يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد النمط الظاهري الأيضي لخلايا الكلى المشتقة من الخزعة

636 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

يونيو 17, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة لإجراء التنميط الأيضي لخلايا الكلى المشتقة من الخزعة. تم تحسين النهج المقدم في الخنازير الذكور البالغة الأصحاء ولديه القدرة على تعزيز التقييم في الوقت الفعلي لصلاحية الطعم الخيفي للكلى. قد تساعد هذه الطريقة أيضا في الكشف عن علم الأحياء الجديد عبر أمراض الكلى المتعددة القائمة على التمثيل الغذائي.

الملخص

زراعة الكلى هي العلاج الأمثل لمرض الكلى في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، غالبا ما تفقد الكلى المزروعة قبل الأوان ، مع فقدان ما يصل إلى 50٪ من الكسب غير المشروع بعد 10 سنوات من الزرع. أحد الأسباب الرئيسية لفقدان الكسب غير المشروع المبكر هو الإصابة التي لحقت بالكسب غير المشروع في وقت الزرع ، والمعروفة باسم إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IRI). وظيفة الكسب غير المشروع المتأخرة (DGF) ، التي تعرف بأنها الحاجة إلى غسيل الكلى في الأسبوع الأول بعد الزرع ، هي مظهر من مظاهر IRI الشديد الذي يظهر السمات الوظيفية والنسيجية لإصابة الكلى الحادة (AKI). في حين أن الآليات التي تقود AKI لا تزال غير واضحة ، فإن الأدلة المتراكمة تشير إلى أن الوظيفة الأيضية المتغيرة في الطعم الخيفي تتوسط AKI وقد تكون سبب DGF. وبالتالي ، فإن فك رموز ومراقبة الأسس الأيضية ل IRI سيحسن قدرتنا على تشخيص ومنع AKI. توضح هذه المقالة طريقة فريدة لتقييم تنفس الميتوكوندريا (عن طريق معدل استهلاك الأكسجين) ، وتحلل السكر (معدل التحمض خارج الخلية) ، ومستويات ATP داخل الخلايا في تعليق خلايا الكلى المشتقة من خزعة الإبرة. تم تحسين المنهجية في الخنازير الذكور البالغة الأصحاء وتم التحقق من صحتها في نموذج الخنازير للزرع الذاتي. النهج المقدم لديه القدرة على تعزيز التقييم في الوقت الفعلي لصلاحية الطعم الخيفي الكلوي في العيادة. قد يكشف التمثيل الغذائي في الخزعات المشتقة من المريض أيضا عن بيولوجيا جديدة في أمراض الكلى الأخرى القائمة على التمثيل الغذائي.

المقدمة

زراعة الكلى هي العلاج الأمثل لمرض الكلى في المرحلةالنهائية 1،2،3،4. ومع ذلك ، غالبا ما تفقد الكلى المزروعة قبل الأوان ، مع فقدان ما يصل إلى 50٪ من الكسب غير المشروع في 10 سنوات بعد الزرع5. زاد المرضى المتضررون من معدلات المراضة والوفيات ويشكلون عبئا اقتصاديا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية6. أحد الأسباب الرئيسية لفقدان الكسب غير المشروع المبكر هو الإصابة التي لحقت بالكسب غير المشروع في وقت الزرع ، والمعروفة باسم إصابة نقص التروية وإعادة التروية (IRI). IRI هي إصابة لا مفر منها ناتجة عن انخفاض تدفق الدم ، يليها إعادة التروية7. يتميز نقص التروية بتراكم السكسينات في الأنسجة ، والذي يدفع تدفق الإلكترون العكسي في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى إنتاج الأكسيد الفائق والإصابة اللاحقة في وقت مبكر بعد إعادة التروية8. يزيد IRI في الأعضاء المزروعة من خطر عدم الوظيفة الأولية ، وتأخر وظيفة الكسب غير المشروع (DGF) ، والرفض ، ونتائج الكسب غير المشروع السفلية8،9. DGF ، الذي يعرف بأنه الحاجة إلى غسيل الكلى في الأسبوع الأول بعد الزرع9 ، هو مظهر من مظاهر IRI10 الشديد. من الناحية النسيجية ، يتجلى DGF المرتبط ب IRI على شكل نخر أنبوبي حاد (ATN) ، وإصابة الأوعية الدموية الدقيقة. من الناحية الوظيفية ، هناك انخفاض في معدل الترشيح الكبيبي (GFR) وإخراج البول ، وهي سمات إصابة الكلى الحادة (AKI) في الطعمالخيفي 11. على الرغم من أهميته ، لا توجد حاليا علاجات ل AKI المرتبط بنقص التروية وإعادة التروية. ينبع نقص العلاجات من الفهم غير المكتمل لآليات المرض ونقص العلامات لتحديد المرضى المعرضين لخطر الإصابة بخلل الكسب غير المشروع خلال النقاط الزمنية الحرجة التي قد تكون فيها الإصابة قابلة للعكس12.

