكون من قفص فاراداي (أ) ، وغرفة تسجيل (ب) ، ووحدة شفط (ج ، يمين). (B) منظر علوي لجهاز Port-a-Patch يسلط الضوء على غرفة التسجيل المجهزة بمدخل نضح (أ) ومخرج (ب) وقطب كهربائي مرجعي (ج). (ج) يتم توصيل Port-a-Patch بنظام نضح سريع لتبادل الحلول مع أوضاع تشغيل آلية ويدوية وخزانات محلول. (د) تتبع التيار التمثيلي من تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية الكاملة باستخدام جهاز Port-a-Patch (Nanion) وخلايا سرطان الورم الأرومي النخاعي D283. تم تطبيق GABA (10 ميكرومتر) لمدة 5 ثوان مع إمكانية الاحتفاظ بها -80 مللي فولت. (ه) تتبع التيار التمثيلي من تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية الكاملة باستخدام جهاز Port-a-Patch (Nanion) وخلايا سرطان الورم الأرومي النخاعي D283 مع التطبيق المشترك ل GABA (1 μM) وناهض مستقبلات GABAA (مخدر عام) البروبوفول (50 ميكرومتر) ، والذي يعزز التيار الناجم عن GABA وحده. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مقايسة MTS لتقييم فعالية الدواء. (أ) التفاعلات الكيميائية الكامنة وراء "مقايسة MTS" المستخدمة لتقييم فعالية العامل ، كما ينعكس في انخفاض تكاثر الخلايا. الحد من MTS tetrazolium بواسطة الخلايا القابلة للحياة ، وتوليد فورمازان الصبغة. (ب) صفيحة من 96 بئرا توضح النتائج اللونية لمقايسة MTS مع زيادة تركيزات الدواء. في هذه التجربة ، يتم التعامل مع خلايا سرطان الورم الأرومي النخاعي DAOY بتركيزات متزايدة من دواء ما قبل السريري ، KRM-II-08 ، وهو معدل خيفي إيجابي لمستقبل GABAA. (ج) منحنى استجابة الجرعة الناتج عن مقايسة MTS (من القياس الكمي للوحة 96 بئرا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مقارنة بين إعدادات الفيزيولوجيا الكهربية اليدوية مقابل شبه المؤتمتة بالكامل.

D.A.P.K. هو المؤسس المشارك والرئيس والمدير التنفيذي لشركة Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. هو المؤسس المشارك لشركة Amlal Pharmaceuticals Inc. وعضو في مجلس مراقبة سلامة الأدوية في شركة Bexion Pharmaceuticals، Inc.