اختبار ضغط الفأر القطني أحادي المحور مع تضمين سطح التحميل

من المسلم به على نطاق واسع أن التغيرات العظمية المرتبطة بالعمر تمثل مشكلة بسبب زيادة خطر الإصابة بكسور العظام المرتبطة بهذه التغييرات. يمكن أن تؤدي كسور العظام لدى البشر إلى ألم مزمن ، وانخفاض الحركة ، وإعاقة طويلة الأجل ، وزيادة خطر الوفاة ، والأعباء الاقتصادية¹. تشمل العلاجات الشائعة التي تم التحقيق فيها لمعالجة أعراض تغيرات العظام المرتبطة بالعمر المكملات الغذائية والعلاجات الهرمونية والأدوية^{2،3،4،5،6،7،8،9}. عادة ما يتم إجراء التحقيقات الأولية لمثل هذه العلاجات للبشر باستخدام نماذج حيوانية صغيرة (مثل الجرذان والفئران المختبرية) ، والتي تمتلك نوعين رئيسيين من العظام الموجودة في الهيكل العظمي البشري¹⁰. العظام الطويلة الطرفية ، مثل عظم العضد وعظم الفخذ والساق ، غنية بالعظام القشرية (أي المدمجة) ، في حين أن الفقرات غنية بالعظام الملغاة (أي العظم المنسوج أو الإسفنجي أو التربيقي)⁴. هناك معرفة متزايدة بأن آليات تنظيم العظام ومسارات الإشارات تختلف بين العظم القشري (على سبيل المثال ، منتصف العظم الطويل) والعظم الملغي (على سبيل المثال ، مركز العمود الفقري)². لهذا السبب ، قد يكون للعلاجات تأثيرات تفاضلية خاصة بالعظام أو حتى خاصة بالموقع داخل نفس العظم^2،3،4.

يؤدي تطبيق القوة على جسم ما (على سبيل المثال ، العظم) إلى تعرض الجسم للتسارع أو التشوه أو كليهما ، اعتمادا على ظروف حدود الجسم. عندما يكون العظم مقيدا ، تقاوم قوة معاكسة متساوية الحجم تسارع العظم ، ويحدث تشوه. عندما يحافظ العظم على التشوه ، يتم إنشاء مقاومة داخلية تسمى الإجهاد ، والتي يوجد منها نوعان أساسيان: القوة العادية ، في شكل توتر أو ضغط ، وقوة القص¹⁰. في كثير من الأحيان ، يتم إنشاء مزيج من الأنواع الأساسية من الإجهاد ، اعتمادا على نظام القوة المطبقة¹⁰. تكمن قوة المادة في قدرتها على تحمل الإجهاد دون أن تفشل. مع تطبيق قوى أكبر بشكل متزايد على مادة ما ، فإنها تخضع في النهاية لتشوه دائم ، وعند هذه النقطة يقال إنها انتقلت من حالة مرنة (أي ستعود إلى شكلها الأصلي إذا تمت إزالة القوة) إلى حالة بلاستيكية (أي لن تعود إلى شكلها الأصلي إذا تمت إزالة القوة)¹¹. تسمى النقطة التي يحدث عندها الانتقال من الحالة المرنة إلى الحالة البلاستيكية نقطة العائد. مع تطبيق قوى أكبر على المادة خارج نقطة الخضوع ، فإنها تحافظ بشكل متزايد على الكسور الدقيقة (أي التلف) حتى يحدث الكسر الكلي ؛ في هذه المرحلة ، يقال إن المادة فشلت^11,12. يمثل كسر العظم فشلا على كل من المستوى الهيكلي ومستوى الأنسجة¹⁰. على سبيل المثال ، يحدث كسر عظم العمود الفقري ليس فقط بسبب فشل الترابيق المتعدد على المستوى الهيكلي ، ولكن هناك أيضا فشل في عناصر المصفوفة خارج الخلية مثل بلورات الكولاجين والهيدروكسيباتيت في الترابيكولا الفردية على مستوى الأنسجة.

يمكن قياس الأحداث الميكانيكية التي تؤدي إلى فشل المادة باستخدام مجموعة متنوعة من طرق الاختبار. الانحناء ثلاثي النقاط هو طريقة شائعة لاختبار الخواص الميكانيكية للعظام الطويلة من الهيكل العظمي الطرفي. هذه الطريقة بسيطة وقابلة للتكرار ، مما يجعلها الطريقة المفضلة للاختبار الميكانيكي الحيوي للعديد من الباحثين¹³. من خلال خفض شعاع متقاطع على منتصف الحجاب الحاجز لعظم طويل يرتكز على حزمتين داعمتين سفليتين ، تختبر هذه الطريقة على وجه التحديد الخواص الميكانيكية لمنطقة الحجاب الحاجز الأوسط ، وهي عظم قشري منظم بكثافة. من منحنيات إزاحة الحمل ، يمكن تحديد تأثيرات قوة الشد على المرونة والمتانة والقوة إلى الفشل والانتقال من السلوك المرن إلى السلوك البلاستيكي للمواد العظمية ، من بين خصائص أخرى.

