مقالة منهجية

عزل وتنقية الحويصلات البكتيرية خارج الخلية من البراز البشري باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة

DOI:

10.3791/65574

⸱

سبتمبر 1, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة طريقة لعزل وتنقية الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) المخصبة من البراز البشري عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وتحدد الخصائص الفيزيائية ل BEVs من التشكل وحجم الجسيمات والتركيز ، وتناقش التطبيقات المحتملة لنهج DGC في البحث السريري والعلمي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) هي حويصلات نانوية مشتقة من البكتيريا التي تلعب دورا نشطا في التواصل بين البكتيريا والبكتيريا والبكتيريا المضيفة ، حيث تنقل الجزيئات النشطة بيولوجيا مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية الموروثة من البكتيريا الأم. BEVs المشتقة من ميكروبيوتا الأمعاء لها تأثيرات داخل الجهاز الهضمي ويمكن أن تصل إلى أعضاء بعيدة ، مما يؤدي إلى آثار كبيرة على علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. تعد التحقيقات النظرية التي تستكشف أنواع وكميات وأدوار BEVs المشتقة من البراز البشري ضرورية لفهم إفراز ووظيفة BEVs من ميكروبات الأمعاء. تتطلب هذه التحقيقات أيضا تحسين الاستراتيجية الحالية لعزل وتنقية BEVs.

قامت هذه الدراسة بتحسين عملية عزل وتنقية BEVs من خلال إنشاء وضعين للطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC): من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. تم تحديد التوزيع المخصب للخلايا الكهربائية في الكسور من 6 إلى 8 (F6-F8). تم تقييم فعالية النهج بناء على مورفولوجيا الجسيمات والحجم والتركيز ومحتوى البروتين. تم حساب معدلات استرداد الجسيمات والبروتين ، وتم تحليل وجود علامات محددة لمقارنة استعادة ونقاء وضعي DGC. أشارت النتائج إلى أن وضع الطرد المركزي من أعلى إلى أسفل كان له مستويات تلوث أقل وحقق معدل استرداد ونقاء مماثل لمعدل الطرد من أسفل إلى أعلى. كان وقت الطرد المركزي البالغ 7 ساعات كافيا لتحقيق تركيز BEV برازي يبلغ 108 / ملغ.

بصرف النظر عن البراز ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع سوائل الجسم الأخرى مع التعديل المناسب وفقا للاختلافات في المكونات واللزوجة. في الختام ، من شأن هذا البروتوكول المفصل والموثوق به أن يسهل عزل وتنقية BEVs الموحدة ، وبالتالي ، يضع أساسا لتحليل متعدد الأوميكس والتجارب الوظيفية اللاحقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرف الأمعاء على نطاق واسع بأنها العضو الذي يؤوي المجتمعات الميكروبية الأكثر وفرة في جسم الإنسان ، حيث يشارك أكثر من 90٪ من البكتيريا في الاستعمار والتكاثر 1,2. أظهرت أدلة واسعة النطاق أن ميكروبيوتا الأمعاء تعدل البيئة الدقيقة للأمعاء وتتفاعل في نفس الوقت مع الخلل الوظيفي في الأعضاء البعيدة ، في المقام الأول من خلال ضعف الحاجز المعوي 3,4. تشير الأدلة المتزايدة إلى وجود علاقة بين اختلال توازن ميكروبيوتا الأمعاء وتطور مرض التهاب الأمعاء (IBD) 5,6 ، وكذلك الاضطرابات المعرفية من خلال محور الأمعاءوالدماغ 5،6،7،8. تلعب الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) التي تنتجها البكتيريا أدوارا مهمة في هذه العمليات المرضية.

BEVs هي جسيمات نانوية تغلف المشتقات البكتيرية ، بأقطار تتراوح من 20 إلى 400 نانومتر. لقد ثبت أنها تسهل التفاعلات بين البكتيريا والكائنات الحية المضيفةلها 9,10. على الرغم من عدم ظهورها ، فقد حظيت هذه الجسيمات باهتمام متزايد من الباحثين بسبب تطبيقاتها الواسعة المحتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية وأهداف علاجية ومركبات توصيل الأدوية11. البراز البشري ، الذي يستخدم غالبا كعينات حيوية لدراسة BEVs ، والذي يتم الحصول عليه في الغالب من بكتيريا الأمعاء ، يحتوي على مزيج معقد من الماء والبكتيريا والدهون والبروتينات وبقايا الطعام غير المهضومة والخلايا الظهارية المقشرة وغيرها. يشكل تكوين البراز المعقد تحديات لعزل ونقاء BEVs ، مما يعيق إجراء تحليل شامل وموضوعي وواقعي ل BEVs. ومن ثم ، ظهرت استراتيجيات فعالة لتقليل التداخل من المكونات الملوثة وتعزيز إنتاجية BEVs كقضايا حاسمة تستحق الاهتمام الفوري.

