طرق التثقيب الكهربائي وتأكيد التحول في Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات للعمل مع Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ، مع تفصيل النمو ، وتحويل البلازميد ، ومستعمرة PCR ، وقياس بروتين مراسل الفلورسنت ، وإعداد البلازميد المصغر المحدود ، بالإضافة إلى المشكلات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تسمح هذه البروتوكولات بقياس بروتينات المراسل في DSM20016 ، أو التأكيد عبر مستعمرة PCR إذا لم يكن هناك مراسل.

Abstract

كانت Lactobacillus جنسا كبيرا ومتنوعا بشكل لا يصدق من البكتيريا يضم 261 نوعا ، كان العديد منها سلالات متعايشة مع إمكانية استخدامها كهيكل للمساعي البيولوجية الاصطناعية داخل الجهاز الهضمي. أدى الاختلاف الواسع في النمط الظاهري والنمط الجيني الذي لوحظ داخل الجنس إلى إعادة تصنيف حديثة وإدخال 23 جنسا جديدا.

نظرا لاتساع نطاق الاختلافات داخل الأجناس القديمة ، قد لا تعمل البروتوكولات الموضحة في أحد الأعضاء كما هو معلن مع الأعضاء الآخرين. أدى نقص المعلومات المركزية حول كيفية التعامل بالضبط مع سلالات معينة إلى مجموعة من الأساليب المخصصة ، والتي غالبا ما يتم تكييفها من عائلات بكتيرية أخرى. هذا يمكن أن يعقد الأمور بالنسبة للباحثين الذين يبدأون في هذا المجال ، والذين قد لا يعرفون المعلومات التي تنطبق أو لا تنطبق على السلالة التي اختاروها.

في هذه الورقة ، نهدف إلى مركزية مجموعة من البروتوكولات ذات النجاح الواضح ، وتحديدا في تسمية سلالة Limosilactobacillus reuteri F275 (أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشكلات الشائعة التي قد يواجهها المرء. يجب أن تمكن هذه البروتوكولات الباحث الذي لديه خبرة قليلة أو معدومة في العمل مع L. reuteri DSM20016 تحويل البلازميد ، وتأكيد التحول ، وقياس ردود فعل النظام في قارئ لوحة عبر بروتين مراسل.

Introduction

تم تصنيف جنس Lactobacillus تاريخيا على أنه إيجابي الجرام ، على شكل قضيب ، غير مكون للجراثيم ، إما لاهوائيات اختيارية أو محبة للميكروات تكسر السكريات لإنتاج حمض اللاكتيك¹ بشكل أساسي. أدت هذه المعايير الفضفاضة إلى كون Lactobacillus ، ظاهريا ووراثيا ، جنسا متنوعا للغاية. أدى هذا التصنيف الواسع إلى إعادة تصنيف الجنس ، حيث قدم 23 جنسا جديدا في عام 2020².

شمل الجنس القديم الأوسع أنواعا رئيسية من البروبيوتيك تعتبر عموما آمنة (GRAS) للاستهلاك³. تحافظ عائلة Lactobacillaceae على تصور عام بأنها "بكتيريا جيدة" بسبب العديد من الفوائد الصحية المبلغ عنها الممنوحة من خلال استهلاك سلالات مختلفة⁴،⁵،^6،7. تتحد السهولة التي يمكنهم من خلالها التنقل في الجهاز الهضمي⁸ وقبولهم العام لوضع سلالات Lactobacillaceae كمرشحين أقوياء مثل الكائنات الحية الشاسيه للتطبيقات الطبية أو العلاجية أو التشخيصية القابلة للابتلاع.

وقد أدت المجموعة الواسعة من الخصائص الموجودة داخل عائلة Lactobacillaceae إلى حالة لا توجد فيها سلالة فعلية من الكائنات الحية النموذجية. تميل مجموعات البحث إلى اختيار الأنواع ذات الخصائص الأكثر صلة بأهدافها الخاصة. (على سبيل المثال ، يمكن لمختبرات تخمير الألبان اختيار L. lactis ؛ قد تختار دراسات تخمير الخضروات L. plantarum ؛ قد تركز الأبحاث على البروبيوتيك على L. acidophilus ؛ وهكذا.)

وقد أدى هذا النطاق الواسع من الخصائص عبر الأنواع إلى تراكم البروتوكولات والإجراءات التي قد تعمل بشكل جيد لمجموعة فرعية واحدة من عائلة Lactobacillaceae ، ولكنها تتطلب التحسين للعمل بكفاءة (أو ربما للعمل على الإطلاق) في الآخرين⁹. هذه الحاجة إلى التحسين بين أفراد الأسرة وحتى داخل أفراد من نفس النوع يمكن أن تحبط جهود الباحثين غير المألوفين. يمكن أن تتضمن البروتوكولات المنشورة في أقسام الأساليب في الأوراق أيضا تعديلاتها الخاصة¹⁰ ، مما يؤدي إلى مجموعات بروتوكولات مجزأة ولامركزية.

