يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة الديدان الخيطية على نطاق واسع لدراسة سلوكياتها الجماعية

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65569

⸱

أغسطس 25, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Faculty of Design, Kyushu University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، تم الإبلاغ عن نظام لدراسة السلوكيات الجماعية للديدان الخيطية عن طريق استزراعها بكميات كبيرة باستخدام وسط أجار طعام. يسمح هذا النظام للباحثين بنشر أعداد كبيرة من ديدان dauer ويمكن تطبيقه على Caenorhabditis elegans والأنواع الأخرى ذات الصلة.

الملخص

تظهر سلوكيات جماعية ديناميكية ، كما لوحظ في أسراب الطيور ، ومجموعات الأسماك ، وحشود البشر. تم التحقيق في السلوكيات الجماعية للحيوانات في مجالات كل من علم الأحياء والفيزياء. في المختبر ، استخدم الباحثون نموذجية مختلفة مثل ذبابة الفاكهة وسمك الزرد لما يقرب من قرن من الزمان ، ولكن ظل تحديا كبيرا لدراسة السلوك الجماعي المعقد على نطاق واسع الذي تنظمه هذه النموذجية القابلة للتتبع وراثيا. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء نظام تجريبي للسلوكيات الجماعية في Caenorhabditis elegans. تتسلق الديدان المنتشرة على غطاء صفيحة بتري وتظهر سلوك جماعي للحشد. يتحكم النظام أيضا في تفاعلات الدودة وسلوكياتها عن طريق تغيير الرطوبة وتحفيز الضوء. يسمح لنا هذا النظام بفحص الآليات الكامنة وراء السلوكيات الجماعية من خلال تغيير الظروف البيئية وفحص آثار الحركة على المستوى الفردي على السلوكيات الجماعية باستخدام المسوخ. وبالتالي ، فإن النظام مفيد للبحث المستقبلي في كل من الفيزياء والبيولوجيا.

المقدمة

كل من غير العلماء والعلماء مفتونون بالسلوكيات الجماعية للحيوانات ، كما هو الحال في أسراب الطيور ومجموعات الأسماك. تم تحليل السلوكيات الجماعية في مجموعة واسعة من المجالات ، بما في ذلك الفيزياء والبيولوجيا والرياضيات والروبوتات. على وجه الخصوص ، تعد فيزياء المادة النشطة مجالا بحثيا متناميا يركز على الأنظمة المكونة من عناصر ذاتية الدفع ، أي الأنظمة المبددة ، مثل أسراب الطيور ، ومجموعات الأسماك ، والأغشية الحيوية للبكتيريا المتحركة ، والهياكل الخلوية المكونة من جزيئات نشطة ، ومجموعات من الغرويات ذاتية الدفع. تؤكد نظرية فيزياء المادة الفعالة أنه مهما كانت سلوكيات الأفراد معقدة ، فإن الحركات الجماعية لأعداد هائلة من الكائنات الحية يحكمها عدد صغير من القواعد البسيطة. على سبيل المثال ، يتنبأ نموذج Vicsek ، وهو مرشح لوصف موحد للحركة الجماعية للجسيمات ذاتية الدفع ، بأن تفاعل المحاذاة قصير المدى للأجسام المتحركة مطلوب لتشكيل مرحلة مرتبة طويلة المدى مع تذبذب غريب الأطوار في 2D ، كما هو الحال في قطعان1. تتطور الأساليب التجريبية من أعلى إلى أسفل المتعلقة بفيزياء المادة الفعالة بسرعة. أكدت التجارب السابقة تشكيل مرحلة مرتبة بعيدة المدى في الإشريكية القولونية2. استخدمت أعمال حديثة أخرى الخلايا 3,4 ، البكتيريا5 ، الغرويات المتحركة6 ، أو البروتينات المتحركة 7,8. وصفت النماذج البسيطة البسيطة مثل نموذج Vicsek بنجاح هذه الظواهر الحقيقية. على النقيض من هذه الأنظمة التجريبية أحادية الخلية ، عادة ما يتم ملاحظة السلوكيات الجماعية للحيوانات في البرية ، حيث لا يمكن لأحد أن يأمل في إجراء تجارب خاضعة للرقابة مع 10000 طائر أو سمكة حقيقية.

