هنا ، نصف طريقة لتغيير التعبيرات الجينية بشكل انتقائي في الضفيرة المشيمية مع تجنب أي تأثير في مناطق الدماغ الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ضربة قاضية مستهدفة للجينات في الضفيرة المشيمية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعمل الضفيرة المشيمية (ChP) كبوابة حرجة لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. أظهرت الأبحاث الحديثة أن تنظيم نشاط ChP قد يوفر الحماية ضد اضطرابات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن دراسة الوظيفة البيولوجية ل ChP دون التأثير على مناطق الدماغ الأخرى أمر صعب بسبب هيكله الدقيق. تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لضربة قاضية للجينات في أنسجة ChP باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) أو بروتين إعادة التركيب الدائري (Cre) الذي يتكون من تسلسل TAT (CRE-TAT). تظهر النتائج أنه بعد حقن AAV أو CRE-TAT في البطين الجانبي ، كان التألق يتركز حصريا في ChP. باستخدام هذا النهج ، نجحت الدراسة في إسقاط مستقبل الأدينوزين A 2A (A2A R) في ChP باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أو Cre / locus لأنظمة X-overP1 (Cre / LoxP) ، وأظهرت أن هذه الضربة القاضية يمكن أن تخفف من أمراض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE). قد يكون لهذه التقنية آثار مهمة على الأبحاث المستقبلية حول دور ChP في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
المقدمة
غالبا ما كان يعتقد أن الضفيرة المشيمية (ChP) تساعد في الحفاظ على التوازن الوظيفي للدماغ عن طريق إفراز السائل النخاعي (CSF) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) 1,2. كشفت الأبحاث المتزايدة على مدى العقود الثلاثة الماضية أن ChP يمثل مسارا متميزا لتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS).
تحافظ الوصلات الضيقة (TJs) ل ChP ، المكونة من ظهارة ChP أحادية الطبقة ، على التوازن المناعي عن طريق منع الجزيئات الكبيرة والخلايا المناعية من دخول الدماغ3. ومع ذلك ، في ظل ظروف مرضية معينة ، يكتشف نسيج ChP ويستجيب للأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر (DAMPs) ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ونتشو الطبية.
1. الحيوانات
- شراء ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ويزن 20-22 جم.
- احصل على خط الفأر Rosa-LSL المعدل وراثيا (Lox-StoP-Lox) -tdTomato (Ai9) ، وذكور الفئرانA 2AR flox/ flox .
- قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين والمنزل في أقفاص ، بحد أقصى خمسة فئران لكل قفص ، تحت دورة مظلمة قياسية مدتها 12 ساعة / 12 ساعة لمدة أسبوع واحد.
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ضربة قاضية A2AR خاصة ب ChP عن طريق حقن ICV ل AAV2 / 5-shRNA أو CRE-TAT
لا يزال دور A2AR في ChP كمنظم قوي للمعلومات العصبية في التسبب في EAE غير واضح. يمكن أن يؤدي هدم تعبير A 2A R الخاص ب ChP إلى إلقاء الضوء على التأثيرات التنظيمية A2AR على الجهاز المناعي المركزي في EAE والتهابات الجهاز العصبي الأخرى. استخدمت هذه الدراسة حقن ICV من CRE-TAT لتقليل تعبيرA2A R في ChP للفئرانA 2AR flox/ flox. لضمان خصوصية ChP ، قمنا أولا بحقن CRE.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قدم البحث نهجين متميزين للضربة القاضية المستهدفة لجينات ChP. تضمن النهج الأول حقن ICV ل CRE-TAT ، الذي يحتوي على Cre recombinase ، في الفئرانA 2AR flox/ flox. أما النهج الثاني فينطوي على حقن القيمة المحلية ل AAV2/5 الذي يحمل الحمض النووي الريبوزي الريبي منA 2AR. من خلال استخدام هاتين الاستراتيجيتين ، حقق العمل ضربة قاضية انتقائية ل A 2A R داخل ChP وكان قادرا على إظهار الآثار الوقائية لتثبيط إشاراتA 2AR في ChP على أمراض EAE. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يتضمن خ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويذكر صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة أو إفصاحات أخرى يعلنان عنها.
شكر وتقدير
ونعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31800903، الممنوحة ل W. Zheng) ومشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم Y2020426، الذي منح إلى Y. Y. Weng) لهذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| A2A< / sub>Rflox / flox< / sup> | مختبر الدولة الرئيسي للفئران لطب العيون والبصريات والعلوم البصرية ، جامعة | ||
| AAV2 / 5-A2A< / sub>R-ShRNA | virus Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| مضاد للتلاشي تصاعد متوسط | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| زجاج البورسليكات الشعري | بكين Meiyaxian التكنولوجيا المحدودة | B100-50-10 | |
| جهاز الدماغ التجسيمي | RWD ، شنتشن | 69100 | |
| C57BL / 6 الفئران | بكين فيتال تشارلز ريفر مختبر شركة | ||
| CRE-TAT إعادة التركيب | ميليبور | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| آلة التقطيع المجمدة | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson وشركاه | 231141 | |
| حقنة هاميلتون | هاميلتون ، الأمريكية | P / N: ؛ 86259 | |
| غير مكتمل Freunds مساعد | Sigma | F5506 | |
| مجهر ليزر متحد البؤر | Zeiss | LSM900 | |
| MOG 35-55< / sub> | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co.، LTD | 4010006243 | |
| OCT الغراء | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| بندقية بنتوباربيتال الصوديوم | Boyun Biotech | PC13003 | |
| ماصة | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis | Kit Takara | 6110A | |
| نظام PCR في الوقت الحقيقي | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox) -tdفئران الطماطم | مختبر | ||
| السكروز | سانجون Biotech | A502792-0500 | |
| الخالط فائق السرعة | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| محلول | الزيلينشركة الكاشف الكيميائي تشنغدو كيلونج | 1330-20-7 |
المراجع
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