يعتبر L. reuteri من الفقاريات على نطاق واسع ، ويوجد باستمرار في الثدييات والطيور¹¹ والأسماك¹² في الجهاز الهضمي (GI). غالبا ما تكون سلالات L. reuteri الفرعية متخصصة وراثيا ، عن طريق تكيف بروتين التصاق المخاط ، لاستعمار مضيفات محلية محددة بشكل دائم⁸،^11،13. يمكن عزل أنواع الجهاز الهضمي Limosilactobacillus في مضيفين خارج مضيفهم الأصلي ، ولكنها تميل أكثر نحو الطبيعة العابرة⁸.

نظرا لتخصص المضيف البشري ، فإن L. reuteri DSM20016 يضع نفسه بشكل جيد للغاية كهيكل للتطبيقات التشخيصية أو العلاجية في أي نقطة في الجهاز الهضمي البشري ، ويمكن أن يوفر DSM20016 الإجهاد نافذة تأثير طويلة الأمد للتدخلات عند مقارنتها بالسلالات الأكثر انتقالية.

في هذه الورقة ، نحدد سلسلة من البروتوكولات ذات الفعالية المثبتة في Limosilactobacillus reuteri (تسمية السلالة: F275 ؛ أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع معلومات مركزية عن السلالة من مصادر أخرى للمساعدة في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية والأنظمة. يجب أن تمكن الإجراءات المنصوص عليها هنا الباحث الذي ليس لديه خبرة سابقة من زراعة L. reuteri ، وإنشاء مخزون كهربي ، واختيار المستعمرات المحولة ، وتأكيد التحول عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة (PCR) ، وقياس استجابة النظام المصممة عبر بروتينات مراسل الفلورسنت.

نلاحظ أن البروتوكولات ذات الصلة قد غطت إعادة تجميع جينوم ssDNA بمساعدة CRISPR-Cas9 في L. reuteri (السلالة: ATCC-PTA-6475) 14 ، وتحرير الجينوم بمساعدة CRSIPR-Cas9 بمساعدة نيكاز في العديد من البقع غير L. reuteri ، بقع عائلة Lactobacillaceae ^15,16 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه لا تعالج سلالة L. reuteri DSM20016 التي هي محور تركيزنا هنا.

Protocol

1. تحضير L. reuteri DSM20016 الخلايا الكهربائية

ملاحظة: يستند هذا إلى بروتوكول أعده Berthier et ^al.17 ، مع سرعات الطرد المركزي التي أبلغ بها Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، قم بتلقيح L. reuteri من مخزون الجلسرين إلى 6 مل من مرق deMan Rogosa Sharpe (MRS). احتضان هوائي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
2. في صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 4 مل من الثقافة الليلية في 200 مل من مرق MRS (1:50 تخفيف).
3. السماح بالنمو هوائيا في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية حتى تصل قيمة الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) إلى 0.5-0.85 ؛ يجب أن يستغرق هذا حوالي 2-3 ساعات.
4. بمجرد الوصول إلى قيمة OD600 كافية ، صب الوسائط في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وضعها على الجليد أثناء موازنة الأنابيب.
5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 5000 × جم في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا ، 4 درجات مئوية.
6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كل حبيبة في 50 مل من المبرد مسبقا (0 درجة مئوية إلى 4 درجات مئوية) ddH₂O ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بنفس إعدادات الخطوة السابقة. الحفاظ على الخلايا على الجليد قدر الإمكان.
7. كرر الخطوة 1.6.
8. أعد تعليق كل حبيبة في 25 مل من ddH₂O: 0.5 M سكروز ، 10٪ جلسرين. جهاز طرد مركزي عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد الخلايا إلى الجليد.
9. أعد تعليق جميع الكريات في نفس 2 مل من ddH₂O: 0.5 م سكروز ، 10٪ جلسرين.
10. القسمة إلى أجزاء من 50 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا ؛ يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.

2. التثقيب الكهربائي ل L. reuteri

ملاحظة: تجنب سحب العينات قدر الإمكان في الخطوات التالية. ينصح بإدراج التثقيب الكهربائي للتحكم ، بدون إضافة البلازميد ، لضمان أن يكون اختيار المضادات الحيوية مناسبا.

