يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنتاج الخلايا على نطاق واسع على أساس الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان من الدرجة GMP

5.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65469

⸱

يوليو 7, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحقيق التصنيع على نطاق واسع للخلايا الملتصقة من خلال نظام مغلق تماما يعتمد على ناقلات دقيقة قابلة للذوبان من فئة GMP. تم التحقق من صحة زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية والخلايا HEK293T وخلايا Vero وتلبية متطلبات الكمية ومعايير الجودة لصناعة العلاج بالخلايا والجينات.

الملخص

واجه الباحثون في صناعة العلاج بالخلايا والجينات (CGT) منذ فترة طويلة تحديا هائلا في التوسع الفعال والواسع النطاق للخلايا. لمعالجة أوجه القصور الأساسية في نظام الاستزراع المستوي ثنائي الأبعاد (2D) ، قمنا بتطوير منصة إنتاج خلايا آلية مغلقة النطاق الصناعي (ACISCP) تعتمد على ناقل دقيق من الدرجة GMP وقابل للذوبان ومسامي لثقافة 3D للخلايا الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) وخلايا HEK293T وخلايا Vero. لتحقيق توسع واسع النطاق ، تم إجراء توسع على مرحلتين مع مفاعلات حيوية ذات خزان تحريك 5 لتر و 15 لتر لإنتاج 1.1 × 1010 hMSCs مع توسع إجمالي 128 ضعفا في غضون 9 أيام. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام ملء الخلايا. بالمقارنة مع الثقافة المستوية 2D ، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في جودة hMSCs التي يتم حصادها من ثقافة 3D. لقد قمنا أيضا بتطبيق هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان على أنواع الخلايا الشائعة الأخرى في قطاع CGT. على وجه التحديد ، تمت زراعة خلايا HEK293T وخلايا Vero لذروة كثافة الخلايا 1.68 × 107 خلايا / مل و 1.08 × 107 خلايا / مل ، على التوالي. توفر هذه الدراسة بروتوكولا لاستخدام منصة هندسة العمليات الحيوية التي تسخر خصائص الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من فئة GMP والمعدات المغلقة المتقدمة لتحقيق التصنيع على نطاق صناعي للخلايا الملتصقة.

المقدمة

شهدت صناعة CGT توسعا هائلا على مدار العقدين الماضيين. من المتوقع أن يؤدي تطور أدوية الجيل التالي إلى علاج وعلاج العديد من الأمراض المقاومةللحرارة 1. منذ أول موافقة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) على منتج CGT ، Kymriah ، في عام 2017 ، استمر البحث والتطوير المتعلق ب CGT في العالم في النمو بمعدل سريع ، حيث شهدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية زيادة تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية النشطة ل CGT إلى 500 في 20182. كان من المتوقع أن يكون عدد الموافقات على منتجات CGT على الأرجح 54-74 في الولايات المتحدة بحلول عام 20302.

في حين أن النمو السريع في أبحاث CGT والابتكار مثير ، لا تزال هناك فجوة تكنولوجية كبيرة بين الأبحاث المعملية والتصنيع على نطاق صناعي يمكن أن تقدم هذه الأدوية الواعدة للوصول إلى أكبر عدد ممكن من المرضى حسب الحاجة بتكاليف معقولة. تم إنشاء العمليات الحالية المعتمدة لهذه التجارب السريرية في المختبرات للتجارب الصغيرة ، وهناك حاجة إلى بذل جهود كبيرة لتحسين وابتكار تصنيع CGT3. هناك العديد من أنواع منتجات CGT ، يعتمد معظمها على الخلايا الحية ، والتي يمكن أن تكون خيفية أو ذاتية أو هندسية أو طبيعية. هذه الأدوية الحية أكثر تعقيدا بكثير من الكيانات الجزيئية الصغيرة أو البيولوجية ، مما يجعل التصنيع على نطاق واسع تحديا كبيرا4،5،6. في هذا العمل ، نوضح بروتوكول إنتاج الخلايا على نطاق واسع لثلاث خلايا تعتمد على المرسى والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في CGTs. وتشمل هذه الخلايا الجذعية / اللحمة المتوسطة البشرية (hMSCs) ، والتي تم استخدامها للعلاج القائم على الخلايا ، والخلايا HEK293T وخلايا Vero ، وكلاهما يستخدم لإنتاج فيروسات للهندسة الوراثية لمنتج الخلية العلاجية النهائي. عادة ما يتم استزراع الخلايا المعتمدة على المرساة على أنظمة مستوية ، والتي تتطلب معالجة يدوية. ومع ذلك ، تتطلب طرق الزراعة اليدوية قدرا كبيرا من العمالة وتكون عرضة للتلوث ، مما قد يضر بجودة المنتج النهائي. علاوة على ذلك ، لا يوجد تحكم في العملية على الخط ، مما يؤدي إلى تباين كبير في الجودة بين الدفعات7. إذا أخذنا العلاج بالخلايا الجذعية كمثال ، مع وجود خط أنابيب واعد يضم أكثر من 200 مرشح للعلاج بالخلايا الجذعية ، تشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى 300 تريليون hMSCs سنويا لتلبية متطلبات التطبيقات السريرية8. وبالتالي ، أصبح التصنيع على نطاق واسع للخلايا العلاجية شرطا أساسيا لإجراء هذه التدخلات العلاجية مع هذا الطلب العالي على الخلايا9.

وللحيلولة دون حدوث انتكاسات للنظم المستوية، بذلت جهود في تطوير عمليات تصنيع واسعة النطاق في المفاعلات الحيوية ذات الصهاريج المقلوبة ذات الناقلات الدقيقة التقليدية غير القابلة للذوبان10،11،12،13، ولكنها تعاني من إجراءات تحضير معقدة وكفاءة حصاد خلايامنخفضة 14. في الآونة الأخيرة ، ابتكرنا حاملا دقيقا قابلا للذوبان لتوسيع الخلايا الجذعية ، بهدف التحايل على تحديات حصاد الخلايا من الناقلات الدقيقة التجارية التقليدية غير القابلة للذوبان15. أظهرت هذه الحاملة الدقيقة المسامية ثلاثية الأبعاد القابلة للذوبان من فئة GMP ، 3D TableTrix ، إمكانات كبيرة لإنتاج الخلايا على نطاق واسع. في الواقع ، يمكن لثقافة 3D القائمة على هذه الناقلات الدقيقة المسامية أن تعيد إنشاء بيئات دقيقة مواتية للمحاكاة الحيوية لتعزيز التصاق الخلايا وانتشارها وهجرتها وتنشيطها16. يمكن للهياكل المسامية وشبكات المسام المترابطة للناقلات الدقيقة أن تخلق منطقة التصاق أكبر للخلايا وتعزز تبادل الأكسجين والمغذيات والمستقلبات ، وبالتالي إنشاء ركيزة مثالية لتوسيع الخلايا في المختبر 17. تتيح المسامية العالية لهذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان 3D من الدرجة GMP توسعا واسع النطاق ل hMSCs ، وتسمح القدرة على إذابة الخلايا بالكامل بالحصاد الفعال لهذه الخلايا الموسعة18. وهو أيضا منتج من الدرجة GMP وقد تم تسجيله كسواغ صيدلاني لدى المركز الصيني لتقييم الأدوية (أرقام الإيداع: F20210000003 و F20200000496)19 وإدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة (FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ FDA ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المخدرات الرئيسية رقم الملف: 35481)20.

