Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتطوير الممارسات المختبرية الجيدة والتحقق من صحتها في الكشف المتوافق عن النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في الدموع البشرية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي لدعم التطوير السريري لنواقل العلاج الجيني.
ازداد استخدام النواقل الفيروسية لعلاج الأمراض الوراثية بشكل كبير في السنوات الأخيرة ، حيث تم تسجيل أكثر من 2000 دراسة حتى الآن. حققت النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAV) نجاحا خاصا في علاج الأمراض المرتبطة بالعين ، كما يتضح من الموافقة على voretigene neparvovec-rzyl. لجلب علاجات جديدة إلى السوق ، تطلب الوكالات التنظيمية عادة دراسات بيولوجية مؤهلة أو معتمدة لتقييم إطلاق الناقل في البيئة. ومع ذلك ، لم تصدر إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أي مبادئ توجيهية رسمية لتطوير المقايسات الجزيئية لدعم دراسات التساقط هذه ، تاركة للمطورين تحديد أفضل الممارسات لأنفسهم. الغرض من هذا البروتوكول هو تقديم بروتوكول قابل للتحقق من صحته للكشف عن ناقلات AAV في الدموع البشرية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي (ddPCR) لدعم دراسات التكاثر البيولوجي السريرية. تناقش هذه المخطوطة مناهج الصناعة الحالية للتحقق من صحة الفحص الجزيئي وتوضح أن الطريقة تتجاوز معايير قبول الفحص المستهدف المقترحة حاليا في الأوراق البيضاء. أخيرا ، تتم مناقشة الخطوات الحاسمة في أداء أي مقايسة ddPCR ، بغض النظر عن التطبيق.
تختلف تعريفات العلاج الجيني ، ولكنها تحفز بشكل عام تناوبا دائما مقصودا ومتوقعا في كثير من الأحيان لتسلسل معين من الحمض النووي للجينوم الخلوي لتعديل أو التلاعب بتعبير الجين أو لتغيير الخصائص البيولوجية للخلية الحية لغرض سريري 1,2. يتم استخدام النواقل الفيروسية بشكل متزايد كوسيلة للعلاج الجيني بسبب كفاءتها في النقل ، حيث يشير أحد التقارير إلى أن أكثر من 70٪ من التجارب السريرية الحالية للعلاج الجيني تستخدم النواقل الفيروسية3. يزداد الاهتمام بالنواقل الفيروسية للعلاج الجيني بشكل مطرد. أفاد تقرير البيانات الفصلية للربع 4 2022 حول مشهد العلاج بالجينات والخلايا والحمض النووي الريبي من الجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أنه في عام 2022 ، نما خط أنابيب العلاج بالجينات والخلايا والحمض النووي الريبي من التسجيل قبل السريري إلى التسجيل المسبق بنسبة 7٪ ، ليصل العدد الإجمالي للعلاجات قيد التطوير إلى 3,726 ، منها 2,053 (55٪) علاجات جينية4. وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (USA FDA) حاليا على 27 علاجا للخلايا والجينات للاستخدام السريري في البشر ، خمسة منها تستخدم على وجه التحديد النواقل الفيروسية5.
اكتسبت الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) اهتماما خاصا كوسيلة للعلاج الجيني. كشف تحليل تلوي حديث أن هناك ما يقرب من 136 تجربة سريرية تحقق في استخدام AAVs في العقدين الماضيين6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ثلاثة من العلاجات الجينية الخمسة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية تعتمد على AAV. ويرجع ذلك إلى طبيعتها القابلة للتحرير بدرجة كبيرة ، ونطاق المضيف الواسع الذي يمكن ضبطه بناء على استخدام نواقل محددة تحدث بشكل طبيعي أو مهندسة صناعيا ، وانخفاض الإمراضية والسمية في البشر ، وانخفاض المناعةبشكل عام 7,8. كما تم استخدام AAVs بنجاح لعلاج أمراض العين في بيئة سريرية معتمدة. Voretigene neparvovec-rzyl هو علاج قائم على AAV2 تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في عام 2017 ومن قبل وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) في عام 2018 لعلاج حثل الشبكية المرتبط بالطفرة ثنائية الأليلي RPE65 9.