تعتمد استراتيجيات العزل الحالية إلى حد كبير على تقنيات مثل الطرد المركزي فائق السرعة (UC) ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) 12،13،14،15،16،17. حاليا ، تعد DGC واحدة من أكثر الطرق المطبقة على نطاق واسع في مجال فصل BEV ، وتشمل وضعين عائمين للترسيب ، "من أعلى إلى أسفل" و "من أسفل إلى أعلى" ، والتي يتم تحديدها من خلال موضع التحميل الأولي للعينة. تميز هذه المنهجيات الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن المكونات الأخرى بناء على تفاوتات الحجم والكثافة ، مما ينتج عنه معدلات نقاء واسترداد متغيرة. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن استراتيجيات النهج الواحد غير كافية لفصل EVs بشكل مناسب عن البروتينات القابلة للذوبان في عينات سوائل الجسم ، مثل البروتين الدهني في الدم18 وبروتين Tamm-Horsfall في البول19. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتداخل توزيع حجم الحويصلات خارج الخلية حقيقية النواة (EEVs) مع توزيع BEVs ، مما يستلزم المزيد من التحسينات المنهجية لتحسين إنتاجية BEV. وبالتالي ، فإن النهوض بدراسة BEVs يتوقف على تطوير منهجيات فعالة للفصل والتنقية. والجدير بالذكر أن Tulkens etal 15 استخدم استراتيجية فيزيائية حيوية متعامدة لفصل BEVs البرازية عن EEVs ، حيث كان وقت الطرد المركزي لوضع DGC من أسفل إلى أعلى يصل إلى 18 ساعة. في المقابل ، خفضت هذه الدراسة إلى 7 ساعات ، مما أدى إلى توفير وقت الطرد المركزي الفائق التدرج بشكل كبير وتبسيط العملية.

في هذه الدراسة ، قمنا بعزل وتنقية BEVs البرازية باستخدام وضعين DGC في ظل ظروف عازلة محسنة ، بعد إثراء BEVs بمجموعة من سرعات الطرد المركزي التفاضلية ، من السرعة المنخفضة إلى السرعة العالية للغاية. أشارت التقييمات القائمة على التشكل وحجم الجسيمات والتركيز إلى أداء جدير بالثناء من خلال هذه الطريقة المعززة. يمكن أن تكون هذه الدراسة بمثابة أساس للبحث المستقبلي ، وتوسيع تطبيقاتها إلى مجال أوسع ، وتقديم رؤى حول عدم تجانس BEVs داخل جسم الإنسان. كما أنه يساهم في توحيد تقنيات فصل وتحليل BEV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أقرت لجنة الأخلاقيات في مستشفى نانفانغ ، الجامعة الطبية الجنوبية ، هذه الدراسة ، التي أجريت بموافقة مستنيرة من المشاركين. التزمت جميع الطرق المستخدمة هنا بإرشادات التشغيل القياسية التي توفرها المعايير الدولية للميكروبيوم البشري (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). تم تكليف جميع إجراءات مناولة السوائل اللاحقة بأن يتم تنفيذها داخل خزانة السلامة البيولوجية أو مقعد فائق النظافة.

1. جمع واقتباس عينات البراز

  1. قم بتوزيع عينات البراز ، وكيس مغلق ، وصندوق مثلج ، وقدم تعليمات شاملة للمشاركين حول كيفية شراء العينات وحفظها.
  2. اطلب من كل مشارك جمع عينة البراز الخاصة به باستخدام جهاز أخذ العينات المقدم ، ونقلها إلى المختبر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غضون 24 ساعة.
  3. عند الاستلام في المختبر ، استخدم ملعقة معقمة لقسمة أقل من 3.5 غرام من البراز في أنبوب طرد مركزي 50 مل تم وزنه مسبقا. قم بتدوين وزن عينة البراز على الأنبوب لإجراءات ما قبل المعالجة اللاحقة.
    نقطة التوقف: إذا لم تكن المعالجة الفورية للعينات ممكنة ، فقم بتخصيص العينة للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية بعد التدوين المناسب.

2. إعداد عينة البراز

  1. برد 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية PBS المبرد مسبقا من خلال مرشح Polyethersulfone (PES) 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة 50 مل في عشرة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.
  2. ضع أنبوبين سعة 50 مل على الجليد ، يحتوي كل منهما على 3.5 جم من عينات البراز. أضف 35 مل من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب.
    ملاحظة: احسب الكمية المطلوبة من PBS لإذابة البراز ، مع ضمان تركيز العينة الأقصى بنسبة 10٪ (وزن / حجم). في حالة معالجة عينات إضافية ، استخدم المزيد من الأنابيب حسب الحاجة.
  3. رج العينات عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية ، أو ضعها لمدة 8 ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية حتى يتم تعليق البراز تماما بشكل واضح.

3. الطرد المركزي السرعة التفاضلية

  1. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي المبرد عالي السرعة إلى 4 درجات مئوية.
  2. اضبط وزن الأنبوبين اللذين يحتويان على العينات المحضرة في الخطوة 2.3 مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى وزن إجمالي قدره 0.1 جم.
  3. أجهزة الطرد المركزي العينات في 3،000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. ماصة بعناية طاف في اثنين من أنابيب الطرد المركزي نظيفة 50 مل ، وترك ما يقرب من 1 مل فوق بيليه. استخدم ماصة باستور بلاستيكية يمكن التخلص منها لهذه العملية.
  5. اضبط وزن الأنبوبين باستخدام PBS للوصول إلى الوزن الإجمالي في حدود ± 0.1 جم.
  6. أجهزة الطرد المركزي المادة الطافية المنقولة عند 12،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. نضح المادة الطافية باستخدام حقنة سعة 20 مل ، وإزالة إبرة المحقنة ، وترشيحها من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر في أنابيب سعة 50 مل. عند هذه النقطة ، يجب أن يكون حجم الطافي حوالي 30 مل.
    ملاحظة: إذا كانت كمية كبيرة من الشوائب لا تزال مرئية بعد الطرد المركزي 12000 × جرام ، فمن الضروري تكرار خطوة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى خسارة كبيرة في BEVs بسبب انسداد المسام أثناء الترشيح.