تشير الأدلة المتراكمة إلى أن التمثيل الغذائي للطاقة المتغير في الطعم الخيفي يتوسط AKI وقد يدعم DGF13،14،15. تولد خلايا الكلى الطاقة عبر آليتين رئيسيتين: تنفس الميتوكوندريا وتحلل السكر16. في النظم الإقليدية ، يؤدي إعادة التروية إلى خلل وظيفي في الميتوكوندريا17. وبالتالي ، يصبح تحلل السكر هو المصدر الرئيسي للطاقة13،18،19،20. يعزز التحول الأيضي في IRI موت الخلايا البطانية الأنبوبية والأوعية الدموية الدقيقة ، مما يؤدي إلى AKI21،22،23،24. في عمل سابق ، ارتبط ATN بزيادة التعبير عن إنزيمات تحلل السكر وتغيير مستويات بروتينات الميتوكوندريا25 ، بما يتماشى مع IRI في الكسب غير المشروع13،18. علاوة على ذلك ، في نموذج الزرع الذاتي للكلى الخنازير ، أدى نقص التروية متبوعا بالتخزين البارد إلى انخفاض مستويات بروتينات الميتوكوندريا الكلوية وزيادة إفراز اللاكتات26. إجمالا ، ترسخ هذه النتائج الأهمية السريرية لمراقبة النمط الظاهري الأيضي للطعوم الخيفية الكلوية ، حتى قبل الزرع ، حيث يمكن أن تكون السمات الأيضية القاعدية في الطعم الخيفي تنبؤا بخلل الطعمالخيفي 27.

