هنا ، نناقش سير العمل لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير أدمغة الزرع الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر الثالثة لمراقبة الديناميكيات الخلوية ودون الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تخضع الخلايا الجذعية العصبية ذبابة الفاكهة (الخلايا العصبية ، NBs فيما بعد) لانقسامات غير متماثلة ، مما يؤدي إلى تجديد الخلايا العصبية ذاتية التجديد ، بينما تشكل أيضا خلية أم متمايزة (GMC) ، والتي ستخضع لتقسيم إضافي واحد ليؤدي إلى ظهور خليتين عصبيتين أو دبقية. كشفت الدراسات في NBs عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء قطبية الخلية ، واتجاه المغزل ، والتجديد الذاتي للخلايا الجذعية العصبية ، والتمايز. يمكن ملاحظة هذه الانقسامات الخلوية غير المتماثلة بسهولة عن طريق تصوير الخلايا الحية ، مما يجعل اليرقات NBs مناسبة بشكل مثالي للتحقيق في الديناميات الزمانية المكانية لانقسام الخلايا غير المتماثل في الأنسجة الحية. عند تشريحها وتصويرها بشكل صحيح في وسط مكمل بالمغذيات ، تنقسم NBs في أدمغة الزرع بقوة لمدة 12-20 ساعة. الأساليب الموصوفة سابقا صعبة تقنيا وقد تشكل تحديا لأولئك الجدد في هذا المجال. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير نباتات دماغ اليرقات الحية الثالثة باستخدام مكملات الجسم الدهنية. كما تتم مناقشة المشاكل المحتملة ، ويتم تقديم أمثلة لكيفية استخدام هذه التقنية.
المقدمة
انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) هو العملية التي يتم من خلالها تقسيم المكونات تحت الخلوية مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات والعضيات بشكل غير متساو بين الخلايا الوليدة 1,2. تظهر هذه العملية بشكل شائع في الخلايا الجذعية ، التي تخضع ل ACD لتؤدي إلى ظهور خلايا ابنة ذات مصائر تنموية مختلفة. ذبابة الفاكهة تنقسم NBs بشكل غير متماثل لإنتاج NB واحد ، والذي يحتفظ بجذعه ، وخلية أم واحدة (GMC). يخضع GMC لمزيد من الانقسامات لإنتاج الخلايا العصبية المتمايزة أو الدبقية3. NBs المقسمة بشكل غير متماثل وفيرة في الأدمغة النامية لليرقات الثالثة ، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق الفحص المجهري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يوضح الشكل 1 المواد المطلوبة لإجراء هذه الدراسة.
1. الاعتبارات والاستعدادات للتجربة
- منع اليرقات من الاكتظاظ.
ملاحظة: ترتبط جودة أدمغة اليرقات المزروعة ارتباطا مباشرا بصحة وجودة اليرقات قبل التشريح. اليرقات التي تعاني من سوء التغذية من الاكتظاظ ستنتج عموما أدمغة أقل جودة30.- تأكد من عدم وجود أكثر من 20-30 يرقة لكل طبق غطاء وجبة لتجنب سوء التغذية. يمكن رؤية أمثلة على ذلك في الشكل 2.
- تصفية و aliquot شنايدر المتوسطة قبل الاستخدام.
- لكل تشريح ، قم بإعداد وسط تصوير وتشريح جديد عن طريق استكمال ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تشريح وتصوير الفص الدماغي المركزي NBs معبرا عن الدبابيس::EGFP والكرز::كوكب المشتري
لعرض هذا البروتوكول ، اليرقات التي تعبر عن الكرز الذي يحركه UAS :: كوكب المشتري13 والمسمى داخليا الدبابيس :: EGFP16 (w ؛ worGal4 ، UAS-cherry :: jupiter / CyO ؛ تم تصوير الدبابيس :: EGFP / TM6B ، Tb) لمدة 4 ساعات باستخدام البروتوكول الموصوف باستخدام شرائح تصوير متعددة الآبار (الشكل 5C ، D). تم أخذ بيانات إضافية من اليرقات التي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يحدد هذا البروتوكول نهجا واحدا لتصوير أدمغة النباتات الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر . يسمح البروتوكول الموصوف هنا بمراقبة أدمغة الزرع لمدة 12-20 ساعة في ظل الظروف التجريبية المناسبة. يجب إيلاء اهتمام خاص لإعداد العينات وتصميم التجارب المطلوبة. كما ذكر أعلاه ، فإن أحد أهم العوامل التي تحدد جودة الأنسجة المشرحة هو صحة اليرقات. لتحقيق أعلى جودة ممكنة ، يجب على المرء التأكد من تغذية اليرقات جيدا قبل التجميع. تنشأ اليرقات غير الصحية بشكل شائع من الاكتظاظ. لمعالجة هذا الأمر ، يجب على المرء التأكد من تقليل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ أي إفصاحات مالية يعلنونها.
شكر وتقدير
يتم دعم هذا البحث من قبل R35GM148160 (C. C.) ومنحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (NIH) T32 GM007270 (R. C. S)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.22 وميكرو ؛ m polyethersulfone (PES) غشاء | Genesee | 25-231 | مرشحات مدفوعة بالفراغ |
| Agar | Genesee | 20-248 | حبيبات أجار |
| الكمبيوتر التحليلي | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU مع معالجين 3.80 جيجاهرتز يعملان بنظام التشغيل Windows 10 على نظام تشغيل 64 بت |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| شرائح التصوير | ذات الغرفIbidi | 80826 | |
| المجهر متحد البؤر | نيكون | NA | |
| شريحة معدنية تشكيلها حسب الطلب | NA | NA انظر Cabernard and Doe 2013 (المرجع 34) للمواصفات | |
| أطباق التشريح | Fisher Scientific | 5024343 | آبار من البورسلين لوحة بقعة صغيرة |
| ملقط ملقط | World Precision Instruments | Dumont # 5 | |
| مجهر تشريح | Leica | NA | |
| مقص تشريح | أدوات العلوم الدقيقة (FST) | 15003-08 | |
| قفص جمع الأجنة | Genesee | 59-100 | |
| Flypad مع إمكانية الوصول إلى CO2 لتخدير الذباب البالغ | Genesee | 59-172 | |
| غشاء نفاذية للغاز | YSI | 98095 | زجاجي غشاء نفاذي للغاز |
| شرائح | علوم المجهر الإلكتروني | 72204-03 | # 1.5 ؛ 22 مم × 40 مم غطاء زجاجي |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | البدائل: فيجي ، Volocity ، Aivia |
| Imaris محول الملفات | Oxford Instruments | NA | |
| الخميرة الفورية | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| طبق بتري | Greiner Bio-One | 628161 | 60 مم × 15 مم طبق بتري |
| فازلين | NA | ||
| شنايدر وسط حشرات مع L-جلوتامين وبيكربونات الصوديوم السائل | Millipore Sigma | S0146 | |
| برنامج اقتناء SlideBook | 3i | NA | |
| وحدة ترشيح مدفوعة بالفراغ مع 0.22 & micro ؛ ومايكرو. م مرشح غشاء PES | جينيسي العلمي ، GenClone | 25-231 |
المراجع
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