في النوع الثاني من العظام ، يشار إليه باسم العظم التربيقي أو الإسفنجي أو المنسوج أو الملغي ، تتشكل عناصر العظام في مجموعة من القضبان والحزم تسمى الترابيق ، مما يعطي مظهرا "إسفنجيا". الأجسام الفقرية الرئيسية (أي سنترا) غنية بالعظام الملغاة وغالبا ما تكون مواقع كسور العظام الانضغاطية المرتبطة بالعمر في البشر¹⁴. الفقرات القطنية (أي أسفل الظهر) هي أكبر الفقرات ، وتتحمل معظم وزن الجسم ، وهي الموقع الأكثر شيوعا لكسور العمود الفقري^15,16. يمكن تقييم الخواص الميكانيكية للأجسام الفقرية بشكل مباشر باستخدام طرق اختبار الضغط أحادي المحور لأن الضغط المحوري هو حمل القوة الطبيعي المفروض على الأعمدة الفقرية في الجسم الحي¹⁷. يحدث ضغط الأجسام الفقرية في الجسم الحي نتيجة تقلصات العضلات والأربطة ، وقوة الجاذبية ، وقوى رد الفعل الأرضي¹⁸.

قد يكون اختبار الضغط خارج الجسم الحي لفقرات الصغيرة أمرا صعبا بسبب صغر حجمها وشكلها غير المنتظم وهشاشتها. يمكن تقدير شكل الأجسام الفقرية على أنه متوازي أضلاع مع ميل بطني خفيف وتقعر طفيف في الجمجمة¹⁷. يمثل هذا الشكل تحديات لتحقيق اختبار الضغط أحادي المحور خارج الجسم الحي لأنه بدون تحضير كاف لسطح التحميل ، سيتم تطبيق قوى الضغط على جزء فقط من سطح التحميل ، مما يؤدي إلى "اتصال محلي"^17,19. هذا يمكن أن يسبب نتائج غير متسقة وفشل سابق لأوانه¹⁹. ليس هذا هو الحال في الجسم الحي لأن سطح التحميل محاط بأقراص الفقرية في المفاصل الفقرية ، مما يسمح بتوزيع الحمل في جميع أنحاء لوحة نهاية الجمجمة. يلعب مجمع لوحة نهاية القرص الفقري الجمجمة دورا مهما في تطبيق القوة في جميع أنحاء الجسم الفقري والميكانيكا الحيوية للكسر على الجسم الفقري^14,20. في حين أن اختبار الضغط ليس جديدا على مجال علم الأحياء ، إلا أن هناك قيودا في الطرق الحالية للاختبار الميكانيكي للعظام. تشمل هذه القيود عدم وجود نماذج تنبؤية ومحاكاة لميكانيكا العظام ، والهندسة المكانية الهندسية الفريدة ، وحتى الاختلافات البيولوجية المتأصلة القائمة على العينات²¹. والأهم من ذلك ، أن هذا المجال يواجه تحديا بسبب الافتقار إلى التوحيد بين الأساليب والنقص العام في الأساليب المبلغ عنها في الأدبيات²².

هناك طريقتان تم الإبلاغ عنهما في الأدبيات لإعداد الفقرات القطنية للقوارض لتحقيق اختبار الانضغاط أحادي المحور: طريقة القطع وطريقة التضمين^{17،19،23،24،25،26}. تتطلب طريقة القطع قطع العمليات الفقرية ولوحة نهاية الجمجمة ولوحة النهاية الذيلية من الجسم الفقري. أبلغ Pendleton et ^al.19 سابقا عن طريقة مفصلة لاستخدام هذه الطريقة على الفقرات القطنية للفأر. تقدم هذه الطريقة تحديات تحقيق قطع متوازية تماما في كل من الصفائح الطرفية الذيلية والجمجمية مع تجنب أي ضرر للعينة. كما أن لديها قيود على إزالة لوحة نهاية الجمجمة. تحتوي الصفيحة النهائية الجمجمة على قشرة كثيفة من العظم القشري وتلعب دورا مهما في توزيع الأحمال من الأقراص الفقرية في الجسم الحي وتشارك في فشل العظم للكسور في الجسم الحي ^17،20،27. في المقابل ، تتضمن طريقة التضمين إزالة العمليات الفقرية مع الحفاظ على لوحة نهاية الجمجمة للجسم الفقري سليمة. ثم يتم جعل سطح التحميل أفقيا تقريبا عن طريق وضع كمية صغيرة من الأسمنت العظمي على الطرف الجمجمة للجسم الفقري. تتميز هذه الطريقة بأنها تتغلب على التحديات التقنية المرتبطة بطريقة القطع وقد تحاكي بشكل أفضل آلية تطبيق الحمل وفشل العظام في الجسم الحي بسبب الحفاظ على لوحة نهاية الجمجمة. تم توثيق هذا النهج سابقا في الدراسات التي تتضمن اختبار الضغط أحادي المحور على عظام الفئران. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم يتم توثيقه مسبقا في سياق الفقرات القطنية الأصغر للفأر^17،25،26. تم تفصيل الطريقة المعنية سابقا بواسطة Chachra et ^al.25 واستخدمت في الأصل عينة عظمية محفوظة بين لوحين ، لكل منهما تجويف أسطواني ، والذي تم ملؤه بعد ذلك ببولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA). قامت نفس المجموعة البحثية لاحقا بتحسين الطريقة التي يتم فيها صنفرة أحد طرفيها بلطف (ذيلية) ، والطرف الآخر به بقعة صغيرة من الأسمنت العظمي المضاف (الجمجمة)²⁶. هذه الطريقة هي تحسين على الطريقة السابقة لأنها تقلل من المواد بين الصفائح وهي محور هذه المقالة. على الرغم من التحديات المرتبطة باختبار ضغط العمود الفقري أحادي المحور ، إلا أنها طريقة قد توفر معلومات قيمة فيما يتعلق بآثار العلاج المقترح على العظام ، خاصة عند إقرانها بالانحناء ثلاثي النقاط.