4. الطرد المركزي فائق السرعة

  1. نظف الدوار والدلو عن طريق مسحهما بالكحول بنسبة 75٪ (v / v) للتخلص من أي تلوث متبقي.
  2. ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 38.5 مل في حامل الأنبوب.
    ملاحظة: حدد أنبوب الطرد المركزي الفائق المناسب بناء على حجم العينة. تجنب الأشعة فوق البنفسجية والكواشف الكيميائية غير المناسبة لتعقيم أنابيب الطرد المركزي كما هو موضح في دليل المنتج.
  3. انقل ما يقرب من 30 مل من طافي البراز المصفى من الخطوة 3.7 إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق.
  4. املأ أنبوب الطرد المركزي الفائق بحوالي 8 مل من PBS ، تاركا فجوة 3 مم من فتحة الأنبوب.
  5. ضع أنبوبي الطرد المركزي الفائق مع العينات في دلاء الطرد المركزي الفائق المتعارضة ، على سبيل المثال ، يتوافق الجرافة 1 مع 4 (1-4) ، 2-5 ، 3-6.
  6. اضبط وزن الجرافتين باستخدام PBS لتحقيق وزن إجمالي في حدود ± 0.005 جم.
  7. قم بتثبيت جميع الجرافات على الدوار ، بغض النظر عما إذا كانت الأنابيب محملة أم لا.
  8. بدء الفراغ والطرد المركزي العينات عند 160000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  9. حرر مكنسة الحجرة ، وافتح الباب بمجرد عرض Ready على الصفحة الرئيسية للأداة.
  10. قم بإزالة الدوار من جهاز الطرد المركزي الفائق.
  11. انقل الدلاء من الدوار إلى الحامل ، واسترد الأنابيب باستخدام القراص.
  12. تخلص من المادة الطافية ، والتي ستحتوي على كريات بنية مرئية في الأسفل.
  13. أعد تعليق الكريات عن طريق سحبها بشكل متكرر لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) حتى يتم تعليقه تماما. املأ الأنبوب بحوالي 37 مل من PBS ، تاركا فجوة 3 مم من الفتحة.
  14. قم بإجراء طرد مركزي فائق آخر باتباع الخطوات 4.5-4.11 عند 160000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة المكونات الملوثة المرفقة جزئيا من جدران الأنبوب.
  15. تخلص من المادة الطافية ، واقلب أنبوبي الطرد المركزي الفائق لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة أي محلول متبقي على الجدار الداخلي باستخدام المساحات.
    ملاحظة: تنظيف الجدار الداخلي يقلل من التداخل من التلوث المتبقي الملتصق بجدار أنبوب الطرد المركزي الفائق. اختر المساحات التي لن تؤثر على تحليل BEV ، خاصة فيما يتعلق بحجم الجسيمات.
  16. أعد تعليق الكريات في كل أنبوب عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل باستخدام 1.2 مل من PBS المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر.
  17. انقل 1.2 مل من محلول PBS / BEV من أنبوب طرد مركزي فائق إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 مل.
    نقطة التوقف: يمكن أن ينتقل حل PBS / BEV الذي تم جمعه من أنبوب طرد مركزي فائق إلى الخطوة 6. قم بتخزين المحلول من الأنبوب الآخر عند -80 درجة مئوية.

5. إعداد الحل للطرد المركزي تدرج الكثافة

  1. تحضير 0.02 م HEPES عازلة
    1. امزج 0.477 جم من مسحوق HEPES و 0.8 جم من كلوريد الصوديوم مع 90 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 بإضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). ارفع الحجم إلى 100 مل بالماء منزوع الأيونات وقم بتصفية المحلول من خلال أغشية PES 0.22 ميكرومتر.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو قلوي كاوي قوي. يجب على المشغلين التعامل معها وإعدادها بعناية في خزانة الدخان.
  2. إعداد المخزن المؤقت لتدرج الكثافة
    1. احسب الحجم المطلوب لكل مخزن مؤقت لتدرج الكثافة بناء على عدد أنابيب الطرد المركزي الفائقة للطرد المركزي المتدرج الكثافة (الخطوة 6) (في هذا البروتوكول ، كانت أحجام حلول التدرج 60٪ و 50٪ و 40٪ و 20٪ و 10٪ 2.5 مل و 3 مل و 6 مل و 6 مل و 6 مل على التوالي).
    2. لتحضير محلول عمل يوديكسانول بنسبة 50٪ (وزن / حجم) ، امزج محلول تخزين HEPES 0.02 M ومحلول مخزون يوديكسانول 60٪ (وزن / حجم) بنسبة حجم 1: 5 (0.5 مل: 2.5 مل).
      ملاحظة: استخدم حقنة سعة 20 مل يمكن التخلص منها لسحب محلول مخزون اليوديكسانول وتجنب إدخال الهواء.
    3. لتحضير مخازن اليوديكسانول بتركيزات مختلفة ، ادمج محلول عمل اليوديكسانول بنسبة 50٪ من الخطوة 5.2.2 مع المخزن المؤقت HEPES الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5.1 باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وفقا للنسب الموضحة في الجدول 1.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوة 5 على مقعد فائق النظافة مع إطفاء الأنوار. قم بتخزين محلول مرق اليوديكسانول المفتوح في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمنع نمو البكتيريا. حافظ على محلول اليوديكسانول والمخزن المؤقت HEPES محميين من الضوء.

