Method Article

رسم خرائط التوزيع الخلوي لبروتين بصري وراثي باستخدام شبكة تحفيز الضوء

DOI:

10.3791/65471

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Addgene

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن هذا البروتوكول نقل مستشعرات cAMP و bPAC-nLuc ، وهو بروتين بصري وراثي ، لتتبع توزيعه الخلوي واستجابته لتحفيز الضوء بدقة. ينطوي النهج المبتكر المتمثل في إنشاء خريطة استجابة cAMP باستخدام نظام مسح النقاط على إمكانية تطوير البحث باستخدام البروتينات البصرية الوراثية في مختلف المجالات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان هدفنا هو تتبع التوزيع الخلوي لبروتين بصري وراثي بدقة وتقييم وظائفه داخل موقع سيتوبلازمي معين. لتحقيق ذلك ، قمنا بنقل الخلايا مع مستشعرات cAMP المستهدفة نووية وبروتين البصريات الوراثي المطور في المختبر ، وهو adenylyl cyclase-nanoluciferase البكتيري القابل للتنشيط الضوئي (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc ، عند تحفيزه بضوئية 445 نانومتر أو ركائز لوسيفيراز ، يولد الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري 3 '، 5' (cAMP). استخدمنا مصباح ليزر صلب متصل بنظام مسح نقطي سمح لنا بإنشاء نمط شبكة / مصفوفة من البقع المضيئة الصغيرة (~ 1 ميكرومتر2) في جميع أنحاء السيتوبلازم لخلايا HC-1. من خلال القيام بذلك ، تمكنا من تتبع توزيع bPAC-nLuc المستهدف نوويا بشكل فعال وإنشاء خريطة استجابة شاملة لاتفاقية المخيم. مثلت هذه الخريطة بدقة التوزيع الخلوي ل bPAC-nLuc ، واختلفت استجابتها لتحفيز الضوء وفقا لكمية البروتين في البقعة المضيئة. يساهم هذا النهج المبتكر في توسيع مجموعة الأدوات المتاحة للتحقيق في البروتينات البصرية الخلوية. إن القدرة على رسم خريطة لتوزيعها واستجابتها بدقة عالية لها إمكانات بعيدة المدى ويمكن أن تعزز مختلف مجالات البحث.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علم البصريات الوراثي ، الذي ولد كأداة أحدثت ثورة في علوم الأعصاب ، هو الآن مجال بحث متنامي وتقنية صاعدة تستخدمها بشكل روتيني العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم وعبر مختلف مجالات البحث في علم الأحياء. قمنا بتطوير bPAC-nLuc ، وهو بروتين بصري وراثي متعدد الاستخدامات ، عن طريق دمج adenylyl cyclase الحساس للضوء (AC) من Beggiatoa sp. (adenylyl cyclase البكتيري القابل للتنشيط الضوئي ؛ bPAC) إلى nanoluciferase (nLuc) < sup class = "xref" >1 ، < sup class = "xref" >2 ، < sup class = "xref" >3. عند تحفيزها بالضوء الأزرق ، تنتج bPAC الرسول الثاني 3 '، 5'-دوري الأدينوزين أحادي الفوسفات (cAMP). nLuc عبارة عن لوسيفيراز صغير تم تطويره مؤخرا والذي ، في وجود إحدى ركائزه ، يمكنه توليد تلألؤ حيوي وتنشيط إنتاج cAMP< فئة sup = "xref" >4. وبالتالي ، يمكن تنشيط هذا البروتين البصري الوراثي بشكل عابر باستخدام نبضات ضوئية قصيرة أو بثبات مع Furimazine أو ركائز لوسيفيراز أخرى ، مما يسمح لنا بتقليد أنماط إشارات cAMP المختلفة وتقييم الاستجابات الخلوية (تنشيط عوامل النسخ ، والتعبير الجيني ، وتكاثر الخلايا ، والهجرة ، وما إلى ذلك). أكدت التطورات الحديثة في إشارات الرسول الثاني على أهمية الأحداث التي تحدث في مناطق العصارة الخلوية المقيدة للغاية (على سبيل المثال ، إنتاج cAMP الداخلي لفسفرة البروتين المرتبط بعنصر استجابة cAMP (CREB) أو المجالات الدقيقة Ca2 + للعامل النووي لنقل الخلايا التائية المنشطة (NFAT) إلى النواة) < فئة الدعم = "xref" >5،<فئة الدعم = "xref">6. لذلك ، من المهم تطوير استراتيجيات متسقة ومنهجية لتقييم وتقليد وحظر الإشارات من هذه المقصورات في الخلايا الحية. لإظهار قدرة bPAC-nLuc على التنشيط على وجه التحديد في مقصورات الخلايا المختلفة ، شاركنا في نقل خط خلوي مشتق من ورم الكبد (HC-1) مع bPAC-nLuc و H208 المستهدفين نوويا ، وهو مستشعر cAMP لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). خلو خلايا HC-1 المشتقة من خط HTC من نشاط التيار المتردد القابل للفحص ، مما ينتج عنه مستويات cAMP القاعدية المنخفضة جدا ، مما يجعلها مثالية لقياس إنتاج cAMP المفترض مع الاستفادة من النطاق الديناميكي الكامل لأجهزة استشعار FRET < sup class = "xref" >7،< sup class = "xref">8. باستخدام ليزر الحالة الصلبة (445 نانومتر ، LDI-7 ، 89 شمالا) متصل بنظام مسح نقطي (UGA-42 Geo ، Rapp OptoElectronic) ، نصف بروتوكولا لتحفيز المناطق أو البقع الدائرية الصغيرة جدا بشكل منهجي (~ 1 ميكرومتر2) داخل الخلايا الفردية. تم توصيل نظام مسح النقاط بأحد المنافذ الخلفية لمجهر ذو طابقين ، مما سمح لنا بتحفيز الخلايا وإجراء قياسات FRET في وقت واحد عبر مسار ضوئي مستقل. نقدم طريقة في هذا البروتوكول حيث يتم استخدام برنامج SysCon Geo ، المزود بنظام التحفيز بواسطة Rapp OptoElectronic ، لإجراء فحص شامل للسيتوبلازم للخلايا. يتضمن النهج إنشاء خريطة استجابة cAMP عن طريق إعداد سلسلة من الإضاءات التي تحفز الخلايا في نمط الشبكة (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة

1. ثقافة خلايا HC-1 والتحضير للتصوير

  1. الحفاظ على خلايا HC-1 في DMEM مكملة بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، بنسلين (100 وحدة دولية / لتر) ، ستربتومايسين (100 مجم / لتر) ، ول-جلوتامين في أطباق 10 سم ومحضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، في 95٪ هواء مرطب
  2. قم بتمرير الخلايا كل 2-4 أيام بمجرد أن تكون الخلايا ~ 90٪ ملتصقة باستخدام تخفيفات 1: 5 أو 1:10.
  3. خلايا البذور للتعداء على أغطية زجاجية قبل يومين من التجربة.
    1. العمل في ظل ظروف معقمة في غطاء مزرعة الأنسجة مع وسائط دافئة مسبقا و PBS ، قم بشفط الوسائط من طبق شبه ملتقى من الخلايا واغسلها برفق باستخدام 5 مل من PBS.
    2. استنشق PBS وأضف 1 مل من التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق حتى تنفصل الخلايا.
    3. أعد تعليق الخلايا في 4 مل من الوسائط وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    4. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا وحساب كثافة الخلية.
    5. تمييع الخلايا بكثافة 1.5 × 104 خلايا / مل.
    6. ماصة 2 مل من تعليق الخلية على أغطية زجاجية مقاس 25 مم مع طلاء بولي دي ليسين في طبق 6 آبار.
    7. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة تقريبا في حاضنة حتى التقاء 70٪.
    4. قم
  4. بنقل الخلايا باستخدام مجموعة تعداء باتباع تعليمات الشركة المصنعة باستخدام نسبة 0.25 ميكروغرام من NLS-bPAC-nLuc DNA / 0.75 ميكروغرام من NLS-H208 DNA لكل 3 ميكرولتر من كاشف التعدي و 2 ميكرولتر من كاشف P3000 المخفف في وسائط Opti-MEM التي تفتقر إلى الفينول الأحمر.
  5. ضع الخلايا في الحاضنة لمدة ~ 48 ساعة للسماح بتعبير bPAC-nLuc الكافي ، وهو أمر ضروري لإنتاج مستويات يمكن اكتشافها من cAMP.
    ملاحظة: سيختلف المستوى الأدنى المطلوب لتعبير bPAC-nLuc اعتمادا على فاعلية نظام التحفيز ومعلمات التحفيز.
  6. تحضير الخلايا على أغطية للتصوير.
    1. استنشق الوسائط من بئر واحد واغسلها مرتين ب 2 مل من PBS.
    2. ارفع الغطاء بحذر باستخدام زوج من الملقط وضعه في غرفة التصوير.
    3. أضف 1 مل من Opti-MEM الذي يفتقر إلى الفينول الأحمر إلى غرفة التصوير. يمكن أيضا تصوير الخلايا في HBSS أو أي حل آخر متوافق مع التألق الفسيولوجي.
< p class = "jove_title" >2. محاكاة الضوء وتصوير الخلايا الحية

