مقالة منهجية

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

DOI:

10.3791/65444

⸱

يونيو 16, 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد الميتوكوندريا في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا وتؤدي وظائف أساسية تتجاوز إنتاج الطاقة ، على سبيل المثال ، تخليق مجموعات الحديد والكبريت أو الدهون أو البروتينات ، والتخزين المؤقت Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وبالمثل ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى أمراض بشرية حادة مثل السرطان والسكري والتنكس العصبي. من أجل أداء هذه الوظائف ، يجب على الميتوكوندريا التواصل مع بقية الخلية عبر غلافها ، والذي يتكون من غشاءين. لذلك ، يجب أن يتفاعل هذان الغشاءان باستمرار. مواقع الاتصال البروتينية بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا ضرورية في هذا الصدد. حتى الآن ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال. في الطريقة الموضحة هنا ، تستخدم Saccharomyces cerevisiae mitochondria لعزل مواقع الاتصال ، وبالتالي تحديد المرشحين المؤهلين للحصول على بروتينات موقع الاتصال. استخدمنا هذه الطريقة لتحديد موقع ملامسة الميتوكوندريا ومجمع نظام تنظيم cristae (MICOS) ، وهو أحد مجمعات تكوين موقع التلامس الرئيسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم حفظه من الخميرة إلى البشر. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين هذه الطريقة لتحديد موقع اتصال جديد يتكون من Cqd1 ومجمع Por1-Om14.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤدي الميتوكوندريا مجموعة متنوعة من الوظائف المختلفة في حقيقيات النوى، وأكثرها شهرة إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية. تشمل الوظائف الأخرى إنتاج مجموعات الحديد والكبريت ، وتخليق الدهون ، وفي حقيقيات النوى العليا ، وإشارات Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج1،2،3،4. ترتبط هذه الوظائف ارتباطا لا ينفصم ببنيتها الفائقة المعقدة.

تم وصف البنية الفوقية للميتوكوندريا لأول مرة بواسطة المجهر الإلكتروني5. وقد تبين أن الميتوكوندريا هي عضيات معقدة إلى حد ما تتكون من غشاءين: الغشاء الخارجي للميتوكوندريا والغشاء الداخلي للميتوكوندريا. وبالتالي ، يتم تشكيل مقصورتين مائيتين بواسطة هذه الأغشية: الفضاء بين الغشاء والمصفوفة. يمكن تقسيم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى أقسام مختلفة. يبقى الغشاء الحدودي الداخلي على مقربة من الغشاء الخارجي ، ويشكل cristae غزوات. ما يسمى تقاطعات crista تربط الغشاء الحدودي الداخلي و cristae (الشكل 1). علاوة على ذلك ، تكشف الصور المجهرية الإلكترونية للميتوكوندريا المنكمشة تناضحيا عن وجود مواقع ترتبط فيها أغشية الميتوكوندريا بإحكام 6,7. تتشكل مواقع الاتصال المزعومة هذه بواسطة مجمعات بروتينية تمتد على الغشاءين (الشكل 1). يعتقد أن مواقع التفاعل هذه ضرورية لصلاحية الخلية نظرا لأهميتها لتنظيم ديناميكيات الميتوكوندريا والوراثة ، وكذلك نقل المستقلبات والإشارات بين السيتوسول والمصفوفة8.