هنا ، يتم تقديم استخدام آلة اختبار الانحناء / الضغط ثلاثية النقاط القابلة للتحويل للسماح بالاختبار السهل لكل من العظام الطويلة والأجسام الفقرية باستخدام آلة واحدة. علاوة على ذلك ، يتم تقديم استخدام طريقة التضمين لتحقيق اختبار ضغط أحادي المحور لفقرات الفأر القطنية. أجريت الدراسة الحالية كجزء من دراسة أكبر تهدف إلى التحقيق في تأثيرات مكملات بذور القنب الغذائية على خصائص العظام الهيكلية في الفئران الشابة المتنامية C57BL / 6 ^5,6. تم إنشاء جهاز اختبار الانحناء ثلاثي النقاط في الأصل من قبل أعضاء هيئة التدريس والطلاب في قسم الهندسة بجامعة ولاية كولورادو - بويبلو واستخدمته مجموعتنا البحثية في اختبارات الانحناء ثلاثية النقاط على العظام الطويلة [عظم الفخذ والساق⁷ وعظم الفأر وعظم الفخذ والساق^5،6،8،9]. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف تعديله وتطبيقه للاستخدام في اختبار ضغط جسم العمود الفقري للفئران. تم وصف تصميم وبناء آلة الثني ثلاثية النقاط سابقا⁷. سيركز هذا التقرير على الطرق المستخدمة لتعديل الجهاز لاختبار الضغط ولتصحيح إزاحة النظام. ثانيا ، تم وصف طريقة التضمين لإعداد سطح تحميل جسم العمود الفقري للفأر ، إلى جانب طرق اختبار الضغط أحادي المحور وتحليل بيانات إزاحة الحمل.

أجريت جميع التجارب والبروتوكولات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر من المعاهد الوطنية للصحة وحصلت على موافقة من لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ولاية كولورادو - بويبلو (رقم البروتوكول: 000-000A-021). تم وصف الإجراءات التفصيلية لرعاية سابقا ^5,6. تم الحصول على الفئران في عمر ثلاثة أسابيع كجزء من دراسة أوسع تهدف إلى التحقيق في آثار النظام الغذائي المكمل لبذور القنب على إناث الفئران الصغيرة المتنامية C57BL / 6 (انظر جدول المواد). من 5 إلى 29 أسبوعا من العمر ، تم تربية الفئران على واحد من ثلاثة أنظمة غذائية: التحكم (0٪ بذور القنب) ، 50 جم / كجم (5٪) بذور القنب ، أو 150 جم / كجم (15٪) بذور القنب ، مع ثمانية فئران لكل مجموعة ^5,6. طوال فترة الدراسة ، كان لدى الفئران إمكانية الوصول إلى وجباتها الغذائية ومياهها ، وتم إيواؤها في أقفاص من البولي كربونات ، وتم الحفاظ عليها في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة: 12 ساعة (مع إضاءة من الساعة 06:00 إلى الساعة 18:00). تم تقييم وزن الفئران وصحتها أسبوعيا ، وأكملت جميع الفئران الدراسة بنجاح دون تطوير أي ظروف صحية ضارة. في تسعة وعشرين أسبوعا من العمر ، تم تخدير الفئران بعمق باستخدام غاز الأيزوفلوران والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم ^5,6. تم إجراء شق في خط الوسط على السطح البطني من القص إلى الذيل ، وتمت إزالة جميع الأعضاء داخل الصدر والبريتوني وخلف الصفاق من الجثث. تم حفظ الجثث المنزوعة الأحشاء في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ عند -70 درجة مئوية حتى وقت تشريح العظام لاختبار الفقرات ، والذي حدث بعد عام تقريبا.