تم تطوير نماذج التنبؤ السريرية للمخاطر قصيرة المدى لرفض الطعم الخيفي وفقدانه28،29. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج تفتقر إلى الدقة ولا تأخذ في الاعتبار السمات الجزيئية للكسب غير المشروع30،31،32. تهدف الدراسات الحديثة إلى تلبية هذه الحاجة غير الملباة من خلال تحديد الأنماط الجزيئية على مستوى الأنسجة المرتبطة بنتائج الكسب غير المشروع السفلية ، مثل الخلل الوظيفي في الطعم الخيفي والرفض13،14،15،25،33،34. تعتمد هذه الدراسات على القياسات الجزيئية للحالة المستقرة في الجين33،34،35 ، والبروتين25،26 ، ومستوى المستقلب13،14 ، مما يترك صورة غير مكتملة للنمط الظاهري الأيضي للطعم الخيفي. ترجع هذه الفجوة في المعرفة جزئيا إلى عدم القدرة على قياس وظيفة التمثيل الغذائي وحالة الطاقة للعينات المشتقة من الكلى في لحظة معينة من الزمن. هناك ما يبرر تطوير بروتوكول موحد لتحديد النمط الظاهري الأيضي لخلايا الكلى المشتقة من الخزعة ، والذي يمكن ترجمته إلى دراسة عينات المرضى. توضح هذه المقالة سير عمل فريدا لتقييم تنفس الميتوكوندريا (عن طريق معدل استهلاك الأكسجين) ، وتحلل السكر (معدل التحمض خارج الخلية) ، ومستويات ATP داخل الخلايا في معلقات خلايا الكلى المشتقة من الخزعة. تم تحسين المنهجية باستخدام نوى خزعة الكلى من ذكور الخنازير البالغة الأصحاء. لتسهيل التنفيذ السريري في المستقبل ، تم الحصول على نوى الخزعة باستخدام إبرة 18 G ، كما هو الحال في البروتوكولات السريرية القياسية لأخذ عينات الطعم الكلوي36،37. أخيرا ، تم التحقق من فائدة تنفيذ البروتوكول في تمييز الظروف التجريبية في نموذج الخنازير للزرع الذاتي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية التابعة لمعهد البحوث العامة في تورنتو (رقم بروتوكول استخدام: 3652). تم الاعتناء بالحيوانات وفقا للجمعية الوطنية للبحوث الطبية ودليل رعاية المختبر ، المعهد الوطني للصحة (NIH) ، أونتاريو ، كندا. تم استخدام خمسة خنازير يوركشاير من الذكور البالغة من العمر 3 أشهر ، يزن كل منها حوالي 30 كجم ، في هذه الدراسة. ينقسم بروتوكول هذه المنهجية إلى الخطوات التالية: (1) تفكك نوى خزعة الكلى المفردة إلى معلقات الخلايا. (2) التنميط الأيضي لخلايا الكلى المشتقة من الخزعة ؛ و (3) قياس محتوى ATP في خلايا الكلى المشتقة من الخزعة. تم فصل جميع عينات الخزعة التي تم جمعها لوظيفة التمثيل الغذائي أو قياسات محتوى ATP في غضون 3 ساعات من الاسترجاع في خزانة السلامة البيولوجية. يظهر سير عمل المنهجية في الشكل 1. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تفكك نوى خزعة الكلى المفردة في معلقات الخلايا

  1. اجمع ثلاثة نوى خزعة من الأنسجة من القشرة الكلوية ، باستخدام نظام بندقية الإبرة المحورية (أي إبرة توجيه خارجية وإبرة خزعة داخلية)38. للترجمة السريرية ، يوصى باستخدام مسدس إبرة خزعة 18 جم39.
    ملاحظة: كن متسقا مع زاوية مسدس إبرة الخزعة (~ 45 درجة مئوية) وعمق الثقب (~ 20 مم) عند إجراء خزعات من قشرة الكلى.
  2. ضع كل قلب خزعة بحذر في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من RPMI 1640 على الجليد.
    1. قم بتقطيع أنسجة الخزعة إلى قطع صغيرة (بطول ≤2 مم) باستخدام مشرط على طبق بتري مقاس 6 سم يوضع على الثلج. باستخدام ملاقط منحنية رفيعة للغاية ، ضع شظايا الأنسجة من كل خزعة في أنبوب مختلف سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من وسط التفكك.
      ملاحظة: تتكون وسائط التفكك من وسط RPMI 1640 يحتوي على 0.1 مجم / مل DNase I ، و 10 مجم / مل كولاجيناز ، و 2990 وحدة / مل بروتياز محايد من Bacillus polymyxa. أثبت تفكيك خزعات الكلى البشرية باستخدام تركيبة الوسائط هذه أنه يزيد من صلاحية الخلية ويحافظ على تمثيل مجموعات الخلايا النادرة والهشة40.
  3. اسمح للتفكك لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (كتلة تسخين) مع تحريك متقطع (يوصى بتدوير الأنابيب كل 5 دقائق).
  4. بعد التفكك ، قم بتصفية معلقات الخلية من خلال أنابيب غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر.
  5. اشطف المصفاة بحجم 1: 1 من مصل الأبقار الجنينية 100٪ (FBS).
  6. قم بتجميع معلقات خلايا الكلى الثلاثة المشتقة من الخزعة في أنبوب واحد سعة 15 مل.
  7. قم بتحبيير الخلايا عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، وأعد تعليقها في 1 مل من RPMI 1640 التي تحتوي على 10٪ FBS. ينتج عن تعليق الخلية هذا عادة 0.8-1.2 × 106 خلايا.