من المحتمل أن يكون مجمع MICOS في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا هو أفضل مركب مميز وأكثر تنوعا لتشكيل موقع الاتصال. تم وصف MICOS في الخميرة في عام 2011 ، ويتكون من ست وحدات فرعية9،10،1 1: Mic60 و Mic27 و Mic26 و Mic19 و Mic12 و Mic10. هذه تشكل مجمعا من حوالي 1.5 MDa الذي يتمركز إلى تقاطعات crista9،10،11. يؤدي حذف أي من الوحدات الفرعية الأساسية ، Mic10 أو Mic60 ، إلى عدم وجود هذا المجمع 9,11 ، مما يعني أن هاتين الوحدتين الفرعيتين ضروريتان لاستقرار MICOS. ومن المثير للاهتمام ، أن MICOS لا يشكل موقعا واحدا فحسب ، بل مواقع اتصال متعددة مع بروتينات ومجمعات غشاء خارجي مختلفة من الميتوكوندريا: مجمع TOM 11,12 ، مركب TOB / SAM 9,12,13,14,15,16 ، مجمع Fzo1-Ugo1 9 ، Por1 10 ، OM45 10 ، و Miro 17. يشير هذا بقوة إلى أن مجمع MICOS يشارك في عمليات الميتوكوندريا المختلفة ، مثل استيراد البروتين ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوليد البنية الفوقية للميتوكوندريا18. من المحتمل أن تكون الوظيفة الأخيرة هي الوظيفة الرئيسية ل MICOS ، حيث أن غياب مركب MICOS الناجم عن حذف MIC10 أو MIC60 يؤدي إلى بنية فائقة غير طبيعية للميتوكوندريا تفتقر تماما إلى cristae منتظم. بدلا من ذلك ، تتراكم حويصلات الغشاء الداخلي دون اتصال بغشاء الحدود الداخلية19 ، 20. الأهم من ذلك ، يتم الحفاظ على MICOS في الشكل والوظيفة من الخميرة إلىالإنسان 21. يؤكد ارتباط الطفرات في الوحدات الفرعية MICOS بالأمراض البشرية الشديدة أيضا على أهميتها لحقيقيات النوى الأعلى22,23. على الرغم من أن MICOS متعدد الاستخدامات للغاية ، يجب أن توجد مواقع اتصال إضافية (بناء على ملاحظاتنا غير المنشورة). في الواقع ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال الأخرى ، على سبيل المثال ، آلات اندماج الميتوكوندريا Mgm1-Ugo1 / Fzo124،25،26 أو Mdm31-Por1 ، والتي تشارك في التخليق الحيوي للفوسفوليبيد الكارديوليبين27 الخاص بالميتوكوندريا. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين الطريقة التي قادتنا إلى تحديد MICOS لتحديد Cqd1 كجزء من موقع اتصال جديد تم تشكيله مع مجمع الغشاء الخارجي Por1-Om1428. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن موقع الاتصال هذا يشارك أيضا في عمليات متعددة مثل توازن غشاء الميتوكوندريا ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوزيع الإنزيم المساعد Q28,29.

هنا ، استخدمنا اختلافا في التجزئة الموصوفة سابقا للميتوكوندريا9،30،31،32،33. تؤدي المعالجة الاسموزية للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وانكماش مساحة المصفوفة ، تاركة الغشاءين على مقربة فقط في مواقع الاتصال. وهذا يسمح لتوليد الحويصلات التي تتكون حصرا من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أو الغشاء الداخلي الميتوكوندريا أو في تحتوي على مواقع الاتصال من كلا الغشاء من خلال صوتنة خفيفة. نظرا لأن الغشاء الداخلي للميتوكوندريا يحتوي على نسبة بروتين إلى دهون أعلى بكثير ، فإن حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا تظهر كثافة أعلى مقارنة بحويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. يمكن استخدام الفرق في الكثافة لفصل الحويصلات الغشائية من خلال الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز الطافية. وهكذا ، تتراكم حويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بتركيزات منخفضة من السكروز ، بينما يتم إثراء حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا بتركيزات عالية من السكروز. تتركز الحويصلات التي تحتوي على مواقع التلامس بتركيزات السكروز المتوسطة (الشكل 2). يصف البروتوكول التالي هذه الطريقة المحسنة ، والتي تتطلب معدات ووقتا وطاقة أقل تخصصا مقارنة ببروتوكولنا الذي أنشأناهسابقا 32 ، بالتفصيل ويوفر أداة مفيدة لتحديد بروتينات موقع الاتصال المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المخازن المؤقتة وحلول المخزون