1. تحويل آلة الثني ثلاثية النقاط إلى آلة اختبار الضغط

1. قم بفك العارضة المتقاطعة المتصلة بمستشعر الحمل في آلة الثني^{ثلاثية النقاط 7} (انظر جدول المواد) (الشكل 1 أ ، ب).
2. قم بربط السطح الزجاجي العلوي ذاتي المحاذاة على مستشعر الحمل (انظر جدول المواد) باستخدام خيوط مطابقة للعارضة المتقاطعة (الشكل 1C).
3. قم بحفر فتحتين أفقيتين في كل من الدعامات السفلية ، حيث سيتم توصيل السطح الزجاجي السفلي لاحقا (الشكل 1 د).
4. اضغط على الخيوط في جانبي السطح الزجاجي السفلي المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ لمحاذاة الثقوب المحفورة في الدعامات السفلية (الشكل 1E).
5. ثبت السطح الزجاجي السفلي بالدعامتين السفليتين باستخدام مسامير سداسية ملولبة وشدها حتى يتم تثبيتها (الشكل 1F).
   ملاحظة: يجب أن تحتوي البراغي السداسية على خيوط تتطابق مع الثقوب الموجودة على الدعامات السفلية والألواح العلوية / السفلية. قد يساعد استخدام السطح الزجاجي العلوي ذاتي المحاذاة في تحقيق اتصال موحد بين السطح الزجاجي العلوي وسطح التحميل ، ولكنه غير كاف نظرا لتقعر نهاية الجمجمة للأجسام الفقرية. مطلوب مزيد من التحضير باستخدام طريقة تحضير سطح التحميل. عند إنشاء آلة اختبار الضغط لعظام الصغيرة ، والتي تكون أصغر وأضعف من العديد من المواد الصناعية / الهندسية ، من الضروري مراعاة سعة تحميل مستشعر الحمل وحجم إطار الحمل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنظيف الآلات وتزييتها بانتظام لضمان نتائج دقيقة وتشغيل سلس.

2. تصحيح إزاحة آلة اختبار الضغط

1. مع عدم وجود مادة اختبار بين السطح الزجاجي العلوي والسطح الزجاجي السفلي، قم بخفض السطح الزجاجي العلوي على السطح الزجاجي السفلي حتى يتم ملامسة الضوء (~0.3-0.5 نيوتن قوة التحميل المسبق).
2. قم بتشغيل الجهاز بسرعة خفض ثابتة (~ 1 مم / دقيقة) لبدء اختبار الضغط. جمع قياسات الحمل (N) والإزاحة (مم) باستخدام برنامج جمع البيانات الرقمية (انظر جدول المواد) لجمع بيانات الاختبارات الميكانيكية.
   ملاحظة: نظرا لعدم وجود مادة بين السطح الزجاجي العلوي والسفلي ، فإن كل الإزاحة التي تمت ملاحظتها ستكون بسبب إزاحة الماكينة وحدها (_آلة Δx) (الإطار ، خلية الحمل ، الصفائح ، أدوات التوصيل ، إلخ).
3. استمر في خفض السطح الزجاجي العلوي على السطح الزجاجي السفلي بسرعة ثابتة (أي أحادية التوتر) حتى يتم الوصول إلى قوى أعلى مما سيتم الحصول عليه من جميع عينات العظام.
4. كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.3 ليصبح المجموع ثلاث مرات.
5. ارسم بيانات إزاحة النظام (_آلة Δx ، مم) مقابل . الحمل المطبق (القوة ، N).
6. قم بملاءمة خط الانحدار الأكثر ملاءمة للبيانات (الشكل 2A-D).
7. في جدول بيانات يحتوي على بيانات من اختبار ضغط العظام ، استخدم المعادلة التي يوفرها تحليل الانحدار لتحديد مقدار إزاحة الماكينة (_آلة Δx) التي تؤثر على الإزاحة المسجلة (إجمالي Δx_{المسجل)} لنقطة بيانات اختبار ضغط الفقرات القطنية للفأر.
   ملاحظة: على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك نقطة بيانات حيث يتم تطبيق 18 N من القوة ، وتم تسجيل 2.730 مم من الإزاحة (إجمالي Δx_{المسجل).} وفقا لمثال معادلة الانحدار متعدد الحدود من الدرجة الثالثة (الشكل 2D) [_آلة Δx = (4 × 10-7 × الحمل المطبق³) - (8 × ^10-5 × الحمل المطبق²) + (0.0044 × الحمل المطبق)] ، 0.056 مم من الإزاحة المسجلة ناتجة عن إزاحة الماكينة (_آلة Δx).
   _{Δx الإجمالي المسجل = آلة} Δx + _عينة Δx
8. صحح الإزاحة المسجلة لنقطة البيانات.
   ملاحظة: على سبيل المثال، ضع في اعتبارك المثال أعلاه. إذا تم تسجيل 2.730 مم من الإزاحة (إجمالي Δx_{المسجل)} وإزاحة الماكينة _(آلة Δx) تمثل 0.056 مم من الإجمالي ، فإن الإزاحة التي خضعت لها العينة (أي العظام) ذات الأهمية (_عينة Δx) هي 2.664 مم. وبالتالي ، فإن 2.664 مم هي الإزاحة الفعلية التي خضعت لها الفقرة (_عينة Δx) وهي القيمة التي سيتم استخدامها لتحليل منحنى إزاحة الحمل.
   _عينة Δx = إجمالي Δx_{المسجل - آلة} Δx
9. كرر الخطوات 2.7-2.8 لكل نقطة بيانات تم جمعها لكل عينة (عظم).
   ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لأنه أثناء اختبار الضغط ، لا يكون الإزاحة المرصودة بسبب إزاحة العينة فحسب ، بل بدلا من ذلك ، فإن الإزاحة المرصودة هي مزيج من إزاحة الماكينة (_آلة Δx) (على سبيل المثال ، ضغط / إزاحة الإطار ، خلية الحمل ، الألواح ، أدوات التوصيل ، إلخ) والعينة (_عينة Δx). وبالتالي ، بالنسبة للعينات التي تخضع لكميات صغيرة نسبيا من الإزاحة ، مثل تلك الخاصة بحيوان صغير (مثل الفأر) ، يمكن أن يتسبب إزاحة النظام (_آلة Δx) في حدوث أخطاء كبيرة. الإجراءات الموصوفة هنا لتصحيح إزاحة النظام تم الإبلاغ عنها سابقا من قبل Kalidindi و^{Abusafieh 28} ، اللذان يفصلان أيضا طريقتين أخريين بالإضافة إلى الطريقة الموضحة هنا. وقد لوحظ أن بعض الباحثين يستخدمون أكثر من طريقة واحدة لتحديد إزاحة النظام¹⁷. قد تعرض كل آلة أنماطا ودرجات فريدة من إزاحة النظام عند تطبيق الأحمال عليها. لهذا السبب ، يجب تحديد عامل تصحيح إزاحة النظام لكل آلة ولن يكون هو نفسه بين أي جهازين. على عكس اختبار ضغط عظم العمود الفقري ، لن يتم ملاحظة انخفاض كبير في القوة عند قياس إزاحة النظام لأنه لا توجد مادة بين السطح الزجاجي العلوي والسفلي.