هنا ، نوضح نظام إنتاج الخلايا الصناعية المغلقة الآلية (ACISCP)18 باستخدام هذه الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للتشتت والقابلة للذوبان ل hMSC وخلية HEK293T وتوسيع خلية Vero. لقد حققنا توسعا ناجحا من مستويين ل hMSCs (128 توسعة تراكمية في 9 أيام) من مفاعل حيوي سعة 5 لتر إلى مفاعل حيوي سعة 15 لترا وحصلنا أخيرا على ما يصل إلى 1.1 × 1010 hMSCs من دفعة واحدة من الإنتاج. تم حصاد الخلايا عن طريق إذابة الناقلات الدقيقة تماما ، وتركيزها وغسلها وصياغتها باستخدام نظام معالجة الخلايا القائم على الطرد المركزي المستمر التدفق ، ثم تم اقتباسها بنظام تعبئة الخلايا. علاوة على ذلك ، قمنا بتقييم جودة منتجات hMSC لتأكيد الامتثال. لقد أظهرنا أيضا تطبيق هذه الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان للإنتاج الموسع لنوعين آخرين من خلايا التثبيت ، خلايا HEK293T وخلايا Vero ، والتي يتم تطبيقها على نطاق واسع في صناعة CGT. بلغت ذروة كثافة الخلايا لخلايا HEK293T 1.68 × 10 7 خلايا / مل ، بينما بلغت ذروة كثافة خلايا Vero 1.08 × 107 خلايا / مل. يمكن تكييف نظام ACISCP لاستزراع مجموعة متنوعة من الخلايا الملتصقة ، ويمكن أن يصبح منصة قوية تساهم في تسريع تصنيع CGT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على الحبل السري البشري من مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ. تم إجراء جميع الإجراءات والبروتوكولات المتعلقة باكتساب وعزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (UCMSCs) بموافقة مستنيرة وبموافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين تسينغهوا تشانغينغ (رقم الإيداع 22035-4-02) ، وامتثلت الإجراءات والبروتوكولات لإعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة.

1. ثقافة أحادية الطبقة من hMSCs وخلايا HEK293T وخلايا Vero

  1. عزل UCMSCs البشرية الأولية من هلام وارتون وفقا للطريقةالمبلغ عنها 21. استخدم وسط استزراع hMSC الخالي من المصل (SF) لعزل ونمو UCMSCs الأولية ، وحصاد الخلايا عند الممر 2 ، والحفظ بالتبريد كبنك خلايا رئيسي (MCB).
  2. تلقيح 6 × 105 UCMSCs بشرية (يفضل المرور 2 أو المرور 3 خلايا) في قارورة T75 واحدة (أي أن كثافة البذر على الأوعية المستوية ثنائية الأبعاد هي 8000 خلية / سم2) للاستزراع أحادي الطبقة مع 15 مل من وسط زراعة SF hMSC الكامل. تأكد من البذر الموحد من خلال حركة الشكل الثامن للقارورة. الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا CO2 بنسبة 5٪ إلى التقاء 80٪ -90٪.
  3. للحصاد ، صب وسط زراعة الخلايا ، وشطف الخلايا ب 3-5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين. ثم أضف 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة حتى تصبح معظم الخلايا مستديرة وانفصلت عن القارورة ، كما لوحظ تحت مجهر مقلوب ساطع المجال بهدف 4x. أضف 3 مل من وسط زراعة SF hMSC لإنهاء عملية الهضم.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 179 × جم لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية ، وشطف حبيبات الخلية باستخدام PBS مرتين ، وإعادة التعليق في حوالي 3-5 مل من وسط زراعة SF hMSC للبذر إلى الناقلات الدقيقة في المفاعلات الحيوية.
    ملاحظة: تحقق من صلاحية الخلية ، وتأكد من أن الخلايا قابلة للحياة بنسبة >90٪. قم بإعداد الخلايا فقط بعد الانتهاء من جميع أعمال التحضير للمفاعلات الحيوية (الخطوات 2.1-3.6).
  5. بالنسبة للثقافة أحادية الطبقة لخلايا HEK293T وخلايا Vero ، قم بالتلقيح عند 2 × 106-3 × 106 خلايا في كل قارورة T75 ، وثقافة مع DMEM تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ مصل عجل حديثي الولادة (NBS) ، على التوالي.
  6. اتبع الخطوات 1.3-1.4 لحصاد الخلايا. أعد التعليق في 3-5 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.