1. خذ قسامة L. reuteri كاملة الكفاءة الكهربائية وقم بإذابة الثلج على الجليد.
2. امزج بلطف 5 ميكرولتر إلى 10 ميكرولتر من البلازميد (تركيز البلازميد النهائي >6 نانومتر) في القسمة المذابة ، وتجنب السحب قدر الإمكان.
3. انقله إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المبرد بالجليد بفجوة 1 مم.
4. إلكتروبورات عند 1.25 كيلو فولت و 400 Ω و 25 ميكروفولت.
5. أضف 1 مل من مرق MRS بدرجة حرارة الغرفة (RT) واخلطه عن طريق قلب الكوفيت مرة أو مرتين.
6. ضع الكوفيت في حاضنة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5-3 ساعات للسماح بالتعافي.
7. ضع الكمية بالكامل على ألواح أجار MRS متعددة مع الاختيار المناسب.
8. ضع الألواح داخل حاوية محكمة الإغلاق تماما مع شمعة صغيرة مضاءة ("شمعة صغيرة") وكيس مولد للجو اللاهوائي.
9. تنمو عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام أو حتى توجد مستعمرات مرئية.

3. قياس البروتين المراسل الفلوري المقاوم للأحماض mCherry2

1. اختر أي مستعمرات مطلوبة للقياس وقم بالتلقيح في صفيحة تخزين دقيقة مكونة من 96 بئرا مع 1.5 مل من مرق MRS المعقم بالمرشح (غير المعقم) لكل بئر ومضاد حيوي مناسب للاختيار.
2. احتضان هوائي لمدة 24 ساعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية دون رج.
   ملاحظة: يجب الاحتفاظ بصفيحة التخزين الدقيقة هذه للاستخدام في القسم 4 (مستعمرة PCR).
3. سوف يترسب L. reuteri خارج وسائل الإعلام عندما يكون في المرحلة الثابتة ؛ إعادة تعليق الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق الماصة.
4. انقل 200 ميكرولتر إلى لوحة مسطحة وواضحة القاع وذات 96 بئرا ، وانقل اللوحة إلى قارئ الألواح ، وقم بقياس OD ومضان mCherry2 (الإثارة [Ex]: 589 نانومتر ؛ الانبعاث [Em]: 610 نانومتر) أو المراسلين الآخرين ذوي الصلة.

4. تأكيد امتصاص البلازميد عن طريق مستعمرة PCR

1. من الصفيحة الدقيقة للتخزين المكونة من 96 بئرا من القسم 3 ، قم بنقل 5 ميكرولتر إلى أنبوب PCR.
   ملاحظة: إذا مرت >5 دقيقة ، فقد يكون من الضروري إعادة تعليق L. reuteri مرة أخرى.
2. في جهاز طرد مركزي صغير محمول على الطاولة ، قم بتدويره لأسفل حتى يمكن رؤية الحبيبات (حوالي دقيقتين عند 2,000 × جرام) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من 20 مللي متر هيدروكسيد الصوديوم.
3. تغلي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، دوامة ، وكرر الغليان مرة ثانية.
4. تبريد العينات على الفور ؛ حاول الاحتفاظ بالعينات على الجليد قدر الإمكان في الخطوات التالية لتقليل احتمالية تدهور القالب وتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل.
5. قم بالدوران في جهاز طرد مركزي صغير محمول على الطاولة عند 2000 × جم لمدة دقيقتين حتى يتم تكوير حطام الخلية ، ثم خذ 1 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخفيفها إلى 99 ميكرولتر من DDH₂O الخالي من DNase و RNase (تخفيف 100x).
6. استخدم التخفيف 100x كقالب DNA في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي باستخدام البادئات الخاصة بالبلازميد. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي مع بلازميد مشتق من E. coli mini-prep.
7. أعد العينات على الثلج وأضف صبغة تحميل مناسبة بتركيز 1x.
8. قم بتشغيله في جل أغاروز 1٪ في محلول TAE (حمض تريس أسيتات إيثيلين ديامينيترايتيك [EDTA]) عند 110 فولت لمدة 30 دقيقة. صورة إذا لزم الأمر.

5. بروتوكول التحضير المصغر ل L. reuteri ، متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد وجود البلازميد

ملاحظة: البروتوكول مخصص للاستخدام مع مجموعة أدوات التحضير المصغرة المدرجة في جدول المواد.