3. تشريح ^{الفقرة القطنية} الخامسة (L5) من جثة الفأر

1. قم بإذابة جثة الفأر المجمدة في درجة حرارة الغرفة ، مع الحرص على الحفاظ على ترطيب الأنسجة الرخوة والعظام عن طريق تطبيق محلول متساوي التوتر بانتظام بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
2. قم بعمل شق صغير (<0.5 سم) في الجلد على خط الوسط الظهري بالقرب من قاعدة الذيل ، ثم قم بتمديد الجرح عبر كل طرف خلفي واسحب برفق لإزالة القشرة من قاعدة الذيل إلى رأس.
3. قطع عضلات جدار البطن حتى يصبح العمود الفقري مرئيا بسهولة.
4. تحت المجهر تشريح ، تصور اثنين من المفاصل العجزي الحرقفي ونهاية الجمجمة من العجز.
5. باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط ، قم بعمل قطع دقيق لفصل الفقرة القطنية الأخيرة (L6) عن نهاية الجمجمة من العجز.
6. مرة أخرى ، قطع بين الفضاء الفقري ، وإزالة L6 و L5 من العمود الفقري ، ووضع جانبا L5 للتحليل (الشكل 3).
7. افحص الفقرة تحت مجهر تشريح وقم بإزالة جميع الأنسجة الرخوة من العظم ، بما في ذلك القرص الفقري ، باستخدام وسادات الشاش في الغالب وبلطف بالملقط عند الضرورة.
   ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم اختيار L5 كفقرة ذات أهمية ، ولكن يمكن اختيار فقرات قطنية أخرى لاختبار الضغط.

4. تحضير سطح تحميل الفقرة L5 لاختبار الضغط أحادي المحور باستخدام طريقة تضمين الأسمنت العظمي PMMA