  1. إجراء زراعة الخلايا ومعالجة الخلايا التي تعبر عن NLS-bPAC-nLuc في بيئة مظلمة. لتجنب التعرض للأطوال الموجية <500 نانومتر، استخدم مصباح أحمر آمن (جدول المواد) مع لمبة مضان كهرمانية مدمجة بقدرة 13 واط (جدول المواد).
  2. قم بإجراء تجارب في مجهر آلي ذو طابقين (جدول المواد) مزود بمحرك ضوئي متعدد المصابيح مكون من 6 أسطر (جدول المواد) ، وعجلة مرشح انبعاث (جدول المواد) ، ومرحلة XY (جدول المواد) ، وكاميرا CMOS الرقمية ORCA-Fusion (جدول المواد) ، وهدف زيت 100x / 1.4 NA (∞ / 0.17 / FN26.5). التقاط الصور باستخدام برنامج الفحص المجهري الرقمي (جدول المواد). هذا الإعداد قادر على تحفيز الخلايا وإجراء قياسات FRET في وقت واحد باستخدام مسار ضوئي مستقل مزود بمرشح ZT458rdc ثنائي اللون (جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن استخدام أي إعداد للاستحواذ إذا كان يسمح بالتحفيز البصري الوراثي المتزامن والتصوير الفوري / قياس المكثف باستخدام مستشعر متوافق.
  3. قم بتشغيل UGA - 42 Geosystem. قم بتشغيل المجهر وإعداده باستخدام المعلمات المناسبة للحصول عليها باستخدام مستشعر H208 FRET. سيعتمد تكوين الاستحواذ على مستويات التعبير عن مستشعر FRET. المعلمات النموذجية هي 40 مللي ثانية وقت محاكاة ل YFP / mScarletI ، و 15٪ طاقة LED ، و 0.5 هرتز.
  4. افتح برنامج SysCon وبرنامج التصوير الذي يتحكم في المجهر.
  5. في نافذة الكاميرا ، حدد علامة التبويب المعايرة واختر الطول الموجي لليزر المتوافق مع البروتين البصري الوراثي. لتحفيز bPAC-nLuc ، استخدم الطول الموجي 445 نانومتر.
  6. معايرة النظام قبل كل استخدام. هذا مهم لأن الاختلافات الصغيرة في الإعداد ، أو حتى التغيرات في درجة حرارة الغرفة (RT) ، يمكن أن تغير دقة التحفيز.
  7. في نافذة الكاميرا ، حدد علامة التبويب الكاميرا وانقر فوق <بدء الاستحواذ> لبدء الاستحواذ من برنامج التخيل.
  8. في نافذة عارض الصور، تصور اكتساب مباشر أو مسبق لمضان الخلايا المأخوذة من برنامج التصوير، والذي سيوجه وضع أجسام التحفيز.
  9. استخدم وضع النقر وإطلاق النار لتقييم استجابة خلية فردية بسرعة قبل بدء التجربة.
  10. باستخدام نافذة Sequence-Manager، حدد <إضافة> لإنشاء تسلسل جديد.
    ملاحظة: للتحقق من معايرة النظام المناسبة، ارسم أشكالا وأحجاما مختلفة في نافذة عارض الصور. يجب أن تتوافق هذه بدقة مع أنماط التحفيز المسقطة على الخلايا ، مما يضمن محاذاة دقيقة مع التصميم المقصود.
  11. في نافذة عارض الصور ، حدد أيقونة Round في شريط الأدوات على اليسار لرسم كائنات تحفيز دائرية.
  12. قم بإنشاء دوائر متطابقة صغيرة متعددة وتوزيعها بالتساوي لضمان التغطية المتجانسة للسيتوبلازم الكامل للخلايا المراد تحفيزها.
  13. انقر بزر الماوس الأيمن فوق كل واحد للتحقق من تجانس كائنات التحفيز الدائري. ستظهر نافذة. استخدمه لفحص نصف قطرها وموضعها وما إلى ذلك.
  14. اضبط نصف القطر بين 1 و 5 ، اعتمادا على الهدف المستخدم وحجم الخلية.
  15. للمساعدة في التباعد المتساوي والمحاذاة بين الدوائر، استخدم الزر <الانطباق على الشبكة> في النافذة الفرعية عرض. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعيين خصائص الشبكة باستخدام الزر <تعيين الشبكة>.
  16. تأكد من أن الشبكة أو المصفوفة من أجسام التحفيز الدائري المتباعدة بشكل متساو تغطي الخلية بالكامل ، وأن حجمها (على سبيل المثال ، 6 × 6 أو 10 × 10) يتم تحديده حسب حجم الخلية. كعنصر تحكم في التحفيز الفارغ الذي لا ينبغي أن يؤدي إلى أي أحداث خلوية ، قم بتضمين بعض الدوائر الموضوعة خارج الخلية.
  17. سيظهر كل كائن تم إنشاؤه في نافذة عارض الصور في نافذة المخطط الزمني.
    1. في النافذة الفرعية توقيت الكائن، قم بتكوين الخصائص الزمنية لكل كائن تحفيز (وقت البدء، المدة، التأخير).
    2. في النافذة الفرعية Lightsource، قم بتكوين الطول الموجي وشدة كل كائن. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تأكد من أن كل كائن يستخدم نفس الطول الموجي وأنه متطابق في المدة والشدة. سيكون وقت البدء مختلفا لكل كائن ، ويمكن أن يختلف التأخير بينهما اعتمادا على النتيجة المتوقعة لتجنب تركيب تأثير المحفزات المختلفة.
  18. في نافذة المخطط الزمني، قم بتغيير التسلسل الذي سيتم فيه تنشيط كل كائن تحفيز إذا لزم الأمر. قم بتكوين المحفزات بنمط منتظم (على سبيل المثال ، من اليسار إلى اليمين ، من أعلى إلى أسفل) أو في نمط عشوائي ، اعتمادا على تجربة معينة.
  19. قم بتحميل التسلسل إلى النظام وقم بتكوين عدد دورات التسلسل (عمليات التشغيل) التي سيقوم بها النظام.
  20. ضع مناطق الاهتمام (ROIs) في برنامج التصوير في المواضع المطلوبة.
  21. ابدأ في الحصول على صور مضان بالمجهر واضغط على <تشغيل> في نافذة UGA-42.