1. تلقيح L. reuteri في 10 مل من مرق MRS الذي يحتوي على مضاد حيوي مناسب واحتضانه طوال الليل هوائيا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
2. جهاز طرد مركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا 4 درجات مئوية.
3. اغسل الحبيبات في 2 مل من المخزن المؤقت القياسي P1 (مرفق مع المجموعة) من أجل إبطال الحموضة التي قد تتداخل مع الخطوات اللاحقة ، وأجهزة الطرد المركزي بنفس الإعداد كما هو موضح سابقا ، وتخلص من المادة الطافية.
4. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت P1 المعدل الذي يحتوي على 10 مجم / مل من الليزوزيم و 100 وحدة / مل من الطفرات من أجل تحلل الخلايا البكتيرية. احتضان لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
5. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت P2 ، واخلطه عن طريق التقليب أربع إلى ست مرات ، واحتضنه في RT لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
6. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت N3 (مضمن مع المجموعة) واقلب على الفور أربع إلى ست مرات برفق للخلط.
7. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جرام لمدة 10 دقائق.
8. نقل أكبر قدر ممكن من المواد الطافية إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
9. اغسل عمود الدوران ب 500 ميكرولتر من PB المخزن المؤقت (مرفق مع المجموعة) وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
10. اغسل عمود الدوران ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت PE (مرفق مع المجموعة) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية. تخلص من التدفق من خلال وأجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي.
11. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ضع 20-30 ميكرولتر من ddH 2 O الخالي من DNAse و RNAse على مرشح عمود الدوران واتركه لمدة_1-2دقيقة ، قبل الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية.
12. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي باستخدام البادئات الخاصة بالبلازميد (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA، pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA)، مع توفير الشطف للحمض النووي القالب. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي مع بلازميد مشتق من E. coli mini-prep.
    ملاحظة: إعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في هذه الدراسة هي: 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، (98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية) 30 دورة ، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 4 درجات مئوية عقد. تعتمد المعلمات بشكل كبير على البلمرة المستخدمة وطول الشظية والبادئات الدقيقة التي يستخدمها أي شخص يستخدم هذا البروتوكول.

Results

كفاءات التحول
لا يتطلب L. reuteri بلازميد dcm- / dam^- غير ميثيلي ، كما لوحظ بالنسبة ل Lactobacillaceae^19،20 الأخرى (انظر الشكل 1). يجب أن يعطي التثقيب الكهربائي ل L. reuteri DSM20016 مع 10 ميكرولتر من pTRKH3_mCherry2 البلازميد 8.5 كيلو بايت (أصل pAMβ1 ثيتا للتكرار) كفاءات تحويل تبلغ حوالي 80 وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) / ميكروغرام (من خمس إلى ثماني مستعمرات لكل 200 ميك...

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لتحويل L. reuteri DSM20016 هي توليد ظروف النمو اللاهوائي بعد التحولات المطلية. المستعمرات المكتسبة في الظروف الهوائية هي فقط عرضية جدا وتفشل عموما في النمو عند تلقيحها في مرق MRS. يجب أيضا ممارسة طلاء حجم الاسترداد بالكامل لزيادة احتمالية نمو المستعمرة. حتى مع هاتين الخطوتين الحاسمتين ، لا تزال كفاءة التحويل تشكل قيدا على التجريب ، حيث يمكن أن يصل عدد المستعمرات المتوقعة إلى واحد أو اثنين لكل لوحة أثناء التحولات (انظر الشكل 1).

تم استخ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي	NEB	N3200L
1 مل مقياس الطيف الضوئي كوفيتس	توماس ساینتفيك	1145J12
Agarose   ؛	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (جهاز طرد مركزي مبرد)	Beckman Allegra	N / A	لم يعد قيد الإنتاج
AnaeroGen 2.5 L كيس	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX ، نظام التثقيب الكهربائي ECM 399	VWR	58017-984
أنابيب الطرد المركزي (50 مل)	FroggaBio	TB50-500
هلام الحمض النووي x6 صبغة تحميل	NEB	B7024S
كوفيت التثقيب	الكهربائي Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
جل حمام كهربائي / قفص الاتهام	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	معهد لايبنيز DSMZ	DSM20016	تسمية سلالة F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.7 مل)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep (Qiagen)	تم استبدال Qiagen	27106	slpGFP بمراسل mCherry2 التأسيسي ، المحسن للكودون ، البروتين
مرق MRS (المجفف)	CM0359B		Thermo Scientific
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 ماصة	Eppendorf	3123000047
P1000 ماصة	Eppendorf	3123000063
P2.5 ماصة	Eppendorf	3123000012
P20 ماصة	Eppendorf	3123000039
P200 ماصة	Eppendorf	3123000055
أنابيب PCR	FroggaBio	STF-A120S
جهاز طرد مركزي شخصي على الطاولة	Genlantis	E200100
أطباق بتري	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N / A	لم يعد قيد الإنتاج
pTRKH3_slpGFP (معدل)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 مقياس الطيف	الحراري Scientific	840-281700
تخزين ميكروبليت	فيشر Scientific	14-222-225
السكروز	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	لم يعد قيد الإنتاج
حاضنة VWR 1500E	VWR	N / A	لم يعد قيد الإنتاج