يشترك علماء الأحياء في نفس الاهتمام مع الفيزيائيين: كيف يتفاعل الأفراد مع بعضهم البعض ويتصرفون وظيفيا كمجموعة. أحد مجالات البحث التقليدية لتحليل السلوك الفردي هو علم الأعصاب ، حيث تم فحص الآليات الكامنة وراء السلوك على المستويين العصبي والجزيئي. تم تطوير العديد من الأساليب العلمية العصبية من أسفل إلى أعلى حتى الآن. يمكن تسهيل النهج من أعلى إلى أسفل في الفيزياء والنهج من أسفل إلى أعلى في علم الأحياء باستخدام نموذجية مثل ذبابة الفاكهة ، والدودة Caenorhabditis elegans ، والفأر9. ومع ذلك ، كانت هناك نتائج قليلة حول السلوك الجماعي واسع النطاق لهذه النموذجية في المختبر10. لا يزال من الصعب إعداد نموذجية قابلة للتتبع وراثيا على نطاق واسع في المختبر. لذلك ، في الأبحاث الحالية حول السلوكيات الجماعية في علم الأحياء والفيزياء ، كان من الصعب على العلماء الذين يجرون عادة أبحاثا في المختبر دراسة السلوكيات الجماعية للحيوانات.

في هذه الدراسة ، أنشأنا طريقة لزراعة الديدان الخيطية على نطاق واسع لدراسة سلوكياتها الجماعية. يسمح لنا هذا النظام بتغيير الظروف البيئية وفحص تأثير الحركة على المستوى الفردي على السلوكيات الجماعية باستخدام الطفرات10. في فيزياء المادة الفعالة ، يمكن التحكم في معلمات النموذج الرياضي في كل من التجارب والمحاكاة ، مما يتيح التحقق من هذا النموذج لتحديد الأوصاف الموحدة. يستخدم علم الوراثة لفهم آلية الدائرة العصبية الكامنة وراء السلوك الجماعي11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير الديدان

ملاحظة: قم بإعداد سلالة N2 Bristol من النوع البري12 وسلالة ZX899 (lite-1 (ce314) ؛ ljIs123 [mec-4p::ChR2 ، unc-122p :: RFP])13 لمراقبة السلوكيات الجماعية والتجارب البصرية الجينية ، على التوالي. حافظ على سلالة ZX899 في ظل الظروف المظلمة.

  1. قم بإيداع أربع ديدان بالغة جيدة التغذية على صفيحة 60 مم تحتوي على 14 مل من وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) مع أجار وبذرها بالإشريكية القولونية OP5012.
  2. تنمو ديدان F1 إلى الجوع في لوحة NGM عند 23 درجة مئوية لمدة 7 أيام. يبلغ إنتاج ديدان F1 حوالي 100 دودة / صفيحة في هذه المرحلة. تتكون مراحل الديدان من مجموعة مختلطة من يرقات dauer و L1 الجائعة.

2. إعداد لوحات أجار طعام (DFA) المتوسطة

  1. الأوتوكلاف زجاجة زجاجية تحتوي على 2 غرام من مسحوق طعام و 5 مل من وسط أجار 1٪ وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يمكن استخدام أطعمة الأخرى من مختلف الصانعين في هذه التجربة.

3. تلقيح الديدان إلى لوحات متوسطة DFA

  1. نقل كميات صغيرة (حوالي 0.5 غرام) من وسط DFA إلى وسط صفيحة NGM المصنفة بالإشريكية القولونية OP50 (الشكل 1B). للتجارب البصرية الوراثية ، صب 40 ميكرولتر من 50 ميكرومتر عبر شبكية العين بالكامل ، العامل المساعد لقناة رودوبسين 2 ، على DFA قبل تلقيح الديدان.
  2. اجمع الديدان الجائعة من أربع لوحات NGM باستخدام الماء المعقم.
  3. ضع جزءا صغيرا من طعام (حوالي 0.5 جم) على وسط DFA ، على بعد حوالي 2 مم من غطاء اللوحة.
  4. قم بإضاءة لوحة NGM بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة داخل مقعد نظيف لمنع التلوث.
  5. تلقيح الديدان المجمعة (حوالي 400 دودة) على وسط DFA على ألواح NGM. لا تغلق اللوحة بالبارافيلم لتجنب زيادة الرطوبة داخل صفيحة بتري وتوليد قطرات الماء التي تحبس الديدان على الغطاء.
  6. انشر الديدان عند 23 درجة مئوية واسمح لها بالصعود إلى غطاء اللوحة لمدة 10-14 يوما تقريبا.
    ملاحظة: نظرا لأن عدد الديدان الموجودة على الأغطية بالكاد زاد بعد 10-14 يوما ، فقد افترض أن الديدان قد نفدت من الطعام على الأرجح.

4. مراقبة السلوك الجماعي

  1. في يوم التجربة ، ضع صفيحة NGM جديدة لا تحتوي على E. coli ووسط أجار طعام على صفيحة من الألومنيوم على مرحلة مجهر التكبير الكلي (الشكل 2A). احتفظ بالجزء السفلي من لوحة NGM الجديدة عند 23 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم في درجة الحرارة من بلتيير لمدة 5 دقائق على الأقل (الشكل 2B). بعد ذلك ، استبدل غطاء لوحة NGM الجديدة بغطاء اللوحة التي صعدت إليها الديدان. استخدم العدسة الموضوعية (x2 ، NA = 0.5) كهدف تكبير منخفض (الشكل 2A).
  2. قم بزيادة درجة حرارة الجزء السفلي من لوحة بتري من 23 درجة مئوية إلى 26 درجة مئوية لتغيير الرطوبة داخل تلك اللوحة (الشكل 2).
  3. احصل على صور للسطح الداخلي لغطاء اللوحة باستخدام الكاميرا بمعدل 20 إطارا s−1 (الفيديو التكميلي S1).
  4. احفظ الصور التي تم الحصول عليها بتنسيق ملف الصورة الموسومة.

5. تجربة البصريات الوراثية

  1. استخدم مصباح زئبقي بقدرة 100 وات لتوصيل ضوء أزرق ، يتم ترشيحه باستخدام مجموعة مرشحات. تحكم في وقت الإضاءة بدقة باستخدام نظام الغالق الكهرومغناطيسي (الشكل 2 ب).
  2. حافظ على ZX899 على DFA في ظل هذه الظروف لمدة 5 دقائق قبل إضاءة الضوء الأزرق.
  3. قم بإضاءة ديدان ZX899 المتصلة بغطاء صفيحة بتري على مرحلة المجهر التي يتم الحفاظ عليها عند 23 درجة مئوية.
  4. احصل على صور للسطح الداخلي لغطاء اللوحة باستخدام كاميرا بمعدل 20 إطارا s−1 (الفيديو التكميلي S2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا ، تم استخدام ديدان dauer من النوع البري لمراقبة السلوك الجماعي. تمت زراعة الديدان عند 23 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما تقريبا وصعدت إلى السطح الداخلي لغطاء صفيحة متوسطة DFA. في اليوم التجريبي ، تم نقل الغطاء فقط إلى لوحة NGM جديدة بدون وسط E. coli و DFA. تم الاحتفاظ بالجزء السفلي من صفيحة بتري هذه في البداية عند 23 درجة مئوية باستخدام نظام بلتيير ، ثم ارتفعت درجة حرارتها إلى 26 درجة مئوية. تم التقاط فيلم تحت المجهر. يوضح الشكل 3 لقطات من الفيلم. أعادت الديدان تشكيل أنماط شبكتها دي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، نعرض بروتوكولا لإعداد نظام للسلوك الجماعي واسع النطاق ل C. elegans في المختبر. تم إنشاء الطريقة القائمة على DFA في الأصل مع Caenorhabditis japonica14 و Neoaplectana carpocapsae Weiser15 ، وكلاهما غير نموذجية. ومع ذلك ، لم يتم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في السلوكيات الجماعية. C. elegans هو نموذجي قابل للتتبع وراثيا11,12. ساهمت الدراسات الجينية السلوكية باستخدام ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر مركز Caenorhabditis Genetics على توفير السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا المنشور من قبل JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (رقم المنحة JP21H02532) ، JSPS KAKENHI Grant-in-Aid حول مشروع المجالات المبتكرة "Science of Soft Robot" (رقم المنحة JP18H05474) ، JSPS KAKENHI Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلي B (رقم المنحة JP23H03845) ، PRIME من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (رقم المنحة JP22gm6110022h9904) ، برنامج JST-Mirai (رقم المنحة JPMJMI22G3) ، وبرنامج JST-FOREST (رقم المنحة JPMJFR214R).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلالات Escherichia coli< / em> و C. elegans< / em> سلالات < strong>
E. القولونية < / em>OP50Caenorhabditis < / em> مركز علم الوراثةOP50Food for C. elegans.< / em> Uracil auxotroph. E. القولوني< م > ب.