3. تحليل البيانات

  1. على الرغم من أن البرنامج الذي يوفره نظام التحفيز يسمح بحفظ التسلسلات لاستخدامها مرة أخرى ، إلا أنه لا يسجل معلومات التجربة الفعلية. لذلك ، قم بتوثيق جميع التفاصيل المتعلقة بنقاط التحفيز والتسلسلات المستخدمة أثناء التجربة بدقة ، بما في ذلك المعلمات مثل الموضع والشدة والمدة وعدد الجولات وما إلى ذلك. توثيق أي حالات تجريبية أخرى ذات صلة، مثل العوامل الدوائية أو المحاليل المحددة.
  2. أثناء التجربة ، ضع عائد الاستثمار المعين في برنامج التصوير لالتقاط تغيرات شدة التألق من الخلية بأكملها أو مواقع محددة داخل الخلايا.
  3. انتبه بشكل خاص لوضع عائد الاستثمار بالنسبة لنقاط التحفيز. قياس التغيرات في شدة التألق سواء داخل أو بعيدا عن المناطق المحفزة. اضبط مواضع عائد الاستثمار بعد التجربة ، وتوفير برنامج التصوير للسماح بحفظ الصور المكتسبة أثناء التجربة وليس فقط قيم شدة عائد الاستثمار.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج المقدمة في يوضح الشكل 1 أن المحفزات الموجهة إلى نواة الخلية فقط هي التي كانت قادرة على توليد ارتفاعات cAMP قابلة للقياس. هذا يؤكد أن NLS-bPAC-nLuc يتم التعبير عنه حصريا في الحجرة النووية لخلايا HC-1. من الممكن تحفيز البروتين البصري الوراثي بدقة باستخدام نمط الشبكة / المصفوفة هذا لرسم خريطة لتوزيعه داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تعكس الارتفاعات الأعلى cAMP باتجاه المركز النووي الكتلة الأعلى ل bPAC-nLuc التي تحاكي البقع المركزية مقارنة بتلك الموضوعة في المحيط النووي (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1).