2. تحضير المفاعل الحيوي للخزان المقلوب قبل بذر الخلية

  1. في اليوم −1 ، اشطف الوعاء الزجاجي جيدا بالماء الجاري منزوع الأيونات (DI) مرة واحدة.
  2. قم بتفكيك جميع الأنابيب والدفاعات غير القابل للصدأ من صفيحة الرأس ، واغمرها في ماء DI ، وقم بصوتنة بمنظف بالموجات فوق الصوتية عند 40 كيلو هرتز و 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتنظيف شامل.
    ملاحظة: ستكون الاستعدادات والإجراءات هي نفسها بالنسبة للتوسع من الدرجة الأولى في المفاعل الحيوي سعة 5 لتر والتوسع من المستوى الثاني في المفاعل الحيوي سعة 15 لترا. يتم إعطاء معلمات المفاعل الحيوي 15 L بين قوسين في جميع أنحاء. إذا لم يتم إعطاء أي معلمات بين قوسين ، فإن هذه المعلمات هي نفسها بالنسبة للمفاعلات الحيوية 5 L و 15 L.
  3. تحقق بعناية من أن جميع الحلقات O سليمة وفي مكانها ، ثم قم بتثبيت الأجزاء المفككة مرة أخرى على لوح الرأس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: استبدل أي حلقات O مهترئة أو ممزقة قبل التجميع إذا لزم الأمر. سوف تؤثر الحلقات O البالية على إحكام الإغلاق ، وبالتالي عقم الوعاء.
  4. أضف 7 لتر (18 لترا للمفاعل الحيوي سعة 15 لترا) من محلول 0.5 M NaOH في الوعاء سعة 5 لتر ، وضع صفيحة الرأس مع الأنابيب المجمعة على حافة الوعاء لغمر الأنابيب في محلول NaOH. دعها تقف لمدة 12 ساعة أو بين عشية وضحاها لإزالة السموم الداخلية من الأنابيب والأوعية الزجاجية.
    ملاحظة: لا تتجاوز 7 لتر (18 لتر) لأن هذا هو الحد الأقصى لحجم الوعاء الزجاجي سعة 5 لتر (15 لترا). ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع محلول NaOH ، لأنه يسبب التآكل.
  5. قم بإزالة لوح الرأس وصب محلول هيدروكسيد الصوديوم في زجاجة نفايات مناسبة. تخلص منه وفقا للوائح سلامة المختبر. اشطف الوعاء ولوح الرأس وأجزائه جيدا بماء DI الخالي من السموم الداخلية أو ماء للحقن لإزالة القلوية المتبقية.
  6. أضف 2 لتر (5 لتر) من PBS إلى الوعاء ، وأعد تجميع جميع الأجزاء ، وقم بتثبيت لوح الرأس بالإطار المعدني للسفينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. قم بتركيب عبوة مستهلكة لنظام مغلق على الأجزاء / الأنابيب / المنافذ المناسبة من الفولاذ المقاوم للصدأ (SS) على لوح الرأس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتثبيت جميع مشابك روبرت على الأنابيب ، ويوصى بالتعزيز عن طريق التثبيت باستخدام مرقئ. اترك أحد الأنابيب ، مع مرشح تهوية 0.22 ميكرومتر في النهاية متصل بالمكثف ، غير مثبت.
    ملاحظة: ضع أنابيب السيليكون على الأطراف الموجودة على مرقئ لمنع ثقب أنابيب السيليكون. ثبت فقط على أنابيب السيليكون ، وتجنب تثبيت أنابيب C-flex المضمنة في هذه المجموعة. سيسمح ترك أنبوب واحد على المكثف غير مثبت بتخفيف الضغط أثناء التعقيم.
  8. قم بإعداد 250 مل من محلول 0.1 M NaOH في زجاجة زجاجية GL 45 قابلة للتعقيم سعة 500 مل ، وتناسب مع غطاء لولبي موصل متعدد المنافذ GL 45 مع منفذين. قم بتوصيل أنبوب سيليكون بطول 180 مم ، 0.13 بوصة × 0.25 بوصة (القطر الداخلي × القطر الخارجي) بأحد المنافذ الموجودة على الجانب السفلي من الغطاء ؛ يجب أن يكون الطول طويلا بما يكفي للمس قاع الزجاجة.
  9. قم بتوصيل قطعة أخرى من أنبوب السيليكون ، بطول 500 مم أطول من سابقتها ، بنفس المنفذ على الجانب العلوي من الغطاء ، وقم بتوصيل الطرف الآخر بمنفذ تغذية بالتنقيط على لوح رأس الوعاء سعة 5 لتر. قم بتوصيل مرشح فتحة تهوية 0.22 ميكرومتر بالمنفذ الآخر الموجود على الغطاء اللولبي.
  10. قم بإجراء معايرة من نقطتين على مسبار الأس الهيدروجيني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، أدخل مجسات الأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب (DO) وعدد الخلايا الحية في الوعاء في منافذ PG13,5 المناسبة ، وقم بإحكام على لوح الرأس.
  11. قم بإجراء فحص محكم للوعاء المجمع بالكامل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حافظ على ضغط 0.4 بار ± 0.01 بار لمدة 30 دقيقة على الأقل. حرر الضغط ببطء بعد اجتياز النظام للاختبار. إذا فشل اختبار إحكام الهواء ، فابحث بعناية عن نقاط التسرب ، وقم بتعزيز مجموعة السفينة.
  12. الأوتوكلاف الوعاء المجمع بالكامل مع المجموعة الاستهلاكية عند 15 رطل لكل بوصة مربعة و 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد التعقيم ، تحقق من جميع مرشحات فتحات التهوية للتأكد من أنها سليمة وجافة. إزالة جميع مرقئ.
    ملاحظة: لن يقوم مرشح فتحة الهواء الرطب بتصفية الغاز بكفاءة وقد يضر بعقم الوعاء أثناء زراعة الخلايا. قم بتغيير مرشحات فتحات التهوية إذا كانت مبللة ، وقم بتعقيم الوعاء بأكمله مرة أخرى.
  13. انقل الوعاء المعقم إلى غرفة الأبحاث ، وانتظر حتى يبرد تماما إلى درجة حرارة الغرفة. أدخل مسبار درجة الحرارة في أنبوب thermowell ، وقم بتوصيل الكابلات للمحرك ، ومسبار الأس الهيدروجيني ، ومسبار DO من وحدة التحكم إلى الأجزاء المعنية على الوعاء. لف حصيرة الحرارة حول الوعاء بإحكام.
  14. قم بفك مشابك Robert على الأنابيب المرنة الموجودة على مكثف غاز العادم ، و sparger الحلقي ، ومنفذ التغذية بالتنقيط ل NaOH ، ومنفذ تراكب الهواء. قم بتشغيل وحدة التحكم ، وقم بتسجيل الدخول ، وأدخل المعلمات المدرجة في الجدول 1 في النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لا ينبغي تثبيت هذه الأنابيب في أي وقت أثناء عملية الاستزراع.
  15. انقر فوق ابدأ ، وقم بتسمية التجربة لبدء المفاعل الحيوي. اسمح للمفاعل الحيوي بالعمل على هذه الإعدادات لمدة 12 ساعة على الأقل ، أو طوال الليل ، لتشبع PBS بالأكسجين من أجل إجراء معايرة من نقطة واحدة لمسبار الأكسجين المذاب لاحقا.
  16. قم بمعايرة سرعة حجم مناولة السوائل للمضخة 1 والمضخة 2 على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. قم بتركيب أنبوب سيليكون 0.13 بوصة × 0.25 بوصة على كل مضخة على حدة ، مع غمس أحد طرفيه في زجاجة ماء وإدخال الطرف الآخر من الأنبوب في أسطوانة قياس.
  17. اضبط سرعة دوران المضخة على 300 دورة في الدقيقة ، والوقت لمدة 1 دقيقة. لاحظ كمية المياه التي يتم صرفها في أسطوانة القياس لكلا المضختين. ستكون هناك حاجة إلى هذه الأرقام للخطوات اللاحقة.
  18. قم بإعداد 500 مل من وسط زراعة SF hMSC وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واستبدل غطاء الزجاجة المتوسطة لزراعة الخلايا بحاوية C-Flex EZ Top لإغلاق الحاوية يمكن التخلص منها وغطاء متوافق. قم بإجراء استبدال الغطاء داخل خزانة السلامة البيولوجية (BSC).
  19. قم بلحام أنبوب المخرج على زجاجة متوسطة إلى أنبوب C-flex مدخل على زجاجة 10 جم من ناقلات W01 الدقيقة المعقمة مسبقا ل MSC. قم بتركيب جزء من الأنبوب على المضخة 1 من وحدة التحكم في المفاعل الحيوي ، واضبط دوران المضخة على 300 دورة في الدقيقة ، وضخ جميع وسائط الاستزراع من الزجاجة إلى زجاجة الناقلات الدقيقة. قم بتخزين هذه الناقلات الدقيقة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام في اليوم 0.
    ملاحظة: يجب تحضير الناقلات الدقيقة في اليوم −1. بالنسبة لاستزراع المفاعل الحيوي سعة 15 لترا ، قم بإعداد أربع زجاجات (أي 40 جم ، مع 4 × 500 مل من وسط SF) في المجموع.