2. التنميط الأيضي لخلايا الكلى المشتقة من الخزعة

ملاحظة: تدمج خطوة التنميط الأيضي قياس تحلل السكر (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) في محلل وظيفة التمثيل الغذائي ، بالإضافة إلى مستويات ATP داخل الخلايا باستخدام مجموعة تجارية.

  1. ترطيب ومعايرة لوحة المرافق للخرطوشة
    1. قبل يوم واحد من استرجاع العينة ، أضف 200 ميكرولتر من ddH2O إلى كل بئر من لوحة أداة الخرطوشة لمحلل وظيفة التمثيل الغذائي.
    2. احتضن لوحة أداة الخرطوشة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    3. في يوم استرجاع العينة، قم بإزالة ddH2O عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور متصلة بنظام تفريغ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول العيار (درجة الحموضة = 7.4) إلى كل بئر من لوحة مرافق الخرطوشة.
    4. احتضن لوحة أداة الخرطوشة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  2. طلاء الخلايا وتحضير وسائط الفحص ومركبات الإجهاد لقياسات وظيفة التمثيل الغذائي
    1. أضف 100 ميكرولتر من RPMI مع 10٪ FBS في كل بئر من لوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي 96 بئرا.
    2. افصل كمية صغيرة (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر) من معلق الخلية (تم الحصول عليها في الخطوة 1) في أنبوب مختلف ، وصمة عار الخلايا باستخدام صبغة استبعاد التريبان الأزرق.
    3. باستخدام غرفة العد ، حدد تركيز الخلايا الحية (التريبان الأزرق سالب)41 في المعلق الأصلي.
    4. قم بزرع الخلايا في كل من آبار الدراسة للوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي ، بكثافة 1.0 × 105 خلايا حية / بئر. تم تحديد رقم الخلية هذا بعد التحسين (انظر قسم النتائج التمثيلية).
      ملاحظة: لا تزرع الخلايا في أي من الزوايا الأربع للوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي ، حيث يتم استخدامها كفراغات.
    5. دع الخلايا تلتصق عن طريق احتضان لوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة).
    6. في اليوم التالي ، تأكد تحت المجهر من أن الخلايا في حد أدنى من التقاء 70٪ -80٪ (طبقة أحادية الخلية السليمة مهمة للتحديد الأمثل لمعلمات وظيفة التمثيل الغذائي).
    7. قم بإذابة كمية (40-50 مل) من الوسائط القاعدية الخالية من الفينول الأحمر عند 37 درجة مئوية ، لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    8. قم بإعداد 35 مل من وسائط الفحص عن طريق إضافة 2 ملي مولار من الجلوتامين (350 ميكرولتر) و 1 ملي مولار من البيروفات (350 ميكرولتر) و 5.55 ملي مولار من الجلوكوز (385 ميكرولتر) في 33.915 مل من الوسائط القاعدية المذابة مسبقا.
    9. باستخدام ماصة واحدة أو متعددة القنوات، قم بإزالة وسائط RPMI برفق من كل بئر دراسة للوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الوسائط القاعدية لغسل الخلايا.
    10. قم بإزالة الوسائط القاعدية برفق وأضف 150 ميكرولتر من وسائط الفحص إلى كل بئر ، بما في ذلك الآبار التي لا تحتوي على خلايا.
      ملاحظة: قد يؤثر ترك الآبار بدون وسائط الفحص على ظروف الرطوبة في بيئة اللوحة ويؤدي إلى قياسات غير متسقة لوظيفة التمثيل الغذائي (الشكل التكميلي 1).