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
< فئة قوية = "xfig">الشكل 1: بروتوكول تحفيز الشبكة وخريطة استجابة cAMP. تحفيزات الضوء الأزرق المتسلسلة (445 نانومتر ؛ فاصل 30 ثانية بين النبضات ؛ قطار النبض: 50 مللي ثانية ، 500 مللي ثانية المدة الإجمالية ، 10 هرتز ، 7٪ طاقة الليزر) على خلايا HC-1 المنقولة باستخدام NLS-H208 (مستشعر cAMP) و NLS-bPAC-nLuc. تعرض اللوحة اليسرى مضان البروتين الفلوري الأصفر (YFP) من H208 ، والذي تم تراكبه بنبضات الضوء الفعلية التي تم التقاطها بواسطة كاميرا sCMOS الممثلة في صورة واحدة. تظهر الآثار الموجودة على اليمين زيادات عابرة في المخيم العابر الناجم عن تحفيز NLS-bPAC-nLuc في كل بقعة تحفيز. تم قياس مضان NLS-H208 المطروح في الخلفية باستخدام عائد استثمار واحد يغطي النواة بأكملها ، وتم حساب النسب الطبيعية (R / R0). كانت الردود في المناطق الخارجية (الصفان 1 و7 والعمودان A وG) سلبية ولم يتم عرضها. شريط = 3 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الهدف من هذه الدراسة هو مراقبة التوزيع داخل الخلايا للبروتين البصري الوراثي بدقة وتقييم أدائه داخل حجرة سيتوبلازمية معينة. أظهرنا أيضا قدرات التحفيز الدقيقة لنظام مسح النقاط على الخلايا التي تعبر عن بروتين بصري وراثي. لتحقيق ذلك ، استخدمنا bPAC-nLuc المستهدف نوويا بمستويات تعبير عالية ولكن توزيع محدود للغاية يقتصر على النواة. أظهرت النتائج أن بقع التحفيز المفصولة ب ~ 1 ميكرومتر فقط يمكن أن تؤدي إما إلى إنتاج cAMP أم لا ، اعتمادا على التوزيع الخلوي للبروتين البصري الوراثي. فقط المحفزات الموجهة إلى النواة كانت قادرة على رفع مستويات cAMP. في هذا البروتوكول ، لم يكن الهدف هو توليد ارتفاعات موضعية ل cAMP ولكن بالأحرى إظهار أن محفزات الضوء القصيرة يمكن أن تكون دقيقة بما يكفي لتنشيط البروتينات البصرية الوراثية في مناطق محدودة للغاية من الخلية دون تحفيز البروتينات المحيطة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يشكل تحكما ضروريا لدراسة البروتينات البصرية الأخرى ذات التوزيعات المنتشرة و / أو توليد ارتفاعات cAMP الموضعية. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تغيير مستويات التعبير عن البروتين البصري ، وشدة وتكرار التحفيز ، وما إلى ذلك. لقياس هذه الإشارات الموضعية بدقة ، يعد النظر بعناية في معلمات الاستحواذ وخصائص المستشعر أمرا بالغ الأهمية. يتضمن ذلك تحديد مواضع وأحجام عائد الاستثمار المناسبة ، وتحديد تردد الاستحواذ ، واختيار مستشعرات FRET / قياس المكثف ذات التقارب الأمثل والشدة والنطاق الديناميكي وثابت التفكك.