1. باستخدام عجلة قطع الماس (انظر جدول المواد) المرفقة بأداة دوارة ، قم بعمل قطع في كل عنيق لإزالة العملية المستعرضة والشائكة (الشكل 4). إذا تركت متصلة بالمركز ، يمكن أن تؤدي العمليات الفقرية إلى ملامسات محلية مع الصفائح العلوية / السفلية في العمليات نفسها بدلا من توزيع الحمل في جميع أنحاء المركز.
2. صنفر الطرف الذيلي للفقرة برفق باستخدام ورق صنفرة ناعم 120 حبيبة رملية (انظر جدول المواد) لإزالة جميع الأقراص الفقرية والأنسجة الرخوة والمخالفات.
3. ضع علامة على الطرف الذيلي المصقول بعلامة دائمة لسهولة التعرف عليه لاحقا.
4. امزج الأسمنت العظمي PMMA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
5. مع بقاء الأسمنت العظمي PMMA شبه ناعم ، ضع كمية صغيرة على الطرف القحفي (غير المميز) للفقرة متجهة لأعلى ، مع التأكد من تغطية السطح بالكامل أثناء جلوس الفقرة في حمام ملحي للحفاظ على عينة العظام رطبة وباردة.
6. مع بقاء PMMA شبه ناعم ، ضع الفقرة على السطح الزجاجي السفلي بحيث يكون الجانب الذيلي (الملحوظ) متجها لأسفل (الشكل 5).
7. قم بتشغيل الجهاز لتعشيق تروس محرك الأقراص وخفض السطح الزجاجي العلوي ببطء على مركب الأسمنت العظمي للفقرة + PMMA حتى يتم ملامسة الأسمنت العظمي ويتم تطبيق الحد الأدنى من القوة (<0.5 نيوتن) لتوزيع PMMA بالتساوي على سطح العظم. يمكن تقدير السطح الزجاجي العلوي في وضع محايد على أنه أفقي ، وعند الضغط على PMMA شبه الناعم ، سيؤدي إلى ملء PMMA للتقعر على الطرف القحفي للفقرة وتشكيل سطح أفقي مسطح أسفل السطح الزجاجي العلوي.
8. مع ضغط السطح العلوي برفق على الأسمنت العظمي PMMA ، اترك العينة دون عائق حتى يصلب الأسمنت العظمي PMMA تماما (~ 10 دقائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لأسمنت العظام PMMA المستخدم في هذه الدراسة). احتفظ بالعينة في حمام ملحي أو رشها بالمحلول الملحي بشكل متكرر خلال هذه الفترة للحفاظ على العينة رطبة وباردة.
9. بمجرد أن يصلب الأسمنت العظمي PMMA تماما ، يمكن أن يبدأ اختبار الضغط. اجمع بيانات الحمل (أي القوة) (N) والإزاحة (أي الانحراف) (مم) من المستشعرات إلى جدول بيانات في الوقت الفعلي باستخدام برنامج رقمي مصمم لجمع بيانات الاختبار الميكانيكي (انظر جدول المواد).
10. بعد جمع بيانات خط الأساس لمدة 5 ثوان ، وتطبيقها بقوة تحميل مسبق لا تقل عن <0.5 نيوتن ، ابدأ في خفض السطح الزجاجي العلوي على العينة بسرعة خفض واحدة (أي أحادية التوتر) ومحددة مسبقا لبدء اختبار الضغط (~ 1 مم / دقيقة).
11. توقف عن جمع البيانات بمجرد ملاحظة انخفاض كبير في الحمل (N) ، مما يشير إلى فشل المواد.
    ملاحظة: ستحدد تعليمات الشركة المصنعة وقت التصلب التقريبي لأسمنت العظام PMMA. قد يختلف وقت تصلب الأسمنت العظمي PMMA اعتمادا على نوع الأسمنت العظمي PMMA المستخدم. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحديد وقت الانتظار لتصلب PMMA. ومع ذلك ، كمؤشر على أن الأسمنت العظمي PMMA قد تصلب تماما ، يمكن خلط عينة إضافية من الأسمنت العظمي PMMA في نفس الوقت مع العينة التي سيتم وضعها على الفقرة ولكن يتم الاحتفاظ بها جانبا وفحصها لمعرفة ما إذا كانت لا تزال طرية أو صلبة تماما. إذا تصلب تماما ، يمكن أن يشير ذلك إلى أن PMMA على العظم قد تصلب تماما دون إزعاج مجمع العظام + PMMA. يجب أن تظل عينة العظام رطبة جيدا وباردة طوال فترات تصلب واختبار PMMA. أقل من بضع دقائق من التعرض للهواء الجاف يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الخواص الميكانيكية الحيوية. يستخدم بعض الباحثين آلات اختبار الضغط المجهزة بحمام ملحي¹⁹. لم يكن لآلة اختبار الضغط حمام ملحي في الدراسة الحالية. بدلا من ذلك ، تم تطبيق رذاذ ناعم من المحلول الملحي بانتظام طوال فترة تصلب PMMA وفترة الاختبار.

5. تحليل منحنيات إزاحة الحمل لاختبارات الانضغاط أحادي المحور للفقرة L5

1. انسخ والصق بيانات الحمل (N) والإزاحة المصححة (مم) من جدول البيانات إلى برنامج فني للرسوم البيانية وتحليل البيانات (انظر جدول المواد).
2. قم بإنشاء رسم بياني بالحمل (N) على المحور ص وإزاحة العينة المصححة (_عينة Δx ، مم) على المحور السيني (الشكل 6). افعل ذلك في البرنامج بالنقر أولا على Windows و New Table ، ثم افعل ذلك لإنشاء جدول. انسخ الإزاحة المصححة (مم) وقم بتحميل البيانات (N) من جدول بيانات البيانات الأولية إلى الجدول الجديد.
3. بعد ذلك ، قم بإنشاء شكل موجي لتمثيل البيانات الأولية بالنقر فوق البيانات ، ثم انقر فوق XY Pair to Waveform وحدد بيانات الإزاحة المصححة ل X-Wave وتحميل البيانات ل Y-Wave. تأكد من أن العدد الصحيح لنقاط البيانات موجود في مربع "عدد النقاط" ، وقم بتسمية الشكل الموجي ، ثم انقر فوق Make Waveform. بمجرد إنشاء شكل موجي ، قم بإنشاء رسم بياني بالنقر فوق Windows ، ثم رسم بياني جديد ، ووضع شكل الموجة على المحور Y و "حسابه" على المحور X.
4. استخدم أداة المؤشر لتحديد النقاط / المناطق ذات الأهمية على الرسم البياني للتحليل. تم ذكر عدد قليل من النقاط / المناطق ذات الأهمية لحساب الخواص الميكانيكية الشائعة للعظم الكامل في الخطوات 5.4-5.8 (الشكل 6) ، وتشمل العمل إلى الفشل (N x مم) ، والحمل الأقصى (N) ، والصلابة (N / mm) ، وحمل الخضوع (N) ، وإزاحة ما بعد الخضوع (مم).
5. لحساب الشغل إلى الفشل (N x mm) ، ضع المؤشر (A) في بداية الاختبار والمؤشر (B) عند النقطة التي تسبق فشل المادة مباشرة (أي عند الحد الأقصى للحمل الذي تم الوصول إليه أثناء الاختبار قبل ملاحظة انخفاض كبير في الحمل).
   ملاحظة: وبالتالي ، فإن المؤشرات A-B ستضع بين قوسين كامل الاختبار من عندما تبدأ المادة في تحمل القوى وتخضع للإزاحة إلى النقطة التي تفشل فيها المادة. يمكن قياس الشغل إلى الفشل (N x mm) على أنه المساحة الإجمالية أسفل المنحنى (أي المنطقة الموجودة أسفل المنحنى بين المؤشرين A و B).
6. احسب الحد الأقصى للحمل (N) كأعلى قيمة للحمل الذي يتم ملاحظته أثناء الاختبار (أي الحمل عند المؤشر B).
7. احسب صلابة المادة (N / mm) على أنها ميل المنطقة المرنة الخطية (أي المنحدر بين المؤشرين C و D).
8. حمل الخضوع (N) هو الحمل الذي ينحرف عنده منحنى إزاحة الحمل عن الخطية ويدخل المنطقة البلاستيكية ، وبالتالي يحافظ على تشوه دائم (أي الحمل عند النقطة D). احسب ذلك عن طريق قياس الحمل عند المؤشر D.
9. الإزاحة بعد الخضوع (مم) هي مؤشر على ليونة المادة. قم بقياس هذا على أنه الإزاحة بين نقطة الخضوع ونقطة فشل المواد (أي الإزاحة بين المؤشرين D و B).
   ملاحظة: المعلمات المذكورة أعلاه ليست سوى بعض الخصائص الميكانيكية الشائعة للعظام الكاملة المبلغ عنها. إنها ليست قائمة كاملة بجميع الخصائص الميكانيكية للعظام الكاملة التي يمكن الحصول عليها من منحنى إزاحة الحمل. تشمل معلمات الخصائص الميكانيكية الأخرى للعظم الكامل الإزاحة الكلية (مم) ، والطاقة المرنة الممتصة (N x mm) ، والإزاحة المرنة (mm) ، والطاقة البلاستيكية الممتصة (N x mm) ، وإزاحة البلاستيك (mm) ، على سبيل المثال لا الحصر. علاوة على ذلك ، لم يتم سرد الخصائص الميكانيكية للعظام على مستوى الأنسجة. تتطلب هذه تحويلات البيانات باستخدام قياسات تشريحية محددة ، مثل قطر العظام. تم سرد مثال التعليمات البرمجية لإجراء القياسات من منحنى إزاحة الحمل في البرنامج في الملف التكميلي 1.

باستخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة الذي يستخدم تضمين سطح التحميل L5 وآلة ثني / آلة اختبار ضغط ثلاثية النقاط قابلة للتحويل ، من الممكن إجراء اختبار ضغط على فقرة أسفل الظهر للفأر لإجراء مقارنات بين المجموعات. تم إعداد ما مجموعه أربعة وعشرون فقرة فأر L5 باستخدام طريقة التضمين. غير أن ثلاثا من العينات تضررت أثناء إزالة عمليات العمود الفقري باستخدام عجلة قطع الماس على أداة دوارة، وبالتالي لم تختبر. بالنظر إلى ذلك ، تم الحصول على الخواص الميكانيكية المدرجة بنجاح من إحدى وعشرين عينة من أصل أربع وعشرين عينة باستخدام طريقة التضمين. تم فحص العينات بصريا بعد كل اختبار ، ولم يتعرض غطاء PMMA لأي ضرر في أي من الاختبارات. كما لوحظ ، كانت الفئران المستخدمة في الدراسة الحالية جزءا من دراسة أكبر تهدف إلى تحديد آثار بذور القنب الغذائية على عظام إناث الفئران الصغيرة والمتنامية C57BL / 6. يتم تقديم إحصائيات وصفية لخمسة خواص ميكانيكية للعظام الكاملة يتم الإبلاغ عنها بشكل شائع في الجدول 1. يتم توفير منحنيات إزاحة الحمل لجميع العينات الإحدى والعشرين في الشكل 7.

