Method Article

طرق التثقيب الكهربائي وتأكيد التحول في Limosilactobacillus reuteri DSM20016

DOI:

10.3791/65463

⸱

June 23rd, 2023

 , 
1University of Toronto Mississauga

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولات للعمل مع Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ، مع تفصيل النمو ، وتحويل البلازميد ، ومستعمرة PCR ، وقياس بروتين مراسل الفلورسنت ، وإعداد البلازميد المصغر المحدود ، بالإضافة إلى المشكلات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تسمح هذه البروتوكولات بقياس بروتينات المراسل في DSM20016 ، أو التأكيد عبر مستعمرة PCR إذا لم يكن هناك مراسل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت Lactobacillus جنسا كبيرا ومتنوعا بشكل لا يصدق من البكتيريا يضم 261 نوعا ، كان العديد منها سلالات متعايشة مع إمكانية استخدامها كهيكل للمساعي البيولوجية الاصطناعية داخل الجهاز الهضمي. أدى الاختلاف الواسع في النمط الظاهري والنمط الجيني الذي لوحظ داخل الجنس إلى إعادة تصنيف حديثة وإدخال 23 جنسا جديدا.

نظرا لاتساع نطاق الاختلافات داخل الأجناس القديمة ، قد لا تعمل البروتوكولات الموضحة في أحد الأعضاء كما هو معلن مع الأعضاء الآخرين. أدى نقص المعلومات المركزية حول كيفية التعامل بالضبط مع سلالات معينة إلى مجموعة من الأساليب المخصصة ، والتي غالبا ما يتم تكييفها من عائلات بكتيرية أخرى. هذا يمكن أن يعقد الأمور بالنسبة للباحثين الذين يبدأون في هذا المجال ، والذين قد لا يعرفون المعلومات التي تنطبق أو لا تنطبق على السلالة التي اختاروها.

في هذه الورقة ، نهدف إلى مركزية مجموعة من البروتوكولات ذات النجاح الواضح ، وتحديدا في تسمية سلالة Limosilactobacillus reuteri F275 (أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشكلات الشائعة التي قد يواجهها المرء. يجب أن تمكن هذه البروتوكولات الباحث الذي لديه خبرة قليلة أو معدومة في العمل مع L. reuteri DSM20016 تحويل البلازميد ، وتأكيد التحول ، وقياس ردود فعل النظام في قارئ لوحة عبر بروتين مراسل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصنيف جنس Lactobacillus تاريخيا على أنه إيجابي الجرام ، على شكل قضيب ، غير مكون للجراثيم ، إما لاهوائيات اختيارية أو محبة للميكروات تكسر السكريات لإنتاج حمض اللاكتيك1 بشكل أساسي. أدت هذه المعايير الفضفاضة إلى كون Lactobacillus ، ظاهريا ووراثيا ، جنسا متنوعا للغاية. أدى هذا التصنيف الواسع إلى إعادة تصنيف الجنس ، حيث قدم 23 جنسا جديدا في عام 20202.

شمل الجنس القديم الأوسع أنواعا رئيسية من البروبيوتيك تعتبر عموما آمنة (GRAS) للاستهلاك3. تحافظ عائلة Lactobacillaceae على تصور عام بأنها "بكتيريا جيدة" بسبب العديد من الفوائد الصحية المبلغ عنها الم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير L. reuteri DSM20016 الخلايا الكهربائية