في مقال نشر مؤخرا ، استخدمنا استراتيجية مماثلة لإثبات توزيع bPAC-nLuc المستهدف نوويا وظيفيا وقدرة فوسفوديستراز معدل (PDE ؛ ΔRI-PDE8) لإلغاء ارتفاعات cAMP في خط الخلية المشتق من الغدة الدرقية9. في هذه المقالة ، أجرينا تحفيز الخلية على طول خط مستقيم بدلا من الشبكة ، وتم وضع نقاط الإضاءة بالنسبة للمعالم الخلوية (على سبيل المثال ، المركز النووي ، والحافة النووية ، وما إلى ذلك) بدلا من نمط منهجي. من اللافت للنظر أنه حتى المحفزات الموجهة إلى الحافة النووية لم تكن كافية لإطلاق استجابة cAMP يمكن اكتشافها. استنتقدنا أن هذا ربما كان بسبب تحفيز كتلة غير كافية من NLS-bPAC-nLuc9. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، أدت بعض التحفيز الموجهة إلى محيط الحافة النووية إلى زيادة يمكن اكتشافها في المخيم. يمكن أن يعزى هذا التناقض إلى عوامل مختلفة ، بما في ذلك مستويات التعبير عن bPAC-nLuc ، وخصائص التحفيز ، ومورفولوجيا النواة ، ووجود PDEs الداخلية ، والبروتينات العازلة ، وما إلى ذلك.

في حين أن البروتينات البصرية الوراثية المستهدفة أو غير المستهدفة الأخرى قد تظهر توزيعات أكثر انتشارا ، فإن هذا النهج المنهجي يدعم استخلاص استنتاجات ذات مغزى من خلال إعداد التجارب بعناية وتحليل البيانات. علاوة على ذلك ، يتيح هذا النهج استهداف الهياكل الخلوية المتخصصة (على سبيل المثال ، lamellipodia ، والتشعبات ، والأهداب الأولية ، وما إلى ذلك) ، مما يسهل المقارنات بين الاستجابات في المناطق البعيدة والقريبة من هذه الهياكل و / أو جسم الخلية.

يمكن أيضا استخدام هذه الإستراتيجية لتقييم تنشيط العناصر النهائية في مسار cAMP ، مثل بروتين كيناز أ (PKA) أو بروتين التبادل الذي يتم تنشيطه مباشرة بواسطة cAMP (EPAC1). علاوة على ذلك ، نظرا لأن bPAC-nLuc لا يتأثر بنفس معدلات التيار المتردد الداخلي ، والتي يمكن أن تتأثر بالتفاعلات المحلية مع البروتينات أو عوامل أخرى ، فيمكن افتراض أنها تولد باستمرار نفس الكمية من cAMP بالنظر إلى نفس المستوى من التعبير. من خلال فحص انخفاض ارتفاعات cAMP أو الانخفاض في مستويات cAMP بعد ارتفاع مؤقت ، يسمح هذا النهج بتقييم تدهور cAMP أو الانتشار أو وظائف وتوزيع PDEs الداخلية أو المنقولة. أثبتت هذه الإستراتيجية أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم سلوك أي بروتين بصري في مواقع خلوية مختلفة ، مما يساعد على تجنب التحيز المتمثل في وضع بقع التحفيز بشكل تعسفي داخل السيتوبلازم.

من المهم أن تأخذ في الاعتبار أن حجم بقعة التحفيز وطاقتها سيعتمدان في النهاية على الخصائص الخاصة للإعداد المستخدم (مسارات الضوء ، والأهداف ، ونظام المسح ، وما إلى ذلك). لضمان نتائج دقيقة ، يجب مراعاة التعبير النسبي للبروتين البصري ، وحساسية الخلايا للطول الموجي المستخدم ، وأي معلمات أخرى عند إجراء كل تجربة في كل نظام معين. من الضروري أيضا ملاحظة أننا لم ندرس المدى الكامل الذي يمكن أن يكون فيه النظام مدفوعا في تنفيذ نقاط تحفيز أصغر و / أو شبكات أكثر كثافة (أي بقع تحفيز أقل تباعدا) لتقييم الهياكل الخلوية الأصغر بشكل منهجي بدقة متزايدة. بالإضافة إلى ذلك ، اختبرنا هذه الإستراتيجية باستخدام نظام مسح النقاط الجغرافية UGA-42 فقط. وقد يكون هذا النهج ممكنا باستخدام أنظمة مختلفة، شريطة أن تتمكن من توليد بقع موضعية متباعدة بشكل متساو. يجب تحسين كل نظام لتحقيق نتائج مماثلة.