lite-1 (ce314) ؛ ljIs123 [mec-4p:: ChR2، unc-122p:: RFP]< / em>مؤلفZX899lite-1 (ce314) < / em> الذي يحمل الجينات التي تعبر عن ChR2 و RFP تحت سيطرة mec-4 < / em> و unc-122 < / em> المروج ، على التوالي
N2 BristrolCaenorhabditis < / em> مركزسلالة من النوع البري C. elegans< / em>
<قوي>لزراعة الديدان< / قوي >
أجار منقى ، مسحوقناكاراي تيسك01162-15لتحضير ألواح NGM جميع
الشبكية العابرةSigma-AldrichR2500لعلم البصريات الوراثي الوراثي
باكتو بيبتونبيكتون ديكنسون211677لتحضير ألواح NGM
كلوريد الكالسيومواكو036-00485لتحضير أطباق NGM
الكوليسترولواكو034-03002لتحضير أطباق NGM
di-Photassium هيدروجين فوسفاتNakarai tesque28727-95لتحضير أطباق NGM
طعامNihon Pet FoodVITA-ONEلتحضير أغذية أجار متوسط
مرق LB ، LennoxNakarai tesque20066-95لاستزراع الإشريكية القولونية< / em> OP50
كبريتات المغنيسيوم اللامائيةTGIM1890لتحضير أطباق
NGM أطباق بتري (60 مم)Nunc150270لتحضير ألواح NGM
ثنائي هيدروجين فوسفات البوتاسيومNakarai tesque28720-65لتحضير ألواح NGM
كلوريد الصوديومNakarai tesque31320-05ل إعداد لوحات NGM
< قوية > المراقبة < / قوية >
الكمبيوترCT حلCS6229Windows10 Pro مع وحدة المعالجة المركزية Intel Xeon Gold 6238R و 768 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي
CMOS كاميراHamamatsu الضوئيات   ؛ORCA-Lightning C14120-20Pللحصول على البيانات
CMOSOlympusDP74للحصول على البيانات
المجهر مع مجموعة SZX-MGFPأوليمبوسMVX10للحصول على البيانات
x2 عدسة موضوعيةأوليمبوسMV PLAPO 2XCمسافة العمل 20 مم وفتحة عددية 0.5
<قوية > التحكم في الغالق< قوي>
مصراعOptoSigmaBSH2-RIXللتحكم في النمط الزمني للإضاءة
الضوئية وحدة التحكم في الغالقOptoSigmaSSH-C2B-Aللتحكم في النمط الزمني للإضاءة
الضوئية<قوية>التحكم في درجة الحرارة< / قوي>
وحدة التحكم في درجة الحرارة بلتييرVICSWLVPU-30للتحكم في الرطوبة داخل لوحة بتري
وحدة تحكم UNI-THEMOAmpereUTC-100للتحكم في الرطوبة داخل لوحة
بتري<قوية>برنامج الحصول على البيانات< / strong>
HCImageHamamatsu الضوئياتللحصول على البيانات
علم الوراثة كاميرا

المراجع

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
  3. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  4. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
  5. Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
  6. Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
  7. Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
  8. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  9. Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
  10. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  11. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  12. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  13. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  14. Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
  15. Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
  16. de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
  17. Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647(2015).
  18. Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181(2019).
  19. Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947(2021).
  20. Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
  21. Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
  22. Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
  23. Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Caenorhabditis elegans
زراعة الديدان الخيطية على نطاق واسع لدراسة سلوكياتها الجماعية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.