3. بذر الخلايا ، والاستزراع ، والحصاد في مفاعل حيوي ذو خزان تحريك سعة 5 لتر

  1. في اليوم 0 ، قم بإجراء معايرة من نقطة واحدة ، وتحديدا 100٪ ، لمسبار الأكسجين المذاب على وحدة التحكم في المفاعل الحيوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. المفاعل الحيوي ذو الخزان المقلوب جاهز الآن لزراعة الخلايا.
  2. قم بإعداد زجاجة زجاجية سعة 2 لتر (5 لتر) لجمع النفايات ، وقم بتركيبها مع غطاء لولبي GL 45 متعدد المنافذ مع منفذين ، مع أنابيب C-Flex مقاس 30 مم ، 0.25 بوصة × 0.44 بوصة متصلة بكلا المنفذين ، وأجهزة الأوتوكلاف للتعقيم. قم بلحام أنبوب C-flex من أحد المنافذ من زجاجة النفايات إلى أنبوب الحصاد على الصفيحة الأمامية لوعاء المفاعل الحيوي باستخدام لحام أنبوبي.
  3. أوقف درجة الحرارة ودرجة الحموضة والتحكم في الأكسجين المذاب على وحدة تحكم المفاعل الحيوي مؤقتا ، وقم بتثبيت أنبوب السيليكون المتصل بأنبوب الحصاد على المضخة التمعجية 2 في اتجاه تدفق السائل الصحيح ، وقم بتوزيع جميع PBS بالكامل من الوعاء في زجاجة النفايات. أخرج الأنبوب من المضخة ، وأغلق زجاجة النفايات وافصلها.
    ملاحظة: قم دائما بفك أي مشابك روبرت على الأنابيب المرنة المشاركة في تدفق السائل في كل خطوة. قم بالتثبيت مرة أخرى بعد اكتمال نقل السائل قبل الختم والفصل. مشبك أقرب نحو جانب لوح الرأس. يجب إجراء فك التثبيت والتثبيت لجميع الخطوات اللاحقة ما لم ينص على خلاف ذلك.
  4. قم بإعداد 7 لتر (30 لتر) من وسيط SF hMSC الكامل ، واستبدل كل غطاء زجاجة أصلي بحاوية C-Flex EZ Top للإغلاق يمكن التخلص منها وغطاء متوافق. قم بلحام وحدة ترشيح للاستخدام مرة واحدة بأحد المنافذ الموجودة في حقيبة التخزين ذات الاستخدام الواحد سعة 10 لتر (50 لترا). قم بإجراء عملية استبدال الأغطية داخل BSC.
  5. قم بتصفية ونقل وسيط الاستزراع إلى كيس التخزين ، زجاجة واحدة في كل مرة ، عن طريق لحام زجاجات وسط زراعة الخلايا إلى الطرف الآخر من مرشح الكبسولة واستخدام المضخة على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. تعيين ككيس الأعلاف.
  6. قم بلحام منفذ مخرج واحد من كيس التغذية إلى أنبوب C-flex على أنبوب التغذية الخاص بالصفيحة الأمامية ، وقم بتثبيت الأنبوب لضخ 1 على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. قم بلحام منفذ المخرج الآخر من كيس التغذية إلى أنبوب النزف ، وقم بتثبيت الأنبوب لضخ 2 على وحدة تحكم المفاعل الحيوي في الاتجاه الصحيح لتدفق السائل.
    ملاحظة: قم بتثبيت القسم الموجود على خط تدفق السوائل ، المصنوع من أنابيب السيليكون ، على المضخة للحصول على مقاومة أفضل للتآكل والتمزق مقارنة بأنابيب C-Flex. تأكد من تثبيت الأنابيب في الاتجاه الصحيح.
  7. اضبط سرعة المضخة 1 على 300 دورة في الدقيقة ، وأوقف المضخة بعد توزيع 1 لتر (5 لتر) من الوسط من كيس التغذية في الوعاء ، بناء على سرعة توزيع الحجم المذكورة في الخطوة 2.17. ابدأ تشغيل التحكم في درجة الحرارة والأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب مرة أخرى، بنفس الإعدادات الموضحة في الخطوة 2.14.
  8. أغلق وافصل الأنبوب الذي يربط كيس التغذية بأنبوب التغذية الموجود على لوح الرأس. قم بلحام أنبوب C-Flex من زجاجة الناقلات الدقيقة المشتتة المحضرة في الخطوة 2.18 إلى أنبوب التغذية ، وضخ كل المحتوى من الزجاجة إلى الوعاء. أغلق وافصل الزجاجة الفارغة لتعليق الناقل الصغير. قم بتطهير سطح الزجاجة بالكامل باستخدام 75٪ من الإيثانول ، وضعها في BSC لاستخدامها كزجاجة نقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: اترك قطعة أطول من أنبوب C-Flex على جانب لوح الرأس عند إغلاق وفصل الملحقات التي تستخدم لمرة واحدة ، حيث سيتم تنفيذ خطوات لحام وفصل متعددة على نفس الأنبوب في الخطوات التالية.
  9. تأكد من أن درجة الحرارة الموضحة على وحدة التحكم تصل إلى حالة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية ، والتي تستغرق عادة حوالي 30 دقيقة ، قبل الشروع في تحضير خلايا البذور كما في الخطوات 1.3-1.4. أعد تعليق 2.5 × 108 hMSCs في 500 مل من وسط SF ، وانقله إلى الزجاجة الفارغة التي كانت تحتوي سابقا على تعليق الناقل الصغير.
    ملاحظة: يجب تحضير خلايا البذور لتوسيع المفاعل الحيوي 15 لترا وفقا للخطوة 3.21 ، بهدف تلقيح 1.0 × 109 خلايا في 500 مل.
  10. قم بلحام أنبوب C-Flex من الزجاجة التي تحتوي الآن على تعليق الخلية إلى منفذ التغذية على لوح الرأس ، وضخ جميع المحتويات من الزجاجة إلى الوعاء لبدء التلقيح الخلوي إلى الناقلات الدقيقة. أغلق الزجاجة الفارغة وافصلها. أعد لحام منفذ التغذية من كيس التغذية إلى أنبوب التغذية الموجود على لوح الرأس.
  11. اضبط إعدادات التقليب على وحدة التحكم للسماح بالتحريك المتقطع لتحسين كفاءة التلقيح ل hMSCs عن طريق تعيين المعلمات التالية: V1 = 35 (30) دورة في الدقيقة / 5 دقائق ؛ V2 = 0 دورة في الدقيقة / 25 دقيقة ؛ عدد الدورات = 12 (24) ؛ سرعة التحريض النهائية = 35 (30) دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن تعديل سرعة التقليب إلى 40 (35) دورة في الدقيقة أو 45 (40) دورة في الدقيقة إذا لوحظ توزيع أو ترسيب غير منتظم للناقلات الدقيقة أثناء عملية الاستزراع.
  12. قم بإعداد نظام آلي للملحق والتبادل الوسيط على وحدة التحكم في المفاعل الحيوي في واجهة التبادل المتوسط. قم بتعيين معلمات زراعة hMSC كما هو مذكور في الجدول 2.
    ملاحظة: قم بفك أي مشابك روبرت على الأنابيب المرنة المشاركة في تدفق السائل في هذه المرحلة ، خاصة بالنسبة لأنبوب التغذية والنزيف. حافظ على هذه غير مثبتة خلال عملية الثقافة بأكملها.