6. إنشاء نظام طرد مركزي متدرج الكثافة

  1. وضع DGC من أعلى إلى أسفل
    1. اجمع بين 500 ميكرولتر من محلول PBS / BEV المعزول من الخطوة 4 مع 3 مل من PBS. امزج المحاليل برفق باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر للحصول على 3.5 مل من محلول PBS / BEV.
    2. ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 31 مل على صفيحة رغوية بها ثقوب وقم بتسميتها ك "↓".
    3. أضف عموديا 3 مل من محلول اليوديكسانول بنسبة 50٪ إلى قاع الأنبوب باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    4. قم بإمالة الأنبوب إلى زاوية 70 درجة وضع حامل أنبوب أو أي دعم آخر أعلى قليلا من مستوى لوحة الرغوة ، أسفل فتحة الأنبوب.
    5. أضف 3 مل من محلول يوديكسانول 40٪ فوق محلول يوديكسانول 50٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    6. أضف 3 مل من محلول يوديكسانول 20٪ فوق محلول يوديكسانول 40٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    7. أضف 3 مل من محلول يوديكسانول 10٪ فوق محلول يوديكسانول 20٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    8. أضف 3.5 مل من محلول PBS / BEV من الخطوة 6.1.1 فوق محلول اليوديكسانول 10٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    9. أعد الأنابيب برفق إلى الوضع الرأسي.
      ملاحظة: بعد السحب ، يجب أن يكون التقسيم الطبقي مرئيا.
  2. وضع DGC من أسفل إلى أعلى
    1. ضع أنبوب طرد مركزي فائق سعة 31 مل على صفيحة رغوية بها ثقوب وقم بتسميتها ك "↑".
    2. أضف عموديا 2.5 مل من محلول مخزون اليوديكسانول بنسبة 60٪ إلى قاع الأنبوب. امزجه برفق مع 500 ميكرولتر من محلول PBS / BEV المعزول من الخطوة 4 باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر للحصول على 3 مل من محلول يوديكسانول / BEV بنسبة 50٪.
    3. قم بإمالة الأنبوب إلى زاوية 70 درجة وضع حامل أنبوب أو أي دعم آخر أعلى قليلا من مستوى لوحة الرغوة ، أسفل فتحة الأنبوب.
    4. أضف 3 مل من محلول اليوديكسانول 40٪ فوق محلول يوديكسانول / BEV بنسبة 50٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    5. أضف 3 مل من محلول اليوديكسانول 20٪ فوق محلول اليوديكسانول 40٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    6. أضف 3 مل من محلول اليوديكسانول 10٪ فوق محلول اليوديكسانول 20٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    7. أضف 3.5 مل من PBS فوق محلول اليوديكسانول 10٪ باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    8. أعد الأنابيب برفق إلى الوضع الرأسي.
    9. في هذه المرحلة ، بقي 200 ميكرولتر من التعليق الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.17 ، والذي يمكن تحليله لاحقا كمجموعة تسمى "UC".
      ملاحظة: عند نقل الحلول في الخطوة 6 ، احتفظ دائما بطرف الماصة مقابل جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق عموديا على محور الأنبوب.

7. كثافة الطرد المركزي التدرج وجمع الكسور

  1. اضبط وزن الأنبوبين باستخدام PBS لتحقيق وزن إجمالي في حدود ± 0.005 جم.
  2. ضع الأنابيب في الدلاء وفقا للخطوة 4.5 وعرضها للطرد المركزي عند 160000 × جم لمدة 7 ساعات عند 4 درجات مئوية.
  3. اجمع الكسور باستخدام ماصة (1000 ميكرولتر) من أعلى إلى أسفل مقابل الجدار الجانبي بالترتيب التالي: 3 مل ، 2 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1 مل ، 1.5 مل ، و 3 مل في أنبوب طرد مركزي فائق 38.5 مل.
    ملاحظة: حافظ على خط الرؤية عند نفس مستوى سطح السائل.
  4. إجراء الطرد المركزي الفائق لكل جزء تم الحصول عليه في الخطوة 7.3 وفقا للخطوة 4 عند 160000 × جم لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة المادة الطافية واقلب أنابيب الطرد المركزي الفائقة لمدة 5 دقائق.
  6. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  7. انقل محلول PBS / BEV إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 مل.
  8. قم بتسمية الكسور من F1 إلى F10 وتحليلها بناء على الخطوة 8.
    نقطة التوقف: إذا تعذر معالجة العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.8 على الفور ، فقم بتخزينها في -80 درجة مئوية.