  1. اصنع محلول 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 7.4. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. تحضير 500 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 8.0. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير 2.4 متر السوربيتول في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.
  4. تحضير 2.5 متر السكروز في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.
  5. تحضير 200 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) في الأيزوبروبانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    تنبيه: PMSF سام إذا تم ابتلاعه ويسبب حروقا شديدة في الجلد وتلفا في العين. لا تتنفس الغبار ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية.
  6. تحضير 72٪ حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) في الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    تنبيه: قد يسبب TCA تهيج الجهاز التنفسي وحروق الجلد الشديدة وتلف العين. لا تتنفس الغبار ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية.
  7. تحضير المخزن المؤقت SM: 20 mM MOPS و 0.6 M السوربيتول ، درجة الحموضة 7.4.
  8. تحضير المخزن المؤقت للتورم: 20 مللي متر MOPS ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM PMSF ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، درجة الحموضة 7.4.
  9. تحضير مخازن تدرج السكروز: 0.8 م ، 0.96 م ، 1.02 م ، 1.13 م ، و 1.3 م سكروز في 20 مللي مول مماسح ، و 0.5 مللي مول EDTA ، درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: يمكن تخزين جميع المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية ؛ ومع ذلك ، يوصى بتخزين المخازن المؤقتة المحتوية على السكروز عند -20 درجة مئوية لتجنب نمو الفطريات. يجب إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني طازجة قبل الاستخدام.

2. توليد الحويصلات تحت الميتوكوندريا

  1. عزل الميتوكوندريا الخميرة الخام طازجة وفقا للبروتوكولات المعمول بها34,35.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم عزل الميتوكوندريا من Saccharomyces cerevisiae. توليد الميتوكوندريا النقية المتدرجة الخالية من العضيات الأخرى ليست ضرورية.
  2. أعد تعليق 10 ملغ من الميتوكوندريا المعزولة حديثا في مخزن مؤقت 1.6 مل SM (4 درجات مئوية) عن طريق السحب (الشكل 2 ، الخطوة 1).
  3. انقل معلق الميتوكوندريا إلى دورق Erlenmeyer المبرد مسبقا سعة 100 مل.
  4. أضف ببطء 16 مل من المخزن المؤقت للتورم باستخدام ماصة زجاجية سعة 20 مل. ضع تقليبا خفيفا ثابتا على الثلج أثناء الإضافة. ينتج عن هذه المعالجة التناضحية امتصاص الماء في مساحة المصفوفة. سيؤدي تورم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي. ومع ذلك ، سيبقى كلا الغشاءين على اتصال في مواقع الاتصال9 (الشكل 2 ، الخطوة 2).
  5. احتضان العينات تحت التحريك الخفيف المستمر لمدة 30 دقيقة على الثلج.
  6. أضف ببطء 5 مل من محلول السكروز 2.5 M باستخدام ماصة زجاجية 5 مل لزيادة تركيز السكروز في العينات إلى 0.55 M تقريبا. ينتج عن هذه المعالجة التناضحية تدفق المياه من المصفوفة36. يهدف انكماش الغشاء الداخلي إلى زيادة المسافة إلى الأجزاء المتبقية من الغشاء الخارجي. هذا يقلل من احتمال توليد حويصلات هجينة اصطناعية من الأغشية الداخلية والخارجية من خلال صوتنة (الشكل 2 ، الخطوة 3).
  7. احتضان العينات تحت التحريك الخفيف لمدة 15 دقيقة على الثلج.
  8. إخضاع الميتوكوندريا للصوتنة لتوليد حويصلات غشاء تحت الميتوكوندريا (الشكل 2 ، الخطوة 4).
    1. انقل تعليق الميتوكوندريا إلى خلية وردة مبردة مسبقا.
    2. قم بتنشيط تعليق الميتوكوندريا بسعة 10٪ لمدة 30 ثانية أثناء تبريد خلية الوردة في حمام جليدي.
    3. ضع التعليق لمدة 30 ثانية في حمام جليدي.
    4. كرر الخطوة 2.8.2 والخطوة 2.8.3 ثلاث مرات أخرى.
      ملاحظة: ستختلف شروط الصوتنة وفقا للصوتنة المستخدمة. سيكون التحسين ضروريا للأجهزة الفردية. سيؤدي Sonication القاسي للغاية إلى تكوين حويصلات اصطناعية تتكون من أغشية داخلية وخارجية للميتوكوندريا.