ملاحظة: يستند هذا إلى بروتوكول أعده Berthier et al.17 ، مع سرعات الطرد المركزي التي أبلغ بها Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، قم بتلقيح L. reuteri من مخزون الجلسرين إلى 6 مل من مرق deMan Rogosa Sharpe (MRS). احتضان هوائي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
  2. في صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 4 مل من الثقافة الليلية في 200 مل من مرق MRS (1:50 تخفيف).
  3. السماح بالنمو هوائيا في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية حتى تصل قيمة الكثافة البصرية 600 نانو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كفاءات التحول
لا يتطلب L. reuteri بلازميد dcm- / dam- غير ميثيلي ، كما لوحظ بالنسبة ل Lactobacillaceae19،20 الأخرى (انظر الشكل 1). يجب أن يعطي التثقيب الكهربائي ل L. reuteri DSM20016 مع 10 ميكرولتر من pTRKH3_mCherry2 البلازميد 8.5 كيلو بايت (أصل pAMβ1 ثيتا للتكرار) كفاءات تحويل تبلغ حوالي 80 وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) / ميكروغرام (من خمس إلى ثماني مستعمرات لكل 200 ميك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوة الأكثر أهمية لتحويل L. reuteri DSM20016 هي توليد ظروف النمو اللاهوائي بعد التحولات المطلية. المستعمرات المكتسبة في الظروف الهوائية هي فقط عرضية جدا وتفشل عموما في النمو عند تلقيحها في مرق MRS. يجب أيضا ممارسة طلاء حجم الاسترداد بالكامل لزيادة احتمالية نمو المستعمرة. حتى مع هاتين الخطوتين الحاسمتين ، لا تزال كفاءة التحويل تشكل قيدا على التجريب ، حيث يمكن أن يصل عدد المستعمرات المتوقعة إلى واحد أو اثنين لكل لوحة أثناء التحولات (انظر الشكل 1).

تم استخ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر تقديرا كبيرا المشورة القيمة التي قدمها البروفيسور جي بي فان بيكرين (جامعة ويسكونسن ماديسون) ، الذي قدمت توجيهاته بشأن العمل مع L. reuteri ATCC PTA 6475 أساسا للطرق الموضحة هنا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويNEBN3200L
1 مل مقياس الطيف الضوئي كوفيتستوماس ساینتفيك1145J12
Agarose   ؛BioShopAGR001
Allegra X-15R (جهاز طرد مركزي مبرد)Beckman Allegra N / Aلم يعد قيد الإنتاج
AnaeroGen 2.5 L كيسThermo ScientificOXAN0025A
BTX ، نظام التثقيب الكهربائي ECM 399VWR58017-984
أنابيب الطرد المركزي (50 مل)FroggaBioTB50-500
هلام الحمض النووي x6 صبغة تحميلNEBB7024S
كوفيت التثقيبالكهربائي FisherbrandFB101
ErythromycinMillipore SigmaE5389-5G
جل حمام كهربائي / قفص الاتهامVWR76314-748
Glycerol BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriمعهد لايبنيز DSMZDSM20016تسمية سلالة F275
LysozymeBioShopLYS702.5
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.7 مل)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep (Qiagen)تم استبدال Qiagen27106slpGFP بمراسل mCherry2 التأسيسي ، المحسن للكودون ، البروتين 
مرق MRS (المجفف)CM0359BThermo Scientific
MutanolysinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH  Millipore Sigma1064691000
P100 ماصةEppendorf3123000047
P1000 ماصةEppendorf3123000063
P2.5 ماصةEppendorf3123000012
P20 ماصةEppendorf3123000039
P200 ماصةEppendorf3123000055
أنابيب PCRFroggaBioSTF-A120S
جهاز طرد مركزي شخصي على الطاولةGenlantisE200100
أطباق بتريVWR25384-088
PTC-150 Thermal CyclerMJ ResearchN / Aلم يعد قيد الإنتاج
pTRKH3_slpGFP (معدل)Addgene27168
SPECTRONIC 200 مقياس الطيفالحراري Scientific840-281700
تخزين ميكروبليتفيشر Scientific14-222-225
السكروزBioShopSUC507
TAE Buffer 50xThermo ScientificB49
VortexVWR58816-121لم يعد قيد الإنتاج
حاضنة VWR 1500EVWRN / Aلم يعد قيد الإنتاج
مجموعة الضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Limosilactobacillus ReuteriElectroporation ProtocolTransformation ConfirmationSynthetic Biology ChassisPlasmid TransformationGut Commensal BacteriaReporter Protein AssayGastrointestinal TractPlate Reader MeasurementTherapeutic Delivery

Related Articles