أخيرا ، يجب تقييم التحفيز المحتمل لأجهزة استشعار FRET بواسطة نظام التحفيز بعناية. على سبيل المثال ، سيتم بالتأكيد تحفيز البروتين الفلوري السماوي (CFP) أو حتى تبييضه بواسطة ليزر 445 نانومتر المستخدم في هذا البروتوكول. سيؤدي استخدام فاعليات الليزر الأعلى (أو مرشحات الكثافة المحايدة ذات النفاذية العالية (ND)) إلى زيادة فرص تحفيز مستشعرات الفلورسنت وإدخال معلومات خاطئة إلى التجربة و / أو توليد مشاكل في تحليل البيانات. يجب أيضا تقييم التبييض الضوئي الطبيعي لأجهزة استشعار FRET / قياس المكثف بعناية. أخيرا ، نظرا لأن bPAC يمكن أن يكون حساسا للضوء المحيط ويولد cAMP حتى في الظروف المظلمة (تم قياس النشاط المظلم ل bPAC على أنه 33 ± 5 pmol / min / mg من البروتين3) ، يجب معالجة الخلايا بعناية بعد نقل bPAC-nLUC لتجنب التلوث الخفيف (على سبيل المثال ، في الحاضنة ، قبل و / أو أثناء التجارب ، إلخ). اختياريا ، يمكن تحضين الخلايا بمثبط PDE (على سبيل المثال ، 3-isobutyl-1-methylxanthin ؛ IBMX10) لتحديد النشاط الأساسي ل bPAC-nLuc والتأكد من أن ظروف الإضاءة المستخدمة مظلمة بشكل مناسب.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 GM099775 و GM130612 إلى DLA.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13 واط العنبر المضان المدمجة لمبة - الأضواء الزرقاءالتطورات الضوئية 
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI7018
6-line متعدد LED Lumencor Spectra XLumencor   ؛محرك إضاءة متعدد الخطوط 6 أسطر  
Corning - DMEM Thermo FischerMT10013CMEA
Corning - مصل بقري عادي للجنينThermo FischerMT35011CV
غطاء النظارات: circlesThermo Fischer12545102P
GBX-2 فلتر أمن أحمر غامق 5.5 بوصة   ؛كوداك1416827مصباح أحمر آمن   
محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) 10xThermo Fischer14185052مخفف إلى 1x ، درجة الحموضة المعدلة
LDI-789 North
L-GlutamineThermo FischerBW17605E
Lipofectamine 3000   ؛L3000001Thermo Fischer 
أوليمبوس IX83 بمحركات  طابقين  المجهر أوليمبوسمجهر ذو طابقين بمحركات Olympus 
Opti-MEM, لا الفينول الأحمرThermo Fischer11058021
ORCA-fusion كاميرا CMOS الرقمية HamamatsuC14440-20UP
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)15140122Thermo Fischer
(1x)Lonza17516F
عجلات مرشح انبعاث سابق ومجموعات مرشحاتبريور ساينتيفيكعجلة مرشح الانبعاث 
Prior  Proscan XY المرحلةالسابقة العلمية، Inc.المرحلة XY 
Slidebook 6ابتكارات التصوير الذكي برامجالفحص المجهري الرقمي
SysConSysConالبرمجيات التي يوفرها نظام التحفيز 
UGA-42  Geo راب OptoElectronic
UPlanSApo 100xأوليمبوس100x / 1.4 NA هدف النفط (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc ثنائي اللون  Chroma Technology CorpBS ، الطول الموجي (CWL):  498 نانومتر
المنخفضة طقم تعداء محلول مخزن بالفوسفات برنامج برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
  2. Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
  3. Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
  4. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  5. Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
  6. Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
  7. Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
  8. Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
  9. Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
  10. Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Protein MappingLight Stimulation GridCyclic AMP SignalingbPAC nanoluciferaseNuclear Targeted ProteinFRET MeasurementsFluorescence ImagingSubcellular ActivationMotorized MicroscopeCellular Distribution

Related Articles