8. التوصيف والتحليل الكمي للكسور المجمعة

  1. حدد قيم الامتصاص (OD 340 نانومتر) لكل كسر باستخدام كاشف الصفائح الدقيقة مع عنصر تحكم فارغ لحساب الكثافة المقابلة لها.
    ملاحظة: استبدل حل PBS/BEV (الخطوة 6.1.1 والخطوة 6.2.2) ب PBS لإنشاء عنصر تحكم فارغ.
    1. تحضير 100 ميكرولتر لكل من 0٪ و 5٪ و 10٪ و 12.5٪ و 20٪ محلول يوديكسانول مخفف بمقدار 0.02 م HEPES بناء على محلول مخزون 50٪ (الخطوة 5.2.2) كمعايير ، المقابلة لكثافات 1.0058 جم / مل ، 1.0318 جم / مل ، 1.058 جم / مل ، 1.0708 جم / مل ، و 1.111 جم / مل ، على التوالي.
    2. أضف 50 ميكرولتر من كل كسر من عنصر التحكم الفارغ (المعد في الخطوة 7.3) و 50 ميكرولتر من كل محلول قياسي (تم إعداده في الخطوة 8.1.1) لتكرار آبار صفيحة 96 بئرا.
    3. اضبط الطول الموجي على 340 نانومتر ، وقم بقياس الكثافة البصرية لنقطة النهاية ، واحسب كثافة كل كسر.
    4. حدد F4-F9 كنطاق كسور BEV بناء على كثافتها.
  2. تحديد تركيز البروتين من كسور BEV باستخدام مقايسة حمض bicinchoninic (BCA).
    1. تمييع المادة عشرة أضعاف في PBS المقدمة من الشركة المصنعة لإعداد محلول بروتين قياسي 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
    2. أضف محلول البروتين القياسي (المحضر في الخطوة 8.2.1) بأحجام مختلفة وفقا لتعليمات الكاشف ، واستكمل كل بئر من صفيحة 96 بئرا مع PBS إلى حجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
    3. أضف 20 ميكرولتر من العينات المحضرة في الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 إلى كل بئر.
    4. امزج الكواشف A و B بنسبة 50: 1 ، وانقل 200 ميكرولتر إلى كل بئر.
    5. احتضن الطبق في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. قم بقياس قيمة الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة ، واحسب تركيز البروتين (ميكروغرام / ميكرولتر) ، وحدد محتوى البروتين (ميكروغرام) للعينات بناء على المنحنى القياسي (x: الكثافة البصرية ؛ y: تركيز البروتين) الناتج عن قيم المحاليل القياسية المخففة في الخطوة 8.2.2.
  3. توصيف كسور BEV المحددة في الخطوة 8.1.4 باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للتحقق من وجود BEVs. يجب تنفيذ جميع الإجراءات أدناه على الجليد.
    1. ضع 10 ميكرولتر من كل جزء F4-F9 معزول من الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 على شبكات نحاسية مدعومة ب Formvar / Carbon لمدة 20 دقيقة ، وصمة عار بورق الترشيح.
    2. شطف العينات مع 100 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لكل منها ، وصمة عار مع ورقة الترشيح.
    3. ثبت العينات ب 100 ميكرولتر من 1٪ (وزن / حجم) جلوتارالدهيد لمدة 5 دقائق وصمة عار بورق الترشيح.
    4. اغسل الشبكات ب 100 ميكرولتر من PBS عشر مرات لمدة 2 دقيقة لكل منها ، وصمة عار بورق الترشيح.
    5. قم بتلطيخ الشبكات ب 50 ميكرولتر من 1.5٪ (وزن / حجم) أسيتات اليورانيل لمدة 10 دقائق ، وصمة عار بورق الترشيح.
      تنبيه: أسيتات اليورانيل مشعة وشديدة السمية عند ملامستها للجلد أو استنشاقها. تعامل مع المحاليل التي تحتوي على أسيتات اليورانيل في خزانة الدخان واتبع تدابير السلامة المناسبة.
    6. انقل الشبكات إلى قطرة ميثيل سلولوز بنسبة 1٪ (وزن / حجم) لمدة 5 دقائق وصمة عار بورق الترشيح.
    7. قم بتخزين الشبكات المجففة بالهواء في بيئة مظلمة وخالية من الغبار حتى المراقبة.
    8. التقط الصور وحللها باستخدام TEM.
  4. قم بتوصيف كسور BEV المحددة في الخطوة 8.1.4 باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لحساب عدد الجسيمات.
    1. معايرة النظام باستخدام جزيئات البوليسترين 110 نانومتر.
    2. اغسل مجموعة العينات باستخدام برنامج تلفزيوني.
    3. قم بتخفيف العينات من الكسور المختلفة المكتسبة في الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 إلى تركيز في حدود 105-10 9 جسيمات / مل ، بتركيز محسن قدره 107 جسيمات / مل.
    4. سجل وحلل في 11 موضعا مع ثلاث نسخ متماثلة ، مع الحفاظ على درجة الحرارة حوالي 23-30 درجة مئوية.
  5. تحليل محتويات البروتين في العينات عن طريق تلطيخ كوماسي الأزرق اللامع (CBBS) والنشاف الغربي (WB).
    1. قم بتخفيف عينات BEVs من الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.8 والعينات المتبقية بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9 باستخدام PBS ومخزن التحميل المؤقت 5 × إلى تركيز نهائي قدره 0.5 أو 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، إذا كانت هناك حاجة إلى الكمية ، مما يضمن تحميل عينة كافية تبلغ 20 ميكرولتر (10 ميكروغرام أو 20 ميكروغرام) لكل بئر في الخطوة 8.5.2. تغلي العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. قم بتجميع جل بولي أكريلاميد الجاهز في خزان الرحلان الكهربائي ، ونقل العينات إلى الآبار.