مع الاهتمام المتزايد بتطوير العلاجات القائمة على AAV تأتي الحاجة إلى التوجيه التنظيمي بشأن المقايسات. يعد الكشف الدقيق عن أي ناقل فيروسي وقياسه جزءا لا يتجزأ من مراحل الاكتشاف والتصنيع والاختبار قبل السريري / السريري لتطوير المنتج. بدأت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في إصدار بعض الإرشادات للعلاجات الجينية ، بما في ذلك الكيمياء والتصنيع والتحكم في تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية للعلاج الجيني البشري 10 ، والمتابعة طويلة الأجل بعد إعطاء العلاج الجيني 11 ، واختبار الفيروس القهقري المؤهل للتكرار12 ، والتوصيات الخاصة بالنواقل الميكروبية المستخدمة في العلاجات الجينية 13. أصدرت EMA أيضا سلسلة من الإرشادات المتعلقة بتطوير منتجات العلاج الجيني التي تتوافق بشكل عام مع توصيات إدارة الغذاء والدواء ، على الرغم من وجود بعض الاختلافات14. من المهم ملاحظة أنه على الرغم من أن هذه الإرشادات لا تحدد مسؤوليات قابلة للتنفيذ قانونا ، إلا في حالة الإشارة إلى لوائح محددة ، إلا أنها توفر وضوحا بشأن التفكير الحالي من الوكالات التنظيمية حول هذا الموضوع وتوقعاتها للمقايسات المطلوبة لإيداعات الأدوية والموافقة التنظيمية.
توصي إدارة الغذاء والدواء على وجه التحديد بإجراء دراسات لتقييم توزيع وثبات وتخليص ناقل من موقع الإعطاء لاستهداف أنسجة العين وغير العين والسوائل داخل العين والدم15. هذه تأخذ شكل التوزيع البيولوجي ودراسات سفك. تقوم دراسات التوزيع الحيوي بتقييم التعرض من خلال التحقيق في كيفية انتشار المنتج في جميع أنحاء جسم المريض من موقع الإدارة. يقيم سفك على وجه التحديد إطلاق المنتج من المريض إلى البيئة ويزيد من إمكانية انتقال الناقل إلى الأفراد غير المعالجين16. تقدم إدارة الغذاء والدواء توصيات لتصميم دراسات التوزيع الحيوي وسفك فيما يتعلق بتكرار جمع العينات ومدة جمع العينات وأنواع العينات التي تم جمعها وظروف التخزين.
بالإضافة إلى ذلك ، توصي إدارة الغذاء والدواء الأمريكية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي) للكشف الكمي عن جينومات النواقل نظرا لسهولة أدائها ، وتنسيقها عالي الإنتاجية ، وأوقات التسليم السريعة ، وحساسية الفحص. ومع ذلك ، هناك نقص نسبي في التوصيات الخاصة بتصميم وتقييم أداء الطرق الجزيئية مقارنة بتلك الموجودة للجزيئات الصغيرة والكبيرة. يصعب تطبيق العديد من المبادئ التوجيهية لمثل هذه الدراسات على الطرق الجزيئية بسبب التصميم الفريد والمعقد لكل من المنتجات والمقايسات نفسها ، مما يثير تساؤلات حول مدى ملاءمة المنصات المتاحة للتقييمات الموصى بها والطرق المناسبة للتحقق من صحة الفحص. حتى الآن ، لم تطلب إدارة الغذاء والدواء الأمريكية التحقق الرسمي من المقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على الرغم من أن وكالة الأدوية الأوروبية فرضت هذا المطلب17. في ضوء هذا الفراغ ، أصدرت مجموعات وورش عمل مختلفة أوراقا بيضاء وتوصيات سعى المصنعون ومنظمات البحوث التعاقدية إلى اتباعها18،19،20،21،22،23،24،25. تمت كتابة معظم هذه التوصيات على وجه التحديد مع وضع مقايسات qPCR في الاعتبار ، مع اقتراحات أو تعديلات للمنصات الناشئة ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR) ، المدرجة فقط حسب الاقتضاء. ركزت التوصيات الأحدث عهدا على اعتبارات مقايسات ddPCR ، لكنها ركزت إلى حد كبير على تطبيقاتها على القياس الكمي لجينوم المتجهات في بيئة التصنيع بدلا من المصفوفات البيولوجية المعقدة التي تمت مواجهتها في دراسات التكاثر البيولوجي.