الشكل 1: تحويل آلة ثني ثلاثية النقاط إلى آلة اختبار ضغط. (أ) الآلة مجهزة تجهيزا كاملا للعمل كآلة ثني ثلاثية النقاط مع مستشعر الإزاحة ومستشعر الحمل المشار إليه (الأسهم البيضاء). (ب) الماكينة بعد إزالة العارضة العرضية. ( ج) وضع الماكينة بعد وضع السطح الزجاجي العلوي ذاتي المحاذاة حيث تم وضع العارضة المتقاطعة مسبقا. د: عوارض الدعم السفلية بها ثقوب محفورة فيها. (ه) السطح الزجاجي السفلي المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ مع أربعة ثقوب ملولبة مثبتة فيه ، وبرغي مشدود جزئيا في أحد الفتحات. الفتحتان الأخريان اللتان لم تشاهدا في الصورة موجودتان على الجانب الآخر. (F) عوارض الدعم السفلية مع السطح الزجاجي السفلي متصلة بها بأربعة براغي سداسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مثال على إزاحة النظام (آلة Δx) مقابل مخطط الحمل المزود بانحدار خطي (A) ولوغاريتمي (B) وكثير حدود من الدرجة الثانية (C) وكثير حدود من الدرجة الثالثة (D). في هذا المثال ، يوفر كثير الحدود من الدرجة الثالثة أفضل ملاءمة لكل قيمة R2 ، ويتم استخدام انحداره كعامل تصحيح إزاحة النظام. تمثل الصور بيانات نموذجية لإثبات ملاءمة الانحدار وستحتاج إلى الحصول عليها من قبل الباحثين للآلات الفردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: العمود الفقري القطني للفأر. عمود فقري قطني للفأر تحت مجهر تشريح قبل إزالة L6 (A) ، وبعد إزالة L6 ، تاركا L5 متصلا (B). ستتم إزالة L5 لاحقا وإعداده لاختبار الضغط. العصابات ذات اللون الأبيض هي الأقراص الفقرية التي تم تشريحها وإزالتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تشريح الفقرة L5. فقرة تمثيلية للفأر L5 في مناظر الجمجمة والذيلية والظهرية والبطنية تحت مجهر تشريح. تشمل الأبعاد المهمة للجسم الفقري الطول والعرض الظهري البطني والعرض الجانبي ، كما هو موضح في الخطوط الملونة. تظهر الخطوط المتقطعة السوداء تقريبا مكان إجراء التخفيضات لإزالة العمليات الفقرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: فترة تصلب الأسمنت العظمي PMMA. مثال L5 فقرة مع الأسمنت العظمي PMMA (الأخضر) وضعت على نهاية الجمجمة وخفض الصوانى العلوي على الأسمنت العظمي PMMA + مجمع العظام. بمجرد أن يصلب الأسمنت العظمي PMMA بالكامل ، سيبدأ اختبار الضغط. سيتم خفض السطح الزجاجي العلوي بشكل أكبر حتى يتم ملاحظة فشل المادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: منحنى إزاحة الحمل لاختبار ضغط عظم العمود الفقري للفأر وتحليل البيانات. يشير المؤشر A إلى بداية اختبار الضغط. يشير المؤشر B إلى نقطة فشل المواد. يشير المؤشر C إلى بداية المنطقة المرنة الخطية ، بينما يشير المؤشر D إلى النهاية (أي نقطة الخضوع). المنطقة المظللة باللون الرمادي الفاتح هي المنطقة المرنة الخطية ، حيث ستعود المادة إلى شكلها الأصلي إذا تمت إزالة الحمل. المنطقة المظللة باللون الرمادي الداكن هي المنطقة البلاستيكية ، حيث تعرضت المادة لتشوه دائم ولن تعود إلى شكلها الأصلي إذا تمت إزالة الحمل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: منحنيات إزاحة الحمل لجميع عينات العظام الإحدى والعشرين. تنوعت الأنماط بين العظام. بشكل عام ، كان التباين الأكبر في الإزاحة اللاحقة للخضوع ، حيث كان عدد قليل (ن = 5) من العظام لديه إزاحة صغيرة نسبيا بعد الخضوع والبعض الآخر (ن = 16) لديه إزاحة كبيرة نسبيا بعد العائد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: القيم التمثيلية للخواص الميكانيكية للعظام الكاملة المبلغ عنها بشكل شائع والتي تم الحصول عليها باستخدام طريقة تضمين تحضير سطح التحميل. تم الحصول على القيم باستخدام جميع البروتوكولات المفصلة في هذه الدراسة. وبالتالي ، فإن القيم تمثل تلك التي يمكن الحصول عليها باستخدام الطرق الموضحة هنا. القيم هي وسائل ± SEM. تمثل المجموعات إناث الفئران C57BL / 6 التي تتغذى على نظام غذائي غني ببذور القنب الكاملة بتركيزات 0٪ (CON) ، أو 50 جم / كجم (5٪) (5HS) ، أو 150 جم / كجم (15HS) من سن 5-29 أسبوعا. بالنسبة لإحدى المعلمات (العمل إلى الفشل) ، يبدو أن النظام الغذائي أثر على القيم لكل ANOVA أحادي الاتجاه (p < 0.05). لا تختلف القيم التي تشترك في نفس الحرف المرتفع اختلافا كبيرا (p > 0.05) ، في حين أن القيم ذات الحروف الفوقية المختلفة تختلف اختلافا كبيرا (p < 0.05) ، لكل تحليل لاحق ل Tukey-Kramer.

الملف التكميلي 1: مثال على رمز للحصول على الخواص الميكانيكية للعظام الكاملة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.