3. فصل الحويصلات تحت الميتوكوندريا

  1. افصل الحويصلات المتولدة عن الميتوكوندريا السليمة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سوف الميتوكوندريا السليمة بيليت بينما ستبقى الحويصلات في المادة الطافية.
  2. تركيز خليط الحويصلة.
    1. نقل طاف إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة.
    2. قم بتحميل وسادة سعة 0.3 مل من محلول السكروز 2.5 متر في قاع الأنبوب باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بقنية 0.8 مم × 120 مم.
    3. أجهزة الطرد المركزي عند 118000 × جم لمدة 100 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بنصف قطر أقصى يبلغ 153.1 مم. تعتمد ظروف الطرد المركزي بشدة على الدوار وسيتعين تكييفها عند استخدام دوار آخر.
  3. ستظهر الحويصلات كقرص في الجزء العلوي من وسادة السكروز بعد الطرد المركزي. تخلص من حوالي 90٪ من المادة الطافية. الآن ، احصد الحويصلات المركزة عن طريق تعليقها في المخزن المؤقت المتبقي بما في ذلك السكروز 2.5 متر عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. انقل التعليق إلى خالط Dounce المثلج.
  4. تجانس التعليق مع ما لا يقل عن 10 ضربات باستخدام الخزاف polytetrafluoroethylene.
  5. تحضير التدرج السكروز.
    1. بالنسبة لتدرج خطوة 11 مل مع خمس خطوات (1.3 م ، 1.13 م ، 1.02 م ، 0.96 م ، و 0.8 م سكروز في 20 مللي مول ممسحة و 0.5 مللي مول EDTA ، درجة حموضة 7.4) ، تحتوي كل طبقة على 2.2 مل من محلول السكروز.
      ملاحظة: يوصى باستخدام مقياس إنكسار لقياس وضبط تركيزات السكروز. ومع ذلك ، فإنه ليس ضروريا. ضع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت على مقياس الانكسار ، واكتشف مؤشرات الانكسار ذات الصلة. حساب تركيز السكروز على النحو التالي:
      معادلة تركيز السكروز في المولارية. رسم تخطيطي لتحليل قياس معامل الانكسار.
      1.3333 يمثل معامل الانكسار للماء. 0.048403 هو مؤشر تحويل خاص بالسكروز تم الحصول عليه من القياس الخطي للانكسار المولي إلى تركيز السكروز في المحاليل المائية 37.
    2. أضف أعلى تركيز للسكروز إلى أنبوب الطرد المركزي ، وضع الأنبوب عند -20 درجة مئوية. انتظر حتى يتم تجميد الطبقة تماما قبل تطبيق الطبقة التالية. استمر وفقا لذلك حتى تتم إضافة الطبقة الأخيرة ، وقم بتخزين التدرجات عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تذكر نقل التدرجات المجمدة إلى 4 درجات مئوية عند بدء التجربة للسماح بالتدرجات بالذوبان. سيستغرق هذا حوالي 3 ساعات. بالنسبة للطرد المركزي هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بسعة 13.2 مل. عند استخدام دوار مختلف ، يجب تكييف أحجام خطوة التدرج وفقا لذلك.
  6. قم بقياس تركيز السكروز للعينات باستخدام مقياس الانكسار. إذا لم يكن هناك وصول إلى مقياس الانكسار ، فيمكن للمرء أن يفترض بدلا من ذلك أن تركيز السكروز هو 2 M. سيكون تركيز السكروز المفترض هذا هو الأساس للخطوة التالية.
  7. اضبط تركيز السكروز على 0.6 متر عن طريق إضافة كمية مناسبة من 20 مللي مول MOPS ، 0.5 mM EDTA ، 1 mM PMSF ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، درجة الحموضة 7.4. إذا تم تقدير تركيز السكروز ب 2 متر بدلا من قياسه ، فمن المستحسن اختبار ما إذا كان التركيز منخفضا بدرجة كافية بعد التعديل. ضع حصة صغيرة من العينة (حوالي 50 ميكرولتر) فوق 200 ميكرولتر من السكروز 0.8 M في أنبوب اختبار. يجب أن تظل العينة فوق السكروز 0.8 M.
  8. قم بتحميل العينات (حوالي 1 مل) أعلى تدرج السكروز (احتفظ بنسبة 10٪ للرجوع إليها لاحقا). يعد السحب الدقيق أمرا مهما لتجنب اضطراب التدرج (الشكل 2 ، الخطوة 5).
  9. افصل الحويصلات عن طريق الطرد المركزي عند 200000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة. إذا أمكن ، اضبط جهاز الطرد المركزي على إبطاء التسارع والتباطؤ لتجنب اضطراب التدرج (الشكل 2 ، الخطوة 6).
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام دوار دلو متأرجح بنصف قطر أقصى يبلغ 153.1 مم. تعتمد ظروف الطرد المركزي بشدة على الدوار وسيتعين تكييفها عند استخدام دوار آخر.
  10. احصد التدرج من أعلى إلى أسفل في أجزاء 700 ميكرولتر باستخدام ماصة 1 مل. سيؤدي ذلك إلى 17 كسرا ، مما يسمح بدقة كافية.