اعتمادا على التطبيق السريري والأهداف ، قد يفضل ddPCR على qPCR لدعم دراسات التوزيع الحيوي والتساقط بسبب زيادة حساسية ddPCR وقدرته على التعامل مع تداخل المصفوفة مقارنة ب qPCR. علاوة على ذلك ، نظرا لتقسيم العينات إلى ما يقرب من 20000 قطرة ، يمكن تحقيق تقدير كمي دقيق لرقم النسخة دون استخدام منحنى قياسي باستخدام إحصائيات بواسون ، مما يبسط تطوير الطريقة والتحقق من صحتها. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج موحد لتطوير والتحقق من صحة طريقة قائمة على ddPCR للكشف عن ناقلات AAV في الدموع التي تم جمعها من سطح العين لدعم دراسات التكاثر البيولوجي السريرية.
1. إعداد جزء من الحمض النووي الاصطناعية
2. إعداد الاشعال والتحقيق
3. إعداد المخزن المؤقت لتخفيف العينة
الجدول 1: تحضير المخزن المؤقت لتخفيف العينة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
4. إعداد مزيج رئيسي
الجدول 2: مثال على تحضير المزيج الرئيسي PCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل 1: مثال على خريطة اللوحة للتحقق من دقة التحقق والتشغيل الدقيق. الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. إعداد مراقبة الجودة
الجدول 3: مثال على إعداد مراقبة الجودة (QC) باستخدام شظايا الحمض النووي الاصطناعية المزدوجة التي تقطعت بها السبل. الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
6. إعداد العينات
7. إضافة قالب
8. توليد القطرات الآلي ، وركوب الدراجات الحرارية ، وقراءة القطيرات
الجدول 4: ظروف الدراجات الحرارية النموذجية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
9. تحليل البيانات
ملاحظة: ما لا يقل عن 10000 قطرة لكل بئر ضروري للحساب الصحيح للتركيز باستخدام إحصائيات بواسون. لا تحاول التحليل على أي آبار تحتوي على أقل من 10000 قطرة.
الشكل 2: مثال على تحديد العتبة. الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
10. معايير قبول الفحص
لأغراض توضيحية ، تم تطوير اختبار مصمم للكشف عن ناقل AAV2 المتاح تجاريا والمحسن للبروتين الفلوري الأخضر (eGFP) ، مع جزء من الحمض النووي الاصطناعي المزدوج الذي تقطعت به السبل يحتوي على eGFP كمراقبة للجودة. حاليا ، هناك جدل مستمر حول ما إذا كان الناقل نفسه أو جزء الحمض النووي الاصطناعي أو البلازميد الخطي هو الأنسب للاستخدام كمراقبة الجودة. بشكل عام ، يمكن استخدام جزء الحمض النووي الاصطناعي أو البلازميد الخطي إذا تم إثبات التكافؤ مع المتجه في تطوير الطريقة (البيانات غير معروضة). تم تصميم البادئات والمجسات وتحسينها للكشف عن جين eGFP. يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي S1 للاطلاع على التسلسلات المستخدمة في هذا العمل. تم تحديد تركيز مخزون شظايا مراقبة الجودة تجريبيا باستخدام ddPCR. تم إجراء جميع المقايسات باستخدام التركيزات وشروط تفاعل البوليميراز المتسلسل الواردة كأمثلة في قسم البروتوكول.
بالنسبة لفحوصات qPCR ، يوصى بتقييم الخطية والحساسية والنطاق الديناميكي والدقة والدقة للمنحنى القياسي. نظرا لأن ddPCR لا يعتمد على منحنى قياسي للقياس الكمي المستهدف ، يجب تعديل هذه التوصيات. بدلا من ذلك ، تم استخدام QCs التي تتكون من شظايا الحمض النووي الاصطناعية المزدوجة التي تقطعت بها السبل المخففة إلى تركيزات مختلفة لتمتد على النطاق الكمي المتوقع لتفاعل ddPCR بناء على النمذجة الإحصائية بواسون29،30،31،32 لتحديد النطاق الديناميكي والحساسية وتقييم الدقة والدقة. استند اختيار تركيزات مراقبة الجودة في المقام الأول إلى النسبة المتوقعة للقطرات الموجبة إلى الكلية داخل بئر عند تركيز معين. رياضيا ، يكون ddPCR أكثر دقة من الناحية النظرية عندما يتم تضخيم ما يقرب من 80٪ من الأقسام بشكل إيجابي. مع زيادة نسبة القطيرات الموجبة إلى الكلية فوق 0.8 ، تنخفض الدقة بسبب تشبع الأقسام ، مع عدم إمكانية القياس الكمي بمجرد أن تكون 100٪ من القطرات موجبة. في النهاية المنخفضة ، من الناحية النظرية ، يمكن اكتشاف أقل من قطرة إيجابية واحدة وتحديدها كميا ، على الرغم من أن الدقة أضعف والفحص يخضع لإيجابيات كاذبة منخفضة المستوى. عادة ، يجب أن تكون ثلاث قطرات على الأقل موجبة حتى يتم حساب النتيجة بثقة 95٪ ، وهي عتبة حساب التركيز الذي استخدمناه هنا.