    11. ضع لوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 1 ساعة (خطوة التأقلم). خذ لوحة أداة الخرطوشة (المحتضنة مسبقا في محلول العيار) مرة أخرى إلى خزانة السلامة البيولوجية.
    12. أثناء التأقلم ، قم بإعداد المحاليل الأربعة التالية لمركبات الإجهاد ، في وسائط الفحص: 7 ميكرومتر أوليغومايسين (7x ، للتركيز النهائي 1 ميكرومتر أوليغومايسين) ؛ 2.4 ميكرومتر كربونيل سيانيد -4 (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) (8x ، للتركيز النهائي 0.3 ميكرومولار FCCP) ؛ 450 ملي مولار 2-ديوكسي-جلوكوز (2-DG) (9x ، للتركيز النهائي 50 ملي مولار 2-DG) ؛ 10 ميكرومتر روتينون و 10 ميكرومتر أنتيمايسين أ (تعفن + AA) (10x ، للتركيز النهائي 1 ميكرومتر تعفن + 1 ميكرومتر AA).
      ملاحظة: يثبط أوليغومايسين نشاط سينسيز ATP وبالتالي يقطع سلسلة نقل الإلكترون (ETC). هذا يقلل من التعرف الضوئي على الحروف وتدفق البروتونات المدفوعة بسينسيز ATP إلى الميتوكوندريا. نتيجة لذلك ، يصبح تحلل السكر المصدر الرئيسي لإنتاج ATP42. FCCP هو دواء سيانيد (شحنة سالبة) يعمل كأداة فصل للفسفرة المؤكسدة ، عن طريق جذب البروتونات (الشحنة الموجبة) وإحداث تدفق مستمر للبروتون إلى الميتوكوندريا ، مما يتيح استهلاك الأكسجين بواسطة ETC بشكل مستقل عن نشاط سينسيز ATP43. 2-DG هو نظير هيكلي اصطناعي للجلوكوز يتم فيه استبدال مجموعة 2-hydroxyl بالهيدروجين ، ويعمل كمثبط تنافسي لتحلل السكر44. العفن و AA هي أدوية مثبطة للمجمعين الأول والثالث من سلسلة نقل الإلكترون ، على التوالي45. يتم تصوير آثار حقن كل دواء في خطوات مختلفة من اختبار وظيفة التمثيل الغذائي في الشكل التكميلي 2.
    13. قم بتحميل 25 ميكرولتر من كل دواء في المنفذ المقابل أعلى كل بئر من لوحة أداة الخرطوشة ، بما في ذلك الآبار الخالية من الخلايا. قم بتحميل الأدوية وفقا للتسلسل التالي: 7x oligomycin (المنفذ A) ، 8x FCCP (المنفذ B) ، 9x 2-DG (المنفذ C) ، 10x Rot + AA (المنفذ D).
    14. احتضان لوحة أداة الخرطوشة في الحاضنة الخالية من ثاني أكسيد الكربون2 حتى تكون مطلوبة لإعداد مقايسة وظيفة التمثيل الغذائي.
  3. تحديد استهلاك الأكسجين ومعدلات تحلل السكر في خلايا الكلى المشتقة من الخزعة
    1. تحقق من تشغيل محلل وظائف التمثيل الغذائي وتوصيله ببرنامج وحدة التحكم في كمبيوتر ملحق.
    2. قم بتشغيل البرنامج.
    3. انقر فوق الزر قالب > فارغ.
    4. في علامة التبويب الأولى ، انقر فوق الزر استراتيجية الحقن. انقر فوق كل زر بأحرف A أو B أو C أو D التي تتوافق مع منافذ الحقن الأربعة. اكتب اسم الدواء الذي سيتم حقنه من خلال كل منفذ: oligomycin (المنفذ A) ، FCCP (المنفذ B) ، 2-DG (المنفذ C) ، Rot + AA (المنفذ D).
    5. في علامة التبويب الثانية ، حدد جميع الشروط التجريبية. انقر فوق الزر إضافة شرط لتقديم شرط جديد. سيقوم البرنامج تلقائيا بتعيين لون لكل شرط. انقر فوق الزر خريطة اللوحة وقم بتعيين الحالة التجريبية المقابلة لكل بئر ، والتي سيتم تلوينها وفقا لذلك.
      ملاحظة: يجب أن تظل آبار الزوايا الأربعة مخصصة على أنها فارغة (اللون الأسود) ، حيث يتم استخدامها لطرح إشارة الخلفية.