4. تحليل الحويصلات تحت الميتوكوندريا

  1. تركيز البروتينات عن طريق إخضاع كل جزء لاثنين من ترسبات TCA التي يتم إجراؤها بالتتابع38 لإعداد عينات SDS-PAGE.
    1. أضف 200 ميكرولتر من 72٪ TCA إلى الكسور الفردية ، واخلطها حتى يصبح المحلول متجانسا. احتضان الكسور لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وحبيبات البروتينات المترسبة عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول TCA بنسبة 28٪ ، واخلطها جيدا ، وكرر خطوة الطرد المركزي.
    2. اغسل الكريات ب 1 مل من الأسيتون (-20 درجة مئوية) ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية, واترك الكريات تجف في الهواء. أعد تعليق الكريات في 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS ، واحتضان العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
      ملاحظة: ستبقى كمية كبيرة من السكروز ، خاصة في الأجزاء عالية الكثافة ، بعد هطول الأمطار TCA الأول. ستتم إزالة هذا من خلال هطول الأمطار TCA الإضافي.
  2. قم بتحليل 20 ميكرولتر من كل كسر بواسطة SDS-PAGE39 وimmunoblotting 40،41،42،43.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من السهل نسبيا فصل الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن توليد وفصل الحويصلات المحتوية على موقع الاتصال أكثر صعوبة. في رأينا ، هناك خطوتان حاسمتان وضروريتان: شروط الصوتنة والتدرج المستخدم.

عادة ، يعتقد أن التدرجات الخطية لها دقة أفضل مقارنة بتدرجات الخطوات. ومع ذلك ، فإن إنتاجها القابل للتكرار ممل ويتطلب معدات خاصة. لذلك ، أنشأنا طريقة لإنشاء تدرج خطوة مع اختلافات صغيرة نسبيا بين الخطوات الفردية (انظر الخطوة 3.5). لقد تكهننا بأن تدرج الخطوة سيكون متوازنا عند الطرد المركزي ، م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجزئة الميتوكوندريا هي تجربة معقدة مع عدة خطوات معقدة للغاية. لذلك ، كنا نهدف إلى زيادة تحسين ، وإلى حد ما ، تبسيط طريقتنا32 المعمول بها. هنا ، كانت التحديات هي الحاجة إلى معدات معقدة ومتخصصة للغاية ، والتي غالبا ما تكون إنشاءات فردية ، والوقت الهائل واستهلاك الطاقة. تحقيقا لهذه الغاية ، حاولنا إزالة المضخات والإنشاءات الفردية المستخدمة في صب وحصاد التدرج الخطي وتغييرها إلى تدرج متدرج. الأهم من ذلك ، أدركنا أنه ، على الأقل عند تحضيره كما هو موضح هنا ، يصبح التدرج خطيا أثناء الطرد المركزي ، مما يجع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعترف M.E.H. بالدعم المالي للمؤسسة الألمانية (DFG) ، المشروع رقم 413985647. يشكر المؤلفون الدكتور مايكل كيبلر ، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ، ميونيخ ، على دعمه السخي والواسع. نحن ممتنون لوالتر نيوبرت على مدخلاته العلمية ومناقشاته المفيدة وإلهامه المستمر. JF يشكر كلية الدراسات العليا لعلوم الحياة في ميونيخ (LSM) على الدعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
13.2 مل ، أنبوب فائق الوضوح Thinwall مفتوح ، 14 × 89 ممBeckman Instruments ، ألمانيا344059
50 مل ، أنبوب بولي كربونات مفتوح من الجدار السميك ، 29 × 104 ممBeckman Instruments ، ألمانيا363647
A-25.50 دوار بزاوية ثابتة - ألومنيوم ، 8 × 50 مل ، 25,000 دورة في الدقيقة ، 75,600 × جمBeckman Instruments ، ألمانيا363055
مقياس انكسار آبيزايس ، توقفت ألمانيا،
يمكن استخدام أي مقياس انكسار Abbe
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech ، الولايات المتحدة الأمريكيةBR26320توقفت ،
أي وحدة تحكم في ماصة تكفي دورق
1000 ملDWK Life Science ، ألمانياC118.1
Branson & nbsp ؛ سونيفايير رقمي W-250 Dبرانسون بالموجات فوق الصوتية ، الولايات المتحدة الأمريكيةFIS15-338-125
برانسون بالموجات فوق الصوتية 3 مم مدبب MICROTIPبرانسون الموجات فوق الصوتية ، الولايات المتحدة الأمريكية101-148-062
برانسون الموجات فوق الصوتية 200 و 400 واط سونيفايزر: خلية تبريد روزيتبرانسون الموجات فوق الصوتية ، الولايات المتحدة الأمريكية15-338-70
أجهزة الطرد المركزي Avanti JXN-26Beckman Instruments ، ألمانياB37912
جهاز طرد مركزي Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments ، ألمانيا8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche ، سويسرا11697498001
D-SorbitRoth ، ألمانيا6213
EDTA (ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلينديامين - رباعي الأسيتيك)روث ، ألمانيا8043
قارورة إرلينماير ، 100 ملروث ، ألمانياX747.1
، Kl. B ، 25: 0 ، 0.1هيرشمان ، ألمانيا1180170
ماصة متدرجة ، Kl. B ، 5: 0 ، 0.05هيرشمان ، ألمانيا1180153
حمام جليديneoLab ، ألمانيا  ؛ S12651
محرك مغناطيسي RCT أساسيIKA-Werke GmbH ، ألمانياZ645060GB-1EA
MOPS (3- (N-Morpholino) حمض البروبانسلفونيك) Gerbu، ألمانيا1081
MyPipetman Select P1000Gilson ، الولايات المتحدة الأمريكيةFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson ، الولايات المتحدة الأمريكيةFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson ، الولايات المتحدة الأمريكيةFP10005S
Omnifix 1 ملبراون ، ألمانيا4022495251879
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)سيرفا ، ألمانيا32395.03
قنية STERICAN 21 Gx4 4/5 0.8x120 ممبراون ، ألمانياقضيب 4022495052414
التحريك ، 15 ممVWR ، الولايات المتحدة الأمريكية442-0366
السكروزميرك ، ألمانياS8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Instruments ، ألمانيا331362
أنابيب الاختبارEppendorf ، ألمانيا3810X
مطاحن المناديل ، نوع Potter-Elvehjem ، وعاء زجاجي 2 ملVWR ، الولايات المتحدة الأمريكية432-0200
مطاحن المناديل ، نوع Potter-Elvehjem ، مكبس 2 مل مع طرف مسننVWR ، الولايات المتحدة الأمريكية432-0212
حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ( TCA)سيجما ألدريتش ، ألمانيا33731توقفت ،
أي TCA تكفي (CAS: 73-03-9)
TRISRoth ، ألمانيا4855
ماصة متدرجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399(2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769(2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1(2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MICOS SDS Page

مقالات ذات صلة