    3. إجراء الكهربائي العمودي مع المعلمات التالية: 160 فولت لمدة 50 دقيقة.
    4. قم بتلطيخ الجل في محلول Coomassie الأزرق اللامع لمدة 1 ساعة ، واشطفه بالماء منزوع الأيونات حتى تضيء الخلفية الزرقاء ، والتقط الصور بالكاميرا.
    5. تنفيذ إجراءات نشاف البروتين للمواد الهلامية الأخرى مع المعلمات التالية: 400 مللي أمبير لمدة 20 دقيقة.
    6. قم بسد أغشية النشاف بمحلول BSA 5٪ (وزن / حجم) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    7. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت TBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
    8. احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الأولية (علامات BEV: LPS ، OmpA ، LTA ؛ علامات EEV: CD63 ، CD9 ، TSG-101 ، Syntenin ، Integrin β1 ؛ علامات التلوث الأخرى: فلاجلين ، كالنيكسين) لمدة 8-12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    9. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
    10. احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    11. قم بتنفيذ الخطوة 8.5.9.
    12. تطوير النشاف باستخدام جهاز التلألؤ الكيميائي.
    13. استبدل محلول PBS / BEV (الخطوة 6.1.1 والخطوة 6.2.2) ب BEVs من الإشريكية القولونية لإنشاء تحكم إيجابي (انظر جدول المواد لإجراء عزل E. coli-BEVs الخام) ، وإجراء جميع التجارب المذكورة أعلاه لتوصيف BEVs.
      نقطة التوقف: حدد F6-F8 كتوزيع للكسور المخصبة ب BEV بناء على نتائج التوصيف الموصوف أعلاه ل BEVs البرازية ، واستخدم هذا النطاق الضيق للتحليل اللاحق.
  6. حساب معدلات الاسترداد من حيث الجسيمات والبروتينات لتقييم كفاءة وضعي DGC. النتائج أدناه معروضة كنسب مئوية.
    1. احسب معدلات استرداد الجسيمات في الوضع من أعلى إلى أسفل: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / الجسيمات بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9.
    2. احسب معدلات استرداد الجسيمات في الوضع من أسفل إلى أعلى: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / الجسيمات بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9.
    3. احسب معدلات استرداد البروتينات في الوضع من أعلى إلى أسفل: إجمالي محتويات البروتين في F6-F8 (ميكروغرام) / محتوى البروتين بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9 (ميكروغرام).
    4. احسب معدلات استرداد البروتينات في الوضع من أسفل إلى أعلى: إجمالي محتويات البروتين في F6-F8 (ميكروغرام) / محتوى البروتين بعد تعريف UC في الخطوة 6.2.9 (ميكروغرام).
  7. احسب نسبة الجسيمات / البروتين لتقييم النقاء المحدد تقليديا ل UC ووضعي DGC ، وتم تقديم جميع النتائج أدناه كنسب مئوية.
    1. نسبة الجسيمات / البروتين بعد UC المحددة في الخطوة 6.2.9: الجسيمات بعد UC / محتوى البروتين بعد UC (ميكروغرام).
    2. نسبة الجسيمات / البروتين في الوضع من أعلى إلى أسفل: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / محتوى البروتين في F6-F8 (ميكروغرام).
    3. نسبة الجسيمات / البروتين في الوضع من أسفل إلى أعلى: إجمالي الجسيمات في F6-F8 / محتوى البروتين في F6-F8 (ميكروغرام).
  8. حدد وضع الطرد المركزي الأنسب (تم تحديد الوضع من أعلى إلى أسفل في البروتوكول) لتنقية البراز BEV والتحليل المستقبلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد توزيع الكسور المخصبة بالطاقة الكهربائية الهجينة
لتحديد توزيع الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) - الكسور المخصبة ، تم إنشاء عنصر تحكم فارغ لقياس قيم الامتصاص عند OD 340 نانومتر ، وتم حساب كثافة كل جزء بناء على القياسات وإرشادات اليوديكسانول (الخطوة 8.1). يعرض الجدول 2 نتائج الكثافة ، مما يدل على أن الكسور F4 إلى F9 أظهرت كثافات ضمن النطاق المرتبط عادة بالحويصلات خارج الخلية. تشير هذه النتيجة إلى أن غالبية BEVs تم عزلها في هذه الكسور ، مما أدى إلى تعريف F4-F9 على أنه النطاق ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) هي جسيمات نانوية ثنائية الطبقة تفرزها البكتيريا ، وتحمل ثروة من البروتينات والدهون والأحماض النووية وغيرها من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، مما يساهم في التوسط في التأثيرات الوظيفية للبكتيريا20. تم التحقق من مشاركة BEVs المشتقة من الأمعاء في تطور الأمراض ، مثل مرض التهاب الأمعاء ومرض كرون وسرطان القولون والمستقيم ، وتؤثر أيضا على التمثيل الغذائي العام وتتوسط ضعف الوظيفة الإدراكية4،16،17،20،2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الوطني للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82025024) ؛ المشروع الرئيسي للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82230080) ؛ البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFA1300604)؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81871735 