    6. في علامة التبويب الثالثة ، انقر فوق الزر حقن أربع مرات ، بحيث تتم إضافة الحقن الأربعة (المنافذ A و B و C و D) إلى التسلسل. يمكن إجراء الاختبار باستخدام تسلسل الحقن الافتراضي (A ، B ، C ، D) ، وعدد القياسات (3 قياسات قاعدية + 3 قياسات بعد كل حقنة) ، والوقت بين القياسات (3 دقائق).
    7. في علامة التبويب الرابعة ، املأ المربعات بمعلومات الدراسة الأساسية ، وانقر فوق تشغيل. سيتم فتح الدرج ، وسيطلب البرنامج من المستخدم تركيب لوحة أداة الخرطوشة. تأكد من إزالة الغطاء الأخضر قبل وضع الطبق على الصينية.
    8. بعد المعايرة (~ 15 دقيقة) ، سيتم فتح الدرج مرة أخرى ، وسيطلب البرنامج من المستخدم إزالة لوحة أداة الخرطوشة ووضع لوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي على الدرج. مرة أخرى ، قم بإزالة غطاء اللوحة قبل تركيب اللوحة على الدرج. يمكن التخلص من لوحة المرافق للخرطوشة.
    9. سينتهي الفحص في حوالي 2 ساعة. بعد ذلك الوقت ، احفظ ملف ".asyr" المقابل. قم بتحليل ملفات .asyr حسابيا لفحص منحنيات ECAR و OCR. تصدير البيانات إلى التنسيق المفضل.
  4. قياس محتوى الحمض النووي لتطبيع بيانات وظيفة التمثيل الغذائي
    1. حدد كمية الحمض النووي في الخلايا في كل بئر بعد مقايسة وظيفة التمثيل الغذائي باستخدام مجموعة مقايسة تكاثر الخلايا المحددة (انظر جدول المواد).
    2. قم بإعداد الحجم المطلوب من 1x عازلة تحلل الخلايا عن طريق تخفيف 20x مخزن تحلل الخلايا في الماء منزوع الأيونات.
    3. لإعداد منحنى قياسي ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من معيار الحمض النووي للعاثية λ (المدرج في مجموعة مقايسة تكاثر الخلايا) المخفف بشكل متسلسل في مخزن مؤقت لتحلل الخلايا إلى تركيزات في حدود 0 نانوغرام / مل ، 12.5 نانوغرام / مل ، 25 نانوغرام / مل ، 50 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، 200 نانوغرام / مل ، 400 نانوغرام / مل ، 800 نانوغرام / مل. قم بتحميل كل تخفيف في بئر مختلف من صفيحة سوداء ذات 96 بئرا.
    4. قم بإعداد محلول ربط الصبغة 1x عن طريق تخفيف كاشف صبغة 400x في 1x عازلة تحلل الخلية. لكل بئر منحنى قياسي ودراسة فحص وظيفة التمثيل الغذائي جيدا ، ستكون هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر.
    5. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول صبغة 1x في العمود الأول ، والذي يحتوي بالفعل على المعايير. ملاحظة: يمكن بدء العملية حتى هذه النقطة قبل 30 دقيقة من نهاية تشغيل فحص وظيفة التمثيل الغذائي.
    6. قم بإزالة وسائط الفحص من لوحة مقايسة وظيفة التمثيل الغذائي باستخدام ماصة أحادية أو متعددة القنوات.
    7. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من محلول ربط الصبغة 1x إلى كل بئر دراسة للوحة فحص وظيفة التمثيل الغذائي. الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتحلل الخلايا ، ونقل المحتويات إلى اللوحة السوداء.
    8. قم بحماية الصفيحة الدقيقة من الضوء واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
    9. قم بقياس شدة التألق لكل عينة باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مضان مع إثارة عند 480 نانومتر واكتشاف الانبعاث عند 520 نانومتر.