  13. خذ العينات من خلال أنبوب أخذ العينات عن طريق توصيل أكياس أخذ العينات التي تستخدم لمرة واحدة عبر موصلات Luer في النقاط الزمنية المطلوبة ، عادة مرة واحدة كل يوم ، واقتباس 10 مل في كل مرة في كيس أخذ العينات. قسمة 2-3 مل من العينة في كيس أخذ العينات الأول ، وتجاهل ، ثم قسمة 10 مل الفعلية من العينة في كيس أخذ عينات جديد في كل مرة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون العينة الأولية 2-3 مل سائلة متبقية في الأنبوب من النقطة الزمنية السابقة لأخذ العينات وقد لا تمثل بدقة الحالة في الوعاء. قم دائما بتنفيذ هذه الخطوات بإجراءات معقمة إضافية عن طريق تعقيم موصلات Luer قبل وبعد إجراء أو قطع التوصيلات بنسبة 75٪ من الإيثانول.
  14. نقل العينات المأخوذة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. قم بإجراء الاختبارات التالية على العينات.
    1. خذ 200 ميكرولتر من تعليق الناقل الدقيق المحمل بالخلايا ، وقم بتلطيخه باستخدام تلطيخ مزدوج لخلية Calcein-AM / PI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مراقبة تحت المجهر مضان.
    2. ترسب الناقلات الدقيقة عن طريق الجاذبية ، والتي تستغرق عادة 5-10 دقائق. نضح المادة الطافية ، واختبر تركيز الجلوكوز باستخدام مقياس الجلوكوز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ارسم تمثيلا بيانيا لمستوى الجلوكوز.
    3. احتضان الناقلات الدقيقة المحملة بالخلايا المترسبة بمحلول هضم طازج 3-5 مل من 1 مجم / مل عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة لإذابة الناقلات الدقيقة بالكامل. عد الخلايا بعد تلطيخها باستخدام AO / PI باستخدام محلل خلية مضان آلي. ارسم منحنى نمو الخلية. ارتبط بمنحنى نمو الخلايا الحية في الوقت الفعلي الذي تم إنشاؤه على وحدة التحكم.
  15. في اليوم 4 أو اليوم 5 من الثقافة، قم بإعداد 50 مل (200 مل) من محلول الهضم عند 30 ملغ/مل. تتراوح نسبة كتلة العمل بين محلول الهضم والناقلات الدقيقة القابلة للذوبان من 3:20 إلى 5:20. مرشح معقم مع مرشح كبسولة 0.22 ميكرومتر ، ويخفف أكثر في 500 مل (2 لتر) من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم. انقله إلى كيس تخزين سعة 3 لتر.
    ملاحظة: قم بإعداد محلول الهضم فقط قبل حصاد الخلايا مباشرة. حاول أن تستهدف ما لا يقل عن 1.0 × 10 9-1.2 × 109 خلايا لتوسيع الطبقة الأولى و 1.0 × 1010 خلايا لتوسيع الطبقة الثانية. إذا كانت الخلايا تنمو بشكل أسرع ، فقم بالحصاد في اليوم 4 ؛ إذا لم يكن كذلك ، الحصاد في اليوم 5. لا ينصح بتجاوز اليوم 5.
  16. اضبط سرعة التحريض على 0 على وحدة التحكم حتى تستقر الناقلات الدقيقة ، وهو ما يحدث عادة في غضون 20 دقيقة. قم بإيقاف تشغيل بروتوكول التبادل الوسيط الآلي ، وأوقف درجة الحرارة ودرجة الحموضة والتحكم في الأكسجين المذاب على وحدة تحكم المفاعل الحيوي. ابدأ المضخة يدويا 2 عند 300 دورة في الدقيقة على وحدة التحكم ، وقم بتوزيع المادة الطافية في نظام التغذية لترك حوالي 1 لتر (2 لتر) من تعليق الاستزراع في الوعاء (باستخدام سرعة توزيع الحجم المذكورة في الخطوة 2.17 أو القياس من علامات التخرج على جسم الوعاء). أغلق كيس التغذية وافصله تماما.
  17. قم بلحام كيس محلول الهضم الطازج من الخطوة 3.15 إلى أنبوب التغذية ، وضخ جميع المحتويات في الوعاء. ابدأ سرعة التحريض عند 45 (40) دورة في الدقيقة. تأكد من أن التحكم في درجة الحرارة لا يزال يحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. سوف تذوب الناقلات الدقيقة في غضون 40-60 دقيقة. خذ 1 مل من العينة باستخدام حقنة قفل Luer معقمة لمدة 30 دقيقة وبعد ذلك كل 5-10 دقائق للمراقبة تحت مجهر المجال الساطع للتحقق من انحلال الناقلات الدقيقة.
  18. بعد إذابة الناقلات الدقيقة ، قم بلحام كيس تخزين واحد سعة 3 لتر (كيسان تخزين سعة 3 لتر للمفاعل الحيوي سعة 15 لترا) بأنبوب الحصاد ، وضخ تعليق الخلية بالكامل باستخدام المضخة 2 عند 300 دورة في الدقيقة. تحضير 1 لتر (3.5 لتر) من محلول ملحي يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بشري (HSA) كمخزن مؤقت للغسيل و 500 مل من وسط SF الكامل (500 مل من محلول الحفظ بالتبريد للخلايا ، وتركيبة من 10٪ ثنائي ميثيل كبريتات (DMSO) و 90٪ وسط SF كمثال) في أكياس تخزين منفصلة يمكن التخلص منها باستخدام الطرق والملحقات المذكورة في الخطوات السابقة لعمليات نقل السوائل الأخرى.
  19. قم بتشغيل نظام معالجة الخلايا ، وقم بتثبيت مجموعة معالجة الخلايا التي يمكن التخلص منها على الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقم بلحام أكياس تعليق الخلية ، ومخزن الغسيل المؤقت ، ووسيط SF (المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد) بمجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة ، واتبع بعناية جميع التعليمات المعروضة على واجهة المستخدم لتهيئة والتحقق من سلامة المجموعة والتثبيت المناسب.
  20. بمجرد اكتمال التثبيت ، أدخل المعلمات المدرجة في الجدول 3 لغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت للغسيل وإعادة التعليق في وسط SF (المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد) إلى البرنامج لبدء عملية الغسيل وإعادة التعليق. سيتم تنفيذ الإجراء بأكمله تلقائيا باستخدام العديد من نقاط الفحص اليدوي.
  21. خذ عينة من الخلايا من غرفة الطرد المركزي ، كما هو موضح في نظام معالجة الخلايا ، واحسب كثافة الخلية باستخدام محلل خلوي آلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اضبط حجم إعادة التعليق لكثافة 2 × 106 خلايا / مل أو حجم إجمالي أقصى يبلغ 250 مل.
  22. قم بإغلاق وفصل كيس نقل الخلايا من مجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة بعد أن يقوم النظام باستنشاق الخلايا من الحجرة. أعد ضبط كثافة الخلية إلى 2 × 106 خلايا / مل مع وسيط SF كامل في كيس نقل خلايا أكبر / كيس تخزين متوسط إذا لزم الأمر. ستكون هذه هي خلايا البذور للتوسع من الدرجة الثانية في المفاعل الحيوي 15 لتر.

4. صياغة الخلية وتعبئتها وإنهائها

  1. ابدأ في تحضير المفاعل الحيوي سعة 15 لترا قبل يوم واحد من حصاد الخلايا من المفاعل الحيوي سعة 5 لتر. اتبع الخطوات الواردة في قسم البروتوكول 2 و 3 تماما باستثناء معلمات 15 لترا المشار إليها بين قوسين.
  2. أعد تعليق الخلايا في 250 مل من المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد ، وقم بإغلاق وفصل كيس نقل الخلايا من مجموعة معالجة الخلايا التي تستخدم لمرة واحدة بعد أن يقوم النظام باستنشاق الخلايا من الغرفة.
  3. انقل 2000 مل من المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد مع 250 مل من الخلايا المعاد تعليقها من الخطوة 4.2 إلى كيس نقل الخلايا سعة 3 لتر. قم بلحام حقيبة النقل هذه بمجموعة مستهلكة يمكن التخلص منها.
    ملاحظة: يجب تحديد الحجم الإضافي للمخزن المؤقت للحفظ بالتبريد المستخدم هنا من خلال مواصفات التركيبة وحساب إجمالي عدد الخلايا وفقا لنتائج العد المكتسبة في الخطوة 3.21
  4. قم بتجميع مجموعة التعبئة والتشطيب الاستهلاكية التي تستخدم لمرة واحدة في نظام تعبئة الخلايا ، وقم بتشغيل نظام التبريد المسبق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اتبع التعليمات الموجودة على النظام ، واضبط لملء 20 مل / كيس بإجمالي 20 كيسا لكل دفعة. أغلق هذه الأكياس وافصلها عن المجموعة ، واتبع إجراءات الحفظ بالتبريد القياسية. استخدم أكياس التخزين بالتبريد.
  5. قم بلحام مجموعة جديدة من 20 كيسا للحفظ بالتبريد في مجموعة الملء والتشطيب الاستهلاكية التي تستخدم لمرة واحدة ، وكرر إجراء التعبئة والإنهاء حتى يتم اقتباس جميع الخلايا. اتبع الإجراءات القياسية لحفظ هذه الخلايا بالتبريد.

5. توصيف جودة الخلية

  1. أخذ عينات من hMSCs المحصودة من الناقلات الدقيقة القابلة للذوبان ، واستخدام نظام معالجة الخلايا للتوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد هوية الخلية باتباع الطرق الموضحة في الأدبيات18.
  2. قم بإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد ، وأعد الطلاء على قوارير 2D التقليدية أو الألواح الدقيقة لمزيد من توصيف ميزات الخلية ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلية وقدرة التمايز ثلاثية النسب ، باتباع الطرق الموضحة في الأدبيات18.

6. التوسع HEK293T على الناقلات الدقيقة G02 في المفاعل الحيوي ذو الخزان المقلوب

  1. قم بإعداد مفاعل حيوي سعة 5 لتر كما هو مذكور في الخطوة 2. بالنسبة للخلايا HEK293T ، قم بزراعة الخلايا باستخدام ناقلات دقيقة G02 معقمة بدلا من W01. تشبه عملية الاستزراع القسم 3 من البروتوكول ، على الرغم من اختلاف بعض المعلمات ، كما سيتم تفصيلها في الخطوات التالية. قم بتركيب أنبوب تروية خاص في المفاعل الحيوي بدلا من أنبوب النزف ، حيث أن التروية ضرورية لثقافة الخلايا HEK293T.
  2. يختلف عن البروتوكول المفصل في قسم البروتوكول 3 ، قم بإعداد 20 جم من الناقلات الدقيقة G02 (أي زجاجتين) في DMEM مع 10٪ FBS للمفاعل الحيوي 5 لتر ، مع ضبط حجم الاستزراع اليومي 0 على 3.5 لتر (أي تركيز نهائي يبلغ حوالي 5.71 جم / لتر). قم بتوزيع 2 لتر من الوسط في الوعاء قبل زجاجتي الناقلات الدقيقة G02 ، وقم بتلقيح 500 مل من خلايا HEK293T 1.75 × 109 (أي بكثافة نهائية تبلغ 5 × 105 خلايا / مل).
  3. تنفيذ نظام التحريض ونظام التبادل المتوسط (بناء على كمية الوسط المطلوب تبادلها يوميا ، معبرا عنها بحجم الثقافة في اليوم ، CVD) ، والتي تختلف عن قسم البروتوكول 3 ويتم تفصيلها في الجدول 4.
    ملاحظة: قم بتنشيط المضخة 1 والمضخة 2 يدويا حتى يتمكن كلاهما من الضخ باستمرار حتى يحدث التروية. اضبط سرعة المضخة كل يوم لتلبية معدل التروية بناء على معايرة سرعة توزيع حجم المضخات. عادة ، سيكون هذا في نطاق رقم واحد. بالنسبة للخلايا HEK293T ، استخدم وسيطا جديدا كعلف ، وتخلص من الوسط المستهلك تماما في زجاجة نفايات ، على عكس hMSCs ، التي يتم تدوير الوسيط لها.
  4. بالنسبة للتوسع من الطبقة الثانية إلى المفاعل الحيوي سعة 15 لترا ، استخدم نقل الخلايا HEK293T من حبة إلى حبة بدلا من الذوبان الكامل للناقلات الدقيقة كما هو مستخدم مع hMSCs. على وجه التحديد ، أوقف التحريض على ترسب الناقلات الدقيقة بعد الوصول إلى كثافة الخلية المطلوبة ، ثم استنشاق أكبر قدر ممكن من المواد الطافية من أنبوب التروية ، وقم بتغذية PBS ب 3 أضعاف حجم التعليق المتبقي لغسل الناقلات الدقيقة ، وكرر ثلاث مرات. نضح وتجاهل أكبر قدر ممكن من PBS في الغسيل النهائي.
  5. قم بتغذية 3.5 لتر من 1x من التربسين المؤتلف لفصل الخلايا عن الناقلات الدقيقة بينما تظل الناقلات الدقيقة G02 سليمة. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وسرعة التقليب على 60 دورة في الدقيقة. قم بإنهاء الانفصال في غضون 45 دقيقة ، عندما يتم فصل أكثر من 80٪ من الخلايا ، مع وجود كمية متساوية من الوسط الكامل.
  6. نقل مباشرة من ميناء الحصاد إلى سفينة 15 لتر المعدة للتوسع من الدرجة الثانية.

7. توسيع خلايا Vero على ناقلات V01 الدقيقة في المفاعل الحيوي للخزان المقلوب

  1. تحضير الناقلات الدقيقة V01 عن طريق نقل الناقلات الدقيقة المجففة بالتجميد إلى وعاء المفاعل الحيوي مع PBS إلى تركيز 20 مجم / مل. قم بتجميع وتعقيم الوعاء كما هو مذكور في قسم البروتوكول 2 ، ولكن الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة بدلا من ذلك.
  2. بعد التعقيم ، تستقر الناقلات الدقيقة V01 بشكل طبيعي. تبادل المادة الطافية مع DMEM الأساسي مرتين باستخدام أنابيب النزف والتغذية ، وإضافة DMEM الكامل الذي يحتوي على 10 ٪ NBS إلى 50 ٪ -75 ٪ من حجم الوعاء قبل الانتقال إلى قسم البروتوكول 3 لتلقيح الخلايا والثقافة.
  3. يختلف عن البروتوكول المفصل في قسم البروتوكول 3 ، استخدم 24 جم من الناقلات الدقيقة V01 لثقافة 4 لتر من خلايا Vero (أي تركيز نهائي قدره 6 جم / لتر) ، وتلقيح 500 مل من 4 × 109 خلايا Vero (أي بكثافة نهائية تبلغ 1 × 106 خلايا / مل).
  4. اتبع الخطوات 6.3-6.6 لمعلمات عملية الاستزراع والانتقال إلى التوسع من الدرجة الثانية في المفاعل الحيوي ذو الخزان المتحرك سعة 15 لترا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

منصة ACISCP عبارة عن نظام مغلق بالكامل يستخدم سلسلة من المفاعلات الحيوية ذات الخزانات المقلوبة لتوسيع النطاق ، ونظام معالجة الخلايا لحصاد الخلايا وتركيبها آليا ، ونظام ملء الخلايا (الشكل 1). تلتصق الخلايا الملتصقة بالناقلات الدقيقة المسامية ، والتي يمكن تشتيتها في المفاعل الحيوي ، وبالتالي تحقيق الزراعة المعلقة للخلايا الملتصقة.