تم إعداد سلسلة من خمسة تركيزات مختلفة لمراقبة الجودة ، مع عدد النسخ المستهدف / ميكرولتر من أحجام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المحسوبة من المتوقع أن تسفر عن نسب قطرات موجبة إلى إجمالي تمتد على النطاق القابل للقياس الكمي ل ddPCR ، كما هو موضح في الجدول 5. تم استخدام هذه لتقييم دقة ودقة الفحص. في التقييم هنا ، لم يتم دفع الحدود العليا والدنيا للقياس الكمي إلى الحد الأقصى النظري الممكن في ddPCR. قد يكون القياس الكمي الدقيق ممكنا في مستويات أعلى وأدنى مما هو موضح هنا. يجب تطوير النطاق بما يتماشى مع التطبيقات النهائية لهذه الطريقة.
تم إعداد ما مجموعه ثلاث سلاسل تخفيف معدة بشكل مستقل من هذه QCs في مخزن تخفيف العينة لكل دفعة لتقييم دقة ودقة الفحص الداخلي. تم تضمين الآبار المكررة لكل تخفيف لمراقبة الجودة. لمحاكاة بروتوكول التحقق الفعلي ، تم إجراء ما مجموعه ست دفعات من الدقة والدقة بواسطة العديد من المحللين على مدار عدة أيام. تم تحليل النتائج من هذه الدفعات الست لتحديد دقة ودقة الفحص الداخلي والفحص الداخلي للطريقة وتحديد النطاق الديناميكي للمقايسة.
تم تقييم أداء الفحص الداخلي لكل دفعة على كل مستوى من مستويات مراقبة الجودة. توقعنا أن تحتوي جميع آبار مراقبة الجودة و NTC على 10000 قطرة على الأقل. وقد تم تحقيق ذلك في 216 بئرا من أصل 216 بئرا تم اختبارها عبر جميع الدفعات الست ، بمتوسط عدد قطرات يبلغ 19,748 قطرة / بئر (الجدول 6). بعد ذلك ، كان من المتوقع أن تكون النسبة المئوية للسيرة الذاتية لكل مجموعة من الآبار المكررة لكل مراقبة الجودة ≤25.0٪ ، باستثناء الحد الأعلى والأدنى لمراقبة الجودة ، حيث كان من المتوقع ≤30.0٪. وقد تم تحقيق ذلك في مجموعات من 90 بئرا من أصل 90 بئرا تم اختبارها عبر جميع الدفعات الست لمراقبة الجودة ، بمتوسط CV بين الآبار بنسبة 3.9٪ عبر جميع مستويات مراقبة الجودة (الجدول 7). أسفرت جميع QCs عن متوسط إيجابي إلى إجمالي نسب القطيرات ضمن النطاقات المتوقعة الموضحة أعلاه (الجدول 6).