3. قياس محتوى ATP في خلايا الكلى المشتقة من الخزعة

ملاحظة: قم بقياس كمية ATP في خلايا الكلى المشتقة من الخزعة باستخدام كاشف الكشف عن ATP المحدد ومعيار ATP المؤتلف (rATP) (انظر جدول المواد).

  1. إذا تم تجميدها ، قم بإذابة كاشف الكشف عن ATP عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. بعد الحصول على معلقات الخلايا المشتقة من الخزعة وعد الخلايا ، لوحة 1.0 × 104 خلايا حية / بئر في كل بئر من صفيحة بيضاء مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من وسائط RPMI 1640 مع 10٪ FBS. اترك العمود الأول من الصفيحة الدقيقة فارغا ، حيث سيتم استخدامه لتحميل منحنى قياسي rATP في اليوم التالي.
  3. احتضان الصفيحة الدقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي ، قم بتسخين كاشف الكشف عن ATP مسبقا في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإنشاء منحنى rATP القياسي. تحضير عينات 100 ميكرولتر من معيار rATP المخفف تسلسليا في PBS إلى التركيزات التالية: 0 نانومتر ، 0.001 نانومتر ، 0.01 نانومتر ، 0.1 نانومتر ، 1 نانومتر ، 10 نانومتر ، 100 نانومتر ، 1000 نانومتر.
  6. قم بتحميل 50 ميكرولتر من كل عينة قياسية rATP في العمود الأول من الصفيحة الدقيقة.
  7. قم بإزالة وسائط RPMI 1640 التي تحتوي على FBS بنسبة 10٪ من كل بئر دراسة صفيحة دقيقة، باستخدام ماصة أحادية أو متعددة القنوات.
  8. اغسل كل دراسة جيدا ب 100 ميكرولتر من PBS (دافئ مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية).
  9. قم بإزالة PBS وأضف 50 ميكرولتر من PBS الجديد في كل بئر دراسة.
  10. أضف 50 ميكرولتر من كاشف الكشف عن ATP في كل من الآبار القياسية والآبار الدراسية.
  11. امزج ، احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وبعد ذلك في RT لمدة 10 دقائق.
  12. قراءة وتسجيل اللمعان في قارئ الألواح الدقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم اختبار سير العمل في خلايا الكلى المشتقة من الخزعة من ذكور خنازير يوركشاير البالغة من العمر 3 أشهر. تم اتباع بروتوكول تفكك الأنسجة وطلاء الخلايا كما هو موضح أعلاه. بعد ترك الخلايا تلتصق لمدة 16 ساعة ، تم قياس OCR و ECAR في الوقت الفعلي في خلايا الكلى الخنازير المشتقة من الخزعة باستخدام محلل وظيفة التمثيل الغذائي ، كعلامات لتنفس الميتوكوندريا وتحلل السكر ، على التوالي.