باتباع البروتوكول كما هو موضح ، تم أولا تلقيح 2.5 × 108 hMSCs مع 10 g من الناقلات الدقيقة W01 في مفاعل حيوي ذو خزان متحرك سعة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يستخدم كل من العلاج المناعي والعلاج بالخلايا الجذعية الخلايا الحية كأدوية. ومع ذلك ، لا ينبغي تنقية منتجاتها النهائية أو تعقيمها بنفس طريقة الجزيئات الصغيرة أو الفيروسات. لذلك ، يجب دائما مراعاة مبدأ الجودة حسب التصميم (QbD) وتطبيقه عمليا على عملية التصنيع والتحكم الكيميائي (CMC) أثناء إنتاج الخلايا23. يتم اعتبار نظام زراعة الخلايا المغلقة بالكامل ، بالإضافة إلى نظام المعالجة ونظام التعبئة ، بشكل تفضيلي لتلبية المتطلبات. في هذه الدراسة ، قدمنا بروتوكولا لاستخدام منصة ACISCP تعتمد على ناقلات 3D 3D ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

Y.D. هو مستشار علمي ، و H.X. ، Y.Z. ، L.G. ، M.L. ، Y.Y. ، W.L. ، و X.Y. موظفون في شركة Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. ليس للمؤلفين الآخرين أي مصلحة تجارية أو ملكية أو مالية في المنتجات أو الشركات الموضحة في هذه المقالة. يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82125018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ التربسين EDTABasalMediaS310JVتستخدم لحصاد الخلايا ثنائية الأبعاد.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500هذا كاشف يذيب على وجه التحديد الناقلات الدقيقة 3D TableTrix.
3D FloTrix MSC مصل مجاني متوسطCytoNiche BiotechRMZ112هذا وسيط خال من المصل وخالية من لتوسيع الخلايا الجذعية الوسيطة وصيانتها في ثقافة مستوية ثنائية الأبعاد بالإضافة إلى ثقافة ثلاثية الأبعاد على الناقلات الدقيقة ثلاثية الأبعاد TableTrix.
3D FloTrix وحدة الترشيح ذات الاستخدام الواحدCytoNiche BiotechR020-00-10تحتوي هذه الوحدة على 0.22 & mu ؛ مرشحات الكبسولة M المستخدمة لترشيح وسط الثقافة ومحلول الهضم.
3D FloTrix حقيبة تخزين للاستخدام مرة واحدة (10 لتر)CytoNiche BiotechR020-00-03تستخدم ككيس تغذية للمفاعل الحيوي سعة 5 لتر.
3D FloTrix حقيبة تخزين للاستخدام مرة واحدة (3 لتر)CytoNiche BiotechR020-00-01تستخدم كبذر الخلايا أو أكياس النقل.
3D FloTrix حقيبة تخزين للاستخدام الفردي (50 لتر)CytoNiche BiotechR020-00-04تستخدم ككيس تغذية للمفاعل الحيوي سعة 15 لترا.
3D FloTrix vivaPACK تعبئة يمكن التخلص منها & طقم الانتهاء من المواد الاستهلاكيةCytoNiche BiotechPACK-01-01هذه مجموعة قياسية تتكيف مع نظام التعبئة والتشطيب 3D vivaPACK.
نظام تعبئة وتشطيب 3D FloTrix vivaPACK للخلاياCytoNiche BiotechvivaPACKهذا النظام عبارة عن جهاز مغلق لمناولة السوائل ، مع وظائف الخلط الآلي واستنفاد الغاز. يمكن تقسيم الخلايا المعلقة في المخزن المؤقت للحفظ بالتبريد بسرعة وبشكل متساو إلى 20 كيسا لكل دفعة.
3D FloTrix vivaPREP PLUS نظام معالجة الخلاياCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSهذا النظام عبارة عن جهاز قائم على أجهزة الطرد المركزي ذات التدفق المستمر. يمكن تركيز الخلايا وغسلها وإعادة تعليقها في ظل إجراءات مغلقة تماما.
3D FloTrix vivaPREP PLUS طقم معالجة الخلايا القابل للتصرفCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00هذه مجموعة قياسية تتكيف مع معالجة خلايا 3D vivaPREP PLUS.
3D FloTrix vivaSPIN   مفاعل حيوي 15 لترCytoNiche BiotechFTVS15يستخدم منتج المفاعل الحيوي هذا وحدة تحكم ، ووعاء خزان زجاجي مقاس 15 لترا ، ومقيمين. يتوفر أنبوب تروية خاص.
3D FloTrix vivaSPIN   bioreactor 5 LCytoNiche BiotechFTVS05يستخدم منتج المفاعل الحيوي هذا وحدة تحكم ، ووعاء خزان زجاجي مقاس 5 لتر ، ومقيمين. يتوفر أنبوب تروية خاص.
3D FloTrix vivaSPIN حزمة مستهلكة بنظام مغلق (10/15 لتر)CytoNiche BiotechR020-10-10هذه مجموعة أنابيب قياسية تتكيف مع المفاعل الحيوي 3D vivaSPIN 15 L ، تحتوي على أكياس أخذ العينات.
3D FloTrix vivaSPIN حزمة مستهلكة بنظام مغلق (2/5 لتر)CytoNiche BiotechR020-05-10هذه مجموعة أنابيب قياسية تتكيف مع المفاعل الحيوي 3D vivaSPIN 5 L ، تحتوي على أكياس أخذ العينات.
3D TableTrix microcarriers G02CytoNiche BiotechG02-10-10gهذه الناقلات الصغيرة المسامية والقابلة للتحلل مناسبة لزراعة الخلايا HEK293T. تأتي معقمة مسبقا في 10 جم / زجاجة مع أنابيب C-Flex للحام بالأنابيب على المفاعلات الحيوية.
3D TableTrix microcarriers V01CytoNiche BiotechV01-100-10gهذه الناقلات الدقيقة المسامية والقابلة للتحلل مناسبة لزراعة الخلايا الملتصقة ، فهي تأتي كناقلات دقيقة غير معقمة تحتاج إلى التعقيم في PBS قبل الاستخدام. إنها مناسبة بشكل خاص لإنتاج اللقاحات.
3D TableTrix microcarriers W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (تغليف للاستخدام الواحد) ؛
W01-200 (أقراص)		هذه الناقلات الدقيقة المسامية والقابلة للتحلل مناسبة لزراعة الخلايا الملتصقة ، خاصة للخلايا التي تحتاج إلى الحصاد كمنتجات نهائية. تأتي معقمة مسبقا في 10 جم / زجاجة مع أنابيب C-Flex للحام بالأنابيب على المفاعلات الحيوية. حصل المنتج على 2 مؤهلات للسواغات الصيدلانية من CDE ، بأرقام تسجيل [F20200000496; F20210000003]. كما حصلت على مؤهل DMF للسواغات الصيدلانية من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، مع رقم تسجيل [DMF: 35481]
APC المضاد للإنسان CD45BioLegend368512يستخدم في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC
Calcein-AM / PI Double StainingDojindoC542Calcein-AM / PI Double Staining Kit يستخدم لتلوين التألق المتزامن للخلايا القابلة للحياة والميتة. تحتوي هذه المجموعة على محاليل Calcein-AM و Propidium Iodide (PI) ، والتي تلطخ الخلايا القابلة للحياة والميتة ، على التوالي.
غطاء لإغلاق الحاويات العلوية EZ لحاويات NALGENE (500 مل)التجارية وأرقام الكتالوج Saint-Gobain CAP-38 هي فقط على سبيل المثال ، تتوفر منتجات مماثلة من موردين مختلفين وطالما أن لديهم نفس الوظيفة ، يمكن استبدال العناصر بعلامات تجارية أخرى.