داخل كل دفعة ، تم حساب المتوسط داخل الفحص والانحراف المعياري لكل نقطة من نقاط سلسلة التخفيف المعدة بشكل مستقل ، وتم استخدامها لحساب متوسط الفحص الداخلي لكل تركيز في كل فحص. تم استخدام هذا لتقييم دقة ودقة الفحص (الجدول 8). تشير الدقة إلى التباين في البيانات من النسخ المتماثلة لنفس العينة المتجانسة في ظل ظروف الفحص العادية ويتم تقييمها عن طريق حساب النسبة المئوية للسيرة الذاتية للحصص المتعددة المضمنة. توقعنا أن تسفر الحصص الثلاثة التي تم اختبارها داخل كل دفعة عن CV داخلي ≤25.0٪ ، باستثناء الحد الأعلى والأدنى لمراقبة الجودة حيث كان من المتوقع ≤30.0٪. تم استيفاء ذلك لجميع مستويات مراقبة الجودة الخمسة في كل دفعة من الدفعات ال 60 (30 من إجمالي 30 عرضا). بشكل عام ، يمكن تحقيق دقة أكبر داخل الفحص من المعايير المستهدفة ، بمتوسط CV داخل المقايسة بنسبة 7.7٪ عبر جميع مستويات مراقبة الجودة. تشير الدقة إلى قرب الاتفاق بين القيمة المحددة تجريبيا والقيمة الاسمية. يتم تقييم ذلك عن طريق حساب النسبة المئوية للخطأ النسبي (٪ RE ، أو ٪ Bias) بين التركيزات المحسوبة لكل مراقبة الجودة وتركيزاتها الاسمية المتوقعة نظريا. كان من المتوقع أن يكون المتوسط الداخلي للمقايسة للحصص الثلاثة ±25.0٪ RE من التركيز الاسمي ، باستثناء الحد الأعلى والأدنى لمراقبة الجودة حيث كان من المتوقع ±30.0٪. تم استيفاء ذلك لجميع مستويات مراقبة الجودة الخمسة في كل دفعة من الدفعات ال 60 (30 من إجمالي 30 عرضا). بشكل عام ، يمكن تحقيق دقة أكبر داخل الفحص من هدفنا ، بمتوسط مطلق للمقايسة الداخلية٪ RE بنسبة 4.2٪ عبر جميع مستويات مراقبة الجودة. في جميع عروض NTC (إجمالي 30) ، لم يتم اكتشاف قطرات إيجابية.
كما تم حساب الدقة والدقة بين المقايسة باستخدام المتوسط الداخلي لكل مستوى من مستويات مراقبة الجودة داخل كل دفعة. كان من المتوقع أن تكون دقة الفحص الداخلي ≤25.0٪ CV ، باستثناء الحد الأعلى والأدنى لمراقبة الجودة حيث كان من المتوقع ≤30.0٪. وبالمثل ، بالنسبة لدقة الفحص الداخلي ، كان من المتوقع ±25.0٪ RE ، باستثناء الحد الأعلى والأدنى لمراقبة الجودة حيث كان من المتوقع ±30.0٪. وقد لوحظت دقة ودقة أكبر بكثير بين المقايسة من هذه الأهداف (الجدول 9) ، مع دقة بين المقايسة تتراوح من 4.0٪ إلى 8.5٪ ودقة مطلقة بين المقايسة تتراوح من 1.0٪ إلى 3.2٪. بشكل جماعي ، توضح هذه النتائج أن هذه الطريقة يمكن أن تحقق دقة ودقة كافية داخل وبين المقايسة بشكل جيد ضمن أهداف الصناعة الحالية. يمكن تحديد النطاق الديناميكي لهذا الفحص من 2500-2.5 نسخة لكل ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بناء على هذه النتائج ، مع حساسية فحص إجمالية تبلغ 2.5 نسخة لكل ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. كما ذكرنا سابقا ، قد يكون من الممكن التحقق من صحة النطاقات الديناميكية الأوسع.
بعد ذلك ، كان من الضروري تقييم دقة الفحص ودقته داخل المصفوفة المستهدفة - في هذه الحالة ، الدموع. عادة ، يتم التحقق من صحة المقايسات قبل بدء الدراسات السريرية ، مما يعني أنه من غير المحتمل أن تكون الدموع التي تم جمعها من المرضى المعالجين بالنواقل متاحة لأغراض التحقق من الصحة. يمكن إنشاء هذا بشكل مصطنع عن طريق رفع ناقل AAV المستهدف إلى دموع تم جمعها من المتبرعين المتطوعين لإنشاء QCs مسننة بالمصفوفة. تم جمع الدموع البشرية المجمعة من قبل طرف ثالث (BioIVT). لإثبات المبدأ ، تم استخدام متجه AAV2 يعبر عن eGFP تم الحصول عليه من مصدر تجاري. تم تحديد تركيز مخزون ناقل AAV2 تجريبيا باستخدام ddPCR ، دون استخدام خطوة عزل الحمض النووي ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. في كل شوط ، تم رفع AAV2 بشكل مستقل إلى القسامات الثلاثة المسيل للدموع عند مستوى مرتفع (متوقع 1.41 × 103 نسخ / تفاعل PCR ميكرولتر) ومستوى منخفض (28.2 نسخة / تفاعل PCR ميكرولتر). تم تضمين القسامات غير المسننة كعنصر تحكم لإثبات خصوصية الطريقة.