هدفت التجربة الأولى إلى تحديد كثافة البذر المثلى لقياس موثوق لقيم OCR و ECAR والاستجابة المتوقعة للإجهاد الأيضي في خلايا الكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توضح هذه المقالة طريقة فريدة لتقييم الوظيفة الأيضية لخلايا الكلى التي تم الحصول عليها من الخزعات. اقترن بروتوكول للحصول على معلقات أحادية الخلية من خزعات الكلى الأساسية الجديدة بتحليل وظيفة التمثيل الغذائي ومستويات ATP داخل الخلايا. يتم تقييم تحلل السكر عن طريق قياس ECAR ، وتنفس الميتوكوندريا عن طريق قياس التعرف الضوئي على الحروف. تم استخدام خزعات الكلى المبورين لتحسين المنهجية.

لدراسة وظيفة الطاقة الحيوية بشكل فعال في الخلايا التي تم الحصول عليها عن طريق<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يمتلك أي من المؤلفين المشاركين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم AK من قبل مؤسسة شبكة الصحة الجامعية (الجوائز 579067450776 و 579072310776 و 579068260776). تم دعم SC-F من قبل برنامج التعليم الأساسي والتدريب الوطني لعلماء أبحاث الكلى (KRESCENT) (2019KPPDF637713 و 24KNIA-1291062).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134مثبط تنافسي لتحلل السكر
5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير
، مع مصفاة الخلية Snap Cap		Falcon352235أنابيب تفكك
Antimycin A من  ؛ Streptomyces  < / م > ص.SigmaA8674مثبط المركب الثالث من السلسلة التنفسية
AOF BP ProteaseVitaCyte003-1000إنزيم التفكك
Carbonyl cyanide 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي)
phenylhydrazone (FCCP)		SigmaC2920مفك اقتران الفسفرة المؤكسدة
CellTiter-Glo 2.0 الفحص ، 100 ملPromegaG9242قياس ATP
Collagenase MAVitaCyte001-2030إنزيم التفكك
CyQUANT مقايسة تكاثر الخلايا ، للخلايا في الثقافةInvitrogenC7026قياس الحمض النووي داخل الخلايا
D-الجلوكوز ، اللامائي ، الكاشف الصفBioshopGLU501الركيزة الأيضية
DNase IStemcell07469إنزيم
التفككمصل الأبقار الجنيني ، بريميوم ،
أمريكي الأصل ، معطل بالحرارة ، 500 مل		Wisent080-450مكمل وسائط التفكك
L-Glutamine-200 ملي مولار (100x) سائل (100 مل)Gibco25030081الركيزة الأيضية
Oligomycin ASigma75351مثبط ATP synthase
PBS ، -/- ، 500 ملWisent311-010-CLغسيل الخلية
rATP ، & nbsp; 10 مل,  0 ملليPromegaP1132قياس ATP
داخل الخلايا RotenoneSigmaR8875مثبط المركب I من سلسلة الجهاز التنفسي
RPMI 1640Gibco11875119وسائط التفكك
برنامج التحكم في موجة فرس البحر 2.6AgilentN / Aإعداد قياسات وظيفة التمثيل الغذائي Seahorse
Wave Desktop Software 2.6AgilentN / Aتحليل بيانات وظيفة التمثيل الغذائي
Seahorse XF الوسط الأساسي ،   ؛ بدون الفينول الأحمر ، 500 ملAgilent103335-100قياس وظيفة التمثيل الغذائي
Seahorse XFe96 FluxPak   ؛ (20 لوحة ، 18 خرطوشة ،
و 500 مل من محلول العيار)		Agilent102416-100قياس وظيفة التمثيل الغذائي
Seahorse XFe96 محلل وظيفة التمثيل الغذائيAgilent101991-100قياس وظيفة التمثيل الغذائي
محلول بيروفات الصوديوم 100 ملي مولار (100X) ، سائل 100 ملجيبكو11360070الركيزة الأيضية
داخل الخلايا

المراجع

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

زراعة الكلىإصابة نقص التروية وإعادة الترويةتأخر وظائف الطعمالإصابة الكلوية الحادةالتنفس الميتوكوندريمعدل استهلاك الأكسجينتقييم تحلل السكرمستويات ATP داخل الخلايا

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.