و 82272438 و 82002245) ؛ صندوق قوانغدونغ للعلوم الطبيعية للعلماء الشباب المتميزين (2023B1515020058) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2021A1515011639) ؛ برنامج تطوير البحوث الأساسية الرئيسي للدولة التابع لمؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة شاندونغ في الصين (ZR2020ZD11) ؛ مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه (2022M720059) ؛ مخطط تنمية الشباب المتميز لمستشفى نانفانغ ، الجامعة الطبية الجنوبية (2022J001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ (وزن / حجم) جلوتارالديهايد (محضر من محلول مخزون بنسبة 2.5٪ في ماء منزوع الأيونات)ACMECAP1126المراقبة المورفولوجية ل BEVs باستخدام TEM في الخطوة 8.3.3
1٪ (وزن / حجم) ميثيل السليلوز (محضر من مسحوق أصلي في ماء منزوع الأيونات)Sigma-AldrichM7027المراقبة المورفولوجية ل BEVs باستخدام TEM في الخطوة 8.3.6
1.5٪ (وزن / حجم) أسيتات اليورانيل (محضرة من مسحوق أصلي في ماء منزوع الأيونات)العلوم المتعددة21447-25المراقبة المورفولوجية ل BEVs باستخدام TEM في الخطوة 8.3.5
1000 & mu ؛ لتر ، 200 مو ؛ L ، 10 مو ؛ L PipetteKIRGENKG1313 ، KG1212 ، KG1011نقل المحلول
5٪ (وزن / حجم) محلول ألبومين مصل البقر (محضر من المسحوق الأصلي في المخزن المؤقت TBST)Fdbio scienceFD0030يستخدم في النشاف الغربي للحجب في الخطوة 8.5.6
5 مرات التحميل المخزن المؤقتFdbio scienceFD006يستخدم في النشاف الغربي وصمة عار Coomassie الزرقاء اللامعة في الخطوة 8.5.1
75٪ (حجم / حجم) كحولLIRCONLIRCON-500 ملتطهير السطح
96 بئر لوحةRarA8096قياس قيم الامتصاص  
الأجسام المضادة المضادة للكالنيكسينAbcamab92573النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي) الجسم
المضاد المضاد ل CD63Abcamab134045النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي) الجسم
المضاد المضاد ل CD9Abcamab236630النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الجسم المضاد للسوطالمضاد سينو بيولوجي40067-MM06النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الأجسام المضادة المضادة للإنتجرين بيتا 1Abcamab30394النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الأجسام المضادة المضادة ل LPSThermo FisherMA1-83152النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الأجسام المضادة المضادة ل LTAThermo Fisher   ؛MA1-7402النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الأجسام المضادة المضادة ل OmpACUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD ، https://www.cusabio.com/النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الأجسام المضادة المضادة للسينتينينAbcamab133267النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي) الجسم
المضاد المضاد TSG101Abcamab125011النشاف الغربي (الجسم المضاد الأساسي)
الأوتوكلافZEALWAYGR110DPالتعقيم للإمدادات والوسائط المستخدمة في التجربة
BalanceMettler ToledoAL104موازنة عينة الأنبوب المحملة
بمقايسة حمض PBS Bicinchoninic   ؛Fdbio scienceFD2001قياس محتوى البروتين في BEVs في الخطوة 8.2
BioRenderBioRender https://app.biorender.comجعل سير العمل التخطيطي لعزل وتنقية BEVs كما هو موضح في الشكل 1
خزانة السلامة الحيويةHaierHR1200- II B2Peform الإجراءات المتعلقة بمعالجة عينات البراز
أجهزة الطرد المركزي 5810 R ؛ الدوار F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002 ، المحول: 5804774000المعالجة المسبقة ل BEVs (الخطوة 3) جهاز
التلألؤ الكيميائيBIO-OIOI600SE-MFيستخدم في النشاف الغربي للكشف عن الإشارة في الخطوة 8.5.12
Cytation 5BioTekF01كاشف Microplate لقياس الامتصاص (الخطوة 8.1) والفلورة (الشكل 6) القيم   ؛
البروتين الدهني منخفض الكثافةACMECAC12038تعريف توزيع المكونات المسببة للتداخل.
معدات الرحلان الكهربائيBio-rad1658033تستخدم في النشاف الغربي لفصل البروتين ونقله في الخطوة 8.5.2 ، 8.5.3 ، 8.5.5
مجموعة تلألؤ كيميائي محسن HRP & nbsp ؛Fdbio scienceFD8020تستخدم في النشاف الغربي للكشف عن الإشارات في الخطوة 8.5.12
الإشريكية القولونية  < / em>American Type CultureCollection ATCC8739عزل BEVs كعنصر تحكم إيجابي. البروتوكول: قم بإذابة 25 جم من مسحوق LB في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. نقل 800 & mu; L من الإشريكية القولونية المحفوظة في الوسط. زراعة عند 37 درجة. C في شاكر الحاضنة. ثم جهاز الطرد المركزي في 3 ، 000 & مرة ؛ ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات ؛ ج ، 12 ، 000 & مرة ؛ ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات ؛ C ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال 0.22 & mu ؛ غشاء M ، وأداء الطرد المركزي فائق السرعة عند 160 ، 000 مرة ؛ (ز) لمدة 70 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. تم تعليق الحبيبات التي تعرف بأنها BEVs الخام من الإشريكية القولونية في 1.2 مل من PBS (الخطوة 3 ، 4).       