تم تقييم أداء الفحص الداخلي لكل دفعة عند كل مستوى سبايك. كان من المتوقع أن تحتوي جميع عينات المسيل للدموع على 10000 قطرة على الأقل. وقد تم تحقيق ذلك في 108 من أصل 108 آبار تم اختبارها عبر جميع الدفعات الست، بمتوسط إجمالي لعدد القطرات يبلغ 20,208 قطرة/بئر (الجدول 10). بعد ذلك ، كان من المتوقع أن تكون النسبة المئوية للسيرة الذاتية لكل مجموعة من الآبار المكررة لكل مراقبة الجودة ≤25.0٪ لمستويات الارتفاع العالية والمنخفضة. وقد تم استيفاء ذلك في 36 من أصل 36 مجموعة من الآبار التي تم اختبارها عبر جميع الدفعات الست لمراقبة الجودة ، بمتوسط CV بين الآبار بنسبة 3.2٪ (الجدول 11).
داخل كل دفعة ، تم حساب متوسط الفحص الداخلي والانحراف المعياري لكل من مسامير الدموع المعدة بشكل مستقل ، وتم استخدامها لحساب متوسط الفحص الداخلي لكل تركيز في كل فحص. تم استخدام هذا لتقييم دقة ودقة الفحص في المصفوفة (الجدول 12). توقعنا أن تكون نسبة CV داخل الفحص ≤25.0٪ ومستويات ارتفاع عالية ومنخفضة. وقد تم تحقيق ذلك في ست دفعات من أصل ست دفعات لكل مستوى. بشكل عام ، يمكن تحقيق دقة أكبر للفحص الداخلي في المصفوفة من الهدف ، بمتوسط CV داخل المقايسة بنسبة 3.7٪ عند المستوى العالي و 12.2٪ عند المستوى المنخفض (إجمالي 8.0٪). كان من المتوقع أيضا أن تكون نسبة RE للفحص الداخلي ±25.0٪ عند كلا مستويي الارتفاع. وقد تم تحقيق ذلك في ست دفعات من أصل ست دفعات لكل مستوى. وبالمثل ، وجد بشكل عام أنه يمكن تحقيق دقة أكبر داخل المقايسة في المصفوفة من الهدف ، بمتوسط نسبة RE المطلقة داخل المقايسة بنسبة 8.1٪ عند المستوى المنخفض و 11.3٪ عند المستوى العالي (بشكل عام 9.7٪). بالنسبة للتحكم غير المسنن ، لم يتم اكتشاف أي إشارة eGFP في أي من الحصص (الجدول 12) ، مما يدل على خصوصية الطريقة في مصفوفة الدموع البشرية.
كما تم حساب دقة الفحص الداخلي والدقة في مصفوفة المسيل للدموع باستخدام المتوسط الداخلي لكل مستوى ارتفاع داخل كل دفعة. كان من المتوقع أن تكون دقة الفحص الداخلي ≤25.0٪ CV ، وللدقة بين المقايسة ، توقعنا ±25.0٪ RE. وقد لوحظت دقة ودقة أكبر بكثير بين المقايسات من هذه الأهداف (الجدول 13)، مع دقة بين المقايسة بنسبة 5.5٪ عند المستوى العالي و 7.1٪ عند المستوى المنخفض، وبدقة مقايسة بينية مطلقة تبلغ 11.3٪ عند المستوى العالي و 8.1٪ عند المستوى المنخفض. بشكل جماعي ، توضح هذه النتائج دقة ودقة وخصوصية الطريقة في مصفوفة الدموع.
الجدول 5: ضوابط الجودة المستخدمة لتحديد النطاق الدينامي للفحص. الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 6: إجمالي عدد القطرات ونسب القطرات الإيجابية إلى الكلية لمراقبة جودة الحمض النووي الاصطناعي المزدوج الشريط و NTC. الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 7: إحصائيات مراقبة الجودة بين الآبار (أهداف النسخ / تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بالميكرولتر). الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 8: دقة ودقة الفحص الداخلي لمراقبة الجودة (أهداف النسخ / تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بالميكرولتر). الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 9: دقة ودقة الفحص البيني لمراقبة الجودة (أهداف النسخ / تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بالميكرولتر). الاختصارات: ULQC = الحد الأعلى لمراقبة الجودة ؛ HQC = مراقبة الجودة العالية ؛ MQC = مراقبة الجودة المتوسطة ؛ LQC = مراقبة الجودة المنخفضة ؛ LLQC = مراقبة جودة الحد الأدنى ؛ NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 10: إجمالي عدد قطرات عينات الدموع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 11: إحصائيات عينة المسيل للدموع بين الآبار (أهداف النسخ / تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ميكرولتر). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 12: دقة الفحص الداخلي ودقة عينات الدموع (أهداف النسخ / تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ميكرولتر). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 13: دقة الفحص البيني ودقة عينات الدموع (أهداف النسخ / تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ميكرولتر). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول التكميلي S1: تسلسل التمهيدي والمجسات ومراقبة جودة الحمض النووي الاصطناعية المزدوجة التي تقطعت بها السبل المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
جميع المؤلفين هم موظفون في KCAS Bioanalytical and Biomarker Services ، وهي منظمة أبحاث تعاقدية تقدم خدمات تطوير شاملة متوافقة مع الممارسات المختبرية الجيدة / الممارسات السريرية الجيدة من دعم الاكتشاف المبكر من خلال تسجيل المنتج ، بما في ذلك دعم المقايسات القائمة على AAV ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. مولت KCAS هذا المشروع ونشر هذا البروتوكول. على الرغم من عدم وجود إرشادات حالية لإدارة الغذاء والدواء لتصميم التجارب المقدمة في هذه الورقة والتحقق من صحتها ، فقد اعتمد الخبراء وقادة الفكر الذين يطورون مثل هذه الدراسات في KCAS هذا النهج كنهج أساسي. وتناقش معايير وبارامترات إضافية على أساس كل مشروع على حدة ويمكن إدراجها بناء على الاستخدام المقصود.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتطوير الممارسات المختبرية الجيدة والتحقق من صحتها في الكشف المتوافق عن النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في الدموع البشرية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي لدعم التطوير السريري لنواقل العلاج الجيني.
نود أن نشكر راسل وبراندون ماكيثان من Bio-Rad على مناقشاتهم المفيدة أثناء تطوير هذه الطريقة.
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL ، يستخدم كدليل على ناقل المبدأ |
| استخدام نظام PCR الرقمي AutoDG Droplet | Bio-Rad | QX200 | البديل لنظام ddPCR التالي s البروتوكول. |
| زيت AutoDG للمجسات | Bio-Rad | 1864110 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| التحكم في المخزن المؤقت ddPCR للمجسات | Bio-Rad | 1863052 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR وكيمياء PCR. |
| DDPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| ddPCR Piercable احباط الأختام | Bio-Rad | 1814040 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| لوحات ddPCR 96 جيدا ، شبه التنورة | Bio-Rad | 12001925 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP) | Bio-Rad | 1863023 أو 1863024 أو 1863025 | استخدم مزيجا رئيسيا متوافقا مع البادئات / المجسات ونظام ddPCR. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| نظام Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | البديل ddPCR التالي للشركة المصنعة s البروتوكول. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N / A |
| Ambion | AM9906 | N / A | |
| PCR PLATE SEALER | Bio-Rad | PX1 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| نصائح ماصة ل AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
| Pluronic F-68 غير أيوني خافض للتوتر السطحي | Gibco | 24040 | N / A |
| برايمر ومجسات التحلل المائي | تصميمات مختلفة | تعتمد على التسلسل المستهدف باستخدام الأساليب العامة لتصميم التمهيدي / المسبار. حدد الفلورفورات والتبريد المتوافقة مع نظام ddPCR. | |
| يختلف إنزيم التقييد | مختلف | مع تسلسل تضخيم الهدف. استخدم إنزيم التقييد الذي لا يقطع في التسلسل المضخم | |
| المنوية من سمك السلمون المقطوع ، الحمض النووي | ThermoFisher | AM9680 | N / A |
| جزء جيني من الحمض النووي الاصطناعي أو البلازميد الخطي | تصميم مختلف | ،جزء | من الحمض النووي الاصطناعي يحتوي على منطقة التضخيم المستهدفة لاستخدامه كمراقبة الجودة |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | تأكد من التحضير أو الشراء خاليا من النوكلياز. 10 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك ، 1.0 ملي EDTA ، الرقم الهيدروجيني = 8.0 |
| اللمس الحراري Cycler | Bio-Rad | C1000 | أو استخدم مواد متوافقة مع نظام ddPCR. |