أنابيب C-Flex ، الصيغة 374 (0.25 بوصة × 0.44 بوصة)Saint-Gobain374-250-3تستخدم للحام الأنبوب وفصله.
كيس تجميد CryoMACS 50Miltenyi Biotec 200-074-400تستخدم لتوسيع 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill& مجموعة الانتهاء من المواد الاستهلاكية.
ثنائي ميثيل كبريتات (DMSO)  سيجماD2650-100 ملتستخدم لتحضير محلول الحفظ بالتبريد.
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)BasalMediaL120KJيستخدم لزراعة خلايا HEK293T و Vero.
زجاجة مختبر DURAN الأصلية GL 45 (2 لتر)DWK علوم الحياة218016357تستخدم لجمع النفايات من المفاعل الحيوي سعة 5 لتر.
زجاجة مختبر DURAN الأصلية GL 45 (5 لتر)DWK علوم الحياة218017353تستخدم لجمع النفايات من المفاعل الحيوي سعة 15 لترا.
زجاجة مختبر DURAN الأصلية GL 45 (500 مل)218014459DWK لعلوم الحياةتستخدم لزجاجة تكميلية من 0.1 متر هيدروكسيد الصوديوم.
الحاويات العلوية EZ لحاويات NALGENE (500 مل)Saint-GobainEZ500 ML-38-2العلامات التجارية وأرقام الكتالوج هي فقط على سبيل المثال ، تتوفر منتجات مماثلة من موردين مختلفين وطالما أن لديهم نفس الوظيفة ، يمكن استبدال العناصر بعلامات تجارية أخرى.
مصل الأبقار الجنيني (FBS) عالي الجودةWisent086-150يستخدم لزراعة خلايا HEK293T.
BioLegendBioLegend للجسم المضاد CD14 المضاد للإنسان من FITC301804 في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
Bio343504Legend BioLegend للأجسام المضادة CD34 المضاد للإنسان من FITCفي قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
BioLegendللأجسام المضادة CD90 (Thy1) المضاد للإنسان FITC328108 في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
قياس التدفق الخلويBeckman CoulterCytoFLEXيستخدم لتقييم هوية الخلية.
محلل الخلايا الفلوريةAlit علوم الحياةCountstar Rigel S2يستخدم في عد الخلايا. يمكن حساب صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ أصباغ AO / PI.
GL 45 متعدد المنافذ موصل برغي كاب مع 2 منافذ  DWK علوم الحياة292632806العلامات التجارية وأرقام الكتالوج هي فقط على سبيل المثال ، تتوفر منتجات مماثلة من موردين مختلفين وطالما أن لديهم نفس الوظيفة ، يمكن استبدال العناصر بعلامات تجارية أخرى.
الجلوكوزسينوكير6243578يستخدم للكشف عن تركيز الجلوكوز في وسط زراعة الخلايا والمواد الطافية.
يستخدم محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، مع الكالسيوم والمغنيسيومجيبكو14025092لتحضير محلول الهضم.
ألبومين بشري 20٪ Behring (HSA) CSLBehringN / Aيستخدم لإعداد عازلة الغسيل.
المجهر الفلوري المقلوبOLYMBUSCKX53SFيستخدم لمجال brifgt والمراقبة والتصوير.
أسطوانة قياس Nalgene (500 مل)Thermo Scientific3662-0500PKتستخدم لمعايرة سرعة حجم مناولة السائل للمضخات التمعجية.
مصل العجل حديثي الولادة (NBS) فائق النعومةMINHAI BIOSC101.02يستخدم لزراعة خلايا فيرو.
مجموعة التمايز والتوصيف بالخلايا الجذعية الوسيطة البشرية من OriCellCyagenHUXUC-90031تستخدم للتمايز الثلاثي للسلالات الهيجانية hUCMSCs.
مجموعة التمايز والتوصيف بالخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للخلايا الوسيطة الغضروفية من OriCellCyagenHUXUC-90041تستخدم للتمايز الثلاثي للسلالات الهيدروجيني hUCMSCs.
مجموعة تمايز وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية من OriCellCyagenHUXUC-90021تستخدم للتمايز الثلاثي للسلالات hUCMSCs.
Bio800504LegendBioLegend للأجسام المضادة CD105 المضاد للإنسانPE في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
Bio302208LegendBioLegend للأجسام المضادة CD19 المضاد للإنسانPE في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
المضاد للإنسان CD73 (Ecto-5'-nucleotidase)BioLegendيستخدم 344004 في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
Bio307605LegendBioLegend للأجسام المضادة HLA-DR المضاد للإنسانPE في قياس التدفق الخلوي لتقييم هوية MSC.
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Wisent311-010-CLيستخدم في التعقيم بالأوعية الزجاجية والناقلات الدقيقة V01 ، واستبدال وسط الاستزراع.
السيليكون الصحية المعالجة بالبلاتين من Sani-Tech (0.13 بوصة × 0.25 بوصة)Saint-GobainULTRA-C-125-2Fتستخدم لنقل المحلول مدفوعا بالمضخات التمعجية.
محلول ملحي معقمHopebiolHBPP008-500يستخدم لتحضير محلول الغسيل.
Trypzyme المؤتلف TrypsinBasalMediaS342JVيستخدم هذا الكاشف لنقل حبة إلى حبة لخلايا HEK293T و Vero.
أنبوب السدادةYingqiBiotech أنبوب السدادة Iهذا السدادة متوافق مع كل من أنابيب C-Flex وأنابيب PVC.
الأنبوب لأنابيب PVCChuBiotech أنبوب لحام مايكرو أناتستخدم لحام الأنابيب البلاستيكية.
الأنبوب لأنابيب TPEYingqiBiotech أنبوب لحام I-V2تستخدم لحام أنابيب TPE.
ViaStain AO / PI Viability StainsNexcelomCS2-0106-25mLالجدوى المزدوجة الفلورية ، باستخدام برتقال أكريدين (AO) ويوديد البروبيديوم (PI) ، هي الطريقة الموصى بها لتحليل دقيق للبقاء للخلايا الأولية ، مثل PBMCs ، والخلايا الجذعية في العينات التي تحتوي على الحطام.
Kit العلامات إغلاق يستخدم يستخدم يستخدم مقياس يستخدم يستخدم PE يستخدم محلول أنابيب لحام لحام

المراجع

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225(2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92(2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722(2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178(2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224(2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176(2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765(2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636(2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96(2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70(2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GMP
إنتاج الخلايا على نطاق واسع على أساس الناقلات الدقيقة المسامية القابلة للذوبان من الدرجة GMP
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.