أنابيب الصقر 50 ملKIRGENKG2811المعالجة المسبقة ل BEVs (الخطوة 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie تلطيخ أزرق لامع في الخطوة 8.5.4
ورق ترشيحBiosharpBS-TFP-070Bالمراقبة المورفولوجية ل BEVs باستخدام TEM في الخطوة 8.3 (نشاف المحلول)
نحاسية مدعومة من Formvar / Carbon Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50المراقبة المورفولوجية ل BEVs باستخدام TEM في الخطوة 8.3
مسحوق HEPESMeilunbioMB6078قم بإعداد مخازن يوديكسانول بتركيزات مختلفة للطرد المركزي المتدرج
للكثافة HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L)Fdbio scienceFDM007النشاف الغربي (الجسم المضاد الثانوي)
HRP AffiniPure Goat المضاد للأرانب IgG (H + L)Fdbio علمFDR007النشاف الغربي (الجسم المضاد الثانوي)
حاضنة شاكرQiangwenDHZ-Lزراعة الإشريكية القولونية   ؛
Kimwipes™ مناديل مهمة حساسةKimtech Science34155امسح الجدار الداخلي لأنبوب الطرد المركزي الفائق في الخطوة 4.15
رطل مرقHopebioHB0128زراعة الإشريكية القولونية   ؛
فريزر بدرجة حرارة منخفضة (-80 درجة ؛ ج)HaierDW-86L338Jتخزين العينات
الميثانولAlaldinM116118المستخدمة في النشاف الغربي لتنشيط غشاء PVDF في الخطوة 8.5.5
الأنابيب الدقيقة 1.5 ملKIRGENKG2211استعادة الكسور بعد الكثافة المتدرجة للطرد
المركزي أنابيب الدقيقة 2 ملKIRGENKG2911استعادة الكسور بعد الطرد المركزي المتدرج
للكثافة Micro أنابيب 5 ملBBIF610888-0001استعادة الكسور بعد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي
قارئ Microplate   ؛ثيرمو فيشر Multiskan MK3قياس محتوى البروتين في BEVs في الخطوة 8.2
مرشح Millipore 0.22 & mu ؛ مميرك ميليبورSLGP033RBتعقيم الترشيح ؛ المواد: بولي إيثرسلفون ، PES
NaClGHTECH1.01307.040محلول الطرد المركزي المتدرج الكثافة
NaOHGHTECH1.01394.068محلول الطرد المركزي المتدرج الكثافة (تعديل الأس الهيدروجيني) Optima
& trade ؛ XPN-100Beckman CoulterA94469الطرد المركزي الفائق لعزل BEVs في الخطوة 4 ، 7
OptiPrep & trade ؛Serumwerk Bernburg AG1893محلول مخزون الطرد المركزي المتدرج
الكثافة شاكر المدارييونينغCS-100قم بإذابة البراز في الخطوة 2
ملحي مخزن بالفوسفاتPB180327قم بإذابة البراز في الخطوة 2
ماصةEppendorf3120000267 ، 3120000259نقل المحلول
ماصة باستور بلاستيكيةABCbioABC217003-4إزالة المادة الطافية في المعالجة المسبقة في الخطوة 3.4
أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF)ميليبورISEQ00010 ، IPVH00010تستخدم في النشاف الغربي لنقل البروتين في الخطوة 8.5.5
جل بولي أكريلاميد الجاهز ، 4 & ndash ؛ 20٪ 15 WellsACEF15420Gelيستخدم في النشاف الغربي لفصل البروتين في الخطوة 8.5.2 ، 8.5.3
مخفف الأجسام المضادة الأوليةFdbio scienceFD0040يستخدم في النشاف الغربي في الخطوة 8.5.8
سلم البروتينFdbio scienceFD0672يستخدم في النشاف الغربي وبقعة Coomassie الزرقاء اللامعة في الخطوة 8.5
محلول نشاف البروتين السريعUBIOUW0500تستخدم في النشاف الغربي لنقل البروتين في الخطوة 8.5.5
الدوار SW 32 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter369650الطرد المركزي الفائق لعزل BEVs في الخطوة 4 ، 7
حقنة 20 مل ، 50 مل & nbsp ؛JetwayZSQ-20ML ، YCXWJZSQ-50 ملنقل المخازن المؤقتة amd إزالة المواد الطافية في المعالجة المسبقة
لمسحوق TBSFdbio scienceFD1021المستخدمة في النشاف الغربي في الخطوة 8.5
مجهر الإلكترون الناقل (TEM)هيتاشي & nbsp ؛H-7650المراقبة المورفولوجية ل BEVs في الخطوة 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020تستخدم في النشاف الغربي في الخطوة 8.5
أنبوب الطرد المركزي الفائقBeckman326823 ، 355642الطرد المركزي الفائق لعزل BEVs في الخطوة 4 ، 7
مقعد فائق النظافةAIRTECHSW-CJ-2FDقم بصياغة الإجراءات المتعلقة بالتعامل مع السوائل
حمام مائيBluepardيستخدم CU600لقياس محتوى البروتين في BEVs في الخطوة 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS / N 21-734 ، برنامج ZetaView (الإصدار 8.05.14 SP7) تحليلتتبع الجسيمات النانوية (NTA) لقياس حجم الجسيمات وتركيز BEVs في الخطوة 8.4
شبكات محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359(2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277(2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208(2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520(2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442(2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107(2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة