Method Article

تحديد الببتيدات للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الضامة المشتقة من نخاع العظام

DOI:

10.3791/65521

⸱

June 30th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, 3School of Life Sciences, Hebei University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراء لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن الضامة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي واستخراج الببتيدوم لتحديده بواسطة مطياف الكتلة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما يتم إفراز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) عن طريق الإخراج الخلوي للأجسام متعددة الحويصلات (MVBs). هذه الحويصلات النانوية التي يبلغ قطرها <200 نانومتر موجودة في سوائل الجسم المختلفة. تنظم هذه الخلايا الجذعية عمليات بيولوجية مختلفة مثل نسخ الجينات وترجمتها ، وتكاثر الخلايا وبقائها ، والمناعة والالتهابات من خلال شحناتها ، مثل البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي والمستقلبات. حاليا ، تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل sEVs. من بينها ، تعتبر الطريقة القائمة على الطرد المركزي الفائق المعيار الذهبي وتستخدم على نطاق واسع لعزل sEVs. الببتيدات هي جزيئات حيوية بشكل طبيعي مع أقل من 50 من الأحماض الأمينية في الطول. تشارك هذه الببتيدات في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ذات النشاط البيولوجي ، مثل الهرمونات والناقلات العصبية وعوامل نمو الخلايا. يهدف الببتيدوم إلى التحليل المنهجي للببتيدات الداخلية في عينات بيولوجية محددة بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS). هنا ، قدمنا بروتوكولا لعزل sEVs عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي واستخلصنا الببتيدوم لتحديد الهوية بواسطة LC-MS / MS. حددت هذه الطريقة المئات من الببتيدات المشتقة من sEVs من الضامة المشتقة من نخاع العظام.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد حويصلات صغيرة خارج الخلية (sEVs) بقطر أقل من 200 نانومتر في جميع أنواع سوائل الجسم تقريبا وتفرزها جميع أنواع الخلايا ، بما في ذلك البول والعرق والدموع والسائل النخاعيوالسائل الأمنيوسي 1. في البداية ، تم اعتبار sEVs كأوعية للتخلص من النفايات الخلوية ، مما أدى إلى الحد الأدنى من البحث في العقداللاحق 2. في الآونة الأخيرة ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن sEVs تحتوي على بروتينات محددة ، ودهون ، وأحماض نووية ، ومستقلبات أخرى. يتم نقل هذه الجزيئات إلى الخلايا المستهدفة3 ، مما يساهم في التواصل بين الخلايا ، والتي من خلالها يشاركون في العمليات البيولوجية المختلفة ، مثل إصلاح الأنسجة ، وتكوين الأوعية الد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الطرد المركزي في الخطوات 1.1-1.11 عند 4 درجات مئوية.

  1. تحضير مصل بقري جنيني خال من المركبات الكهربائية (FBS): أجهزة الطرد المركزي FBS طوال الليل عند 110000 × جم عند 4 درجات مئوية من خلال جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) لإزالة المركبات الكهربائية ذاتية المنشأ. اجمع المادة الطافية ، وقم بتعقيمها بغشاء ترشيح فائق 0.2 ميكرومتر ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. لوحة حوالي 3 × 107 البلاعم المشتقة من نخاع العظم (iBMDMs) على طبق استزراع 150 مم وإضافة 20 مل من وسط زراعة DMEM (انظر جدول المواد

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة ل sEVs المعزولة بواسطة الطرد المركزي الفائق التفاضلي (الشكل 1) ، قمنا بتقييم مورفولوجيتها وتوزيع حجم الجسيمات وعلامات البروتين وفقا للجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV)17.

أولا ، لوحظ مورفولوجيا sEVs بواسطة TEM ، مما يدل على بنية نموذجية تشبه الكوب (الشكل 2 أ). أظهرت NTA أن sEVs المعزولة كانت مركزة في الغالب عند 136 نانومتر (الشكل 2B) ، وهو ما يتوافق مع الحجم المبلغ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند التحقيق في وظيفة sEVs ، من الضروري الحصول على sEVs عالية النقاء من العينات البيولوجية المعقدة لتجنب أي تلوث محتمل. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لعزل sEVs13 ، ومن بين هذه الطرق ، أظهرت الطرق التفاضلية القائمة على الطرد المركزي الفائق نقاء عاليا نسبيا للمركبات الكهربائية الكهربائية. في هذه الدراسة ، تم جمع 200 مل من طافات الخلايا لمدة 6 ساعات ، وتم الحصول على حوالي 200-300 ميكروغرام من sEVs عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن حبيبات sEVs قد لا تكون مرئية أثناء الطرد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (3157270). نشكر الدكتور فنغ شاو (المعهد الوطني للعلوم البيولوجية ، الصين) على توفير iBMDM.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجموعة فحص البروتين BCABeyotime TechnologyP0012
CD9Beyotime TechnologyAF1192
أنبوب مرشح الطرد المركزيMilliporeUFC5010BK
زجاجات الطرد المركزي البولي بروبيلينبيكمان كولتر357003طرد مركزي عالي السرعة
ركيزةThermo Fisher Scientific34580
DithiothreitolSolarbioD8220100 g
DMEM ثقافة متوسطةCell WorldN؟ تقنية
إشارات الخليةGRP9420292
جهاز طرد مركزي عالي السرعةبيكمان كولترأفانتي JXN-26دوار الطرد المركزي (JA-25.50)
البلاعم الخلودة المشتقة من نخاع العظام (iBMDM)المعهد الوطني للعلوم البيولوجية ، الصينمقدمة من الدكتور فنغ شاو (المعهد الوطني للعلوم البيولوجية ، الصين)
اليودوأسيتاميدSigmal11495 جرام
أنبوب ميكرو فوج بولي بروبيلينبيكمان كولتر3574481.5 مل ، جهاز طرد مركزي فائق منضدية   ؛
نظام LC نانوي عالي الأداءThermo Fisher ScientificEASY-nLC 1000
تحليل تتبع الجسيمات النانوية Malvern PanalyticalNanoSight LM10NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X مطياف الكتلةThermo Fisher ScientificN / A
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتSolarbioP1020
أنابيب الطرد المركزي Polyallomerبيكمان كولتر326823مثبط
الطرد المركزي البروتيازBimakeB14002
مكثف الفراغ SpeedVacمكثف Eppendorfبالإضافة إلى
جهاز طرد مركزي فائق المنضديةBeckman CoulterOptima MAX-XPدوار الطرد المركزي الفائق (TLA 55)
مجهر إلكتروني ناقل الحركةهيتاشيH-7650B
TSG101SigmaAF8258
جهاز طرد مركزي فائقبيكمان كولترأوبتيما XPN-100دوار الطرد المركزي الفائق (SW32 Ti)
تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتيةScientzSCIENTZ-IID
Western Blot imagerBio-RadChemiDocXRsImage lab 4.0 (beta 7)
& beta ؛ -actinSigmaA3853
جهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  3. Mathieu, M., Marti....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesBone Marrow MacrophagesDifferential UltracentrifugationPeptidome AnalysisLC MS MSVesicle IsolationIntercellular CommunicationInnate ImmunityAntimicrobial PeptidesVesicle Cargo

Related Articles