تمت مراجعة جميع التجارب على والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة بكين للطب الصيني (No. BUCM-4-2022010101-1097). في هذا البروتوكول ، تم إيواء 24 من ذكور الأرانب النيوزيلندية البالغة من العمر 6 أسابيع في ظل ظروف معينة ، وهي 20-25 درجة مئوية ، ورطوبة 50-60٪ ، ودورة يومية مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة ، مع حرية الوصول إلى نظام غذائي منتظم للتشاو. تم تخدير الأرانب والتضحية بها من خلال الجمع بين التخدير العميق والانصمام الهوائي. الألم هو أحد السمات المرضية النموذجية ل KOA وهو أيضا أحد المؤشرات الرئيسية المستخدمة لتقييم النماذج الحيوانية ل KOA وطرق التدخل ، لذلك لا يتم استخدام المسكنات أثناء إعداد النموذج.
1. نموذج أرنب KOA
- تخدير الأرانب ب 3٪ من صوديوم بنتوباربيتال (30 مجم / كجم) عن طريق الوريد عند حافة الأذن. لتأكيد المستوى المناسب من التخدير ، ابحث عن منعكس القرنية الضعيف أو الغائب بشكل كبير وغياب الألم عند تثبيت الجلد بملقط مرقئ. أثناء التخدير ، أضف 2-3 قطرات من مواد التشحيم إلى عيون الأرانب كل 15 دقيقة لمنع عيون الأرانب من الجفاف.
- بعد التخدير ، قم بإصلاح كل أرنب في وضع ضعيف ، وسحب الطرف الخلفي الأيسر إلى وضع ممتد بالكامل.
- إصلاح الطرف الخلفي الأيسر لكل أرنب في وضع ممتد.
- كطبقة أولى ، استخدم شريطا طبيا لتغطية جلد الأرنب من الفخذ إلى مفصل الكاحل.
- كطبقة ثانية ، لف شريطا رغويا على الوجهين بعرض 36 مم فوق الشريط الطبي ثم لف ضمادة بوليمر من الفخذ إلى مفصل الكاحل. تأكد من أن مفصل الركبة مستقيم 180 درجة وأن مفصل الكاحل مثني ظهريا بمقدار 60 درجة.
- كطبقة ثالثة ، شل حركة المفاصل بجبائر صغيرة في الجزء الأمامي والخلفي من مفاصل الركبة والكاحل ، ولف شبكة فولاذية حول الطبقة الخارجية للحماية من اللدغات. فضح أصابع الأرانب لمراقبة ما إذا كانت الدورة الدموية طبيعية.
- شل حركة لمدة 6 أسابيع لإنشاء نموذج KOA (الشكل 1).
ملاحظة: 1) أثناء إعداد النموذج ، افحص القوالب كل يوم. إذا كانت أي قوالب فضفاضة أو منفصلة ، فقم بتخدير الأرانب ، وأعد تثبيت الأطراف الخلفية اليسرى في وضع ممتد. 2) ضع حصائر واقية في قاع الأقفاص لمنع أطراف الأرانب من التعلق والتسبب في الإصابة.
2. تدخل بضع الوخز بالإبر
ملاحظة: قبل بدء التدخل بالإبر ، قم بتخدير الأرانب ب 3٪ من صوديوم بنتوباربيتال (30 مجم / كجم) عن طريق الحقن الوريدي بهامش الأذن.
- تحديد نقاط العلاج.
- حلق فرو مفصل الركبة للطرف الخلفي الأيسر للأرنب.
- جس مفصل الركبة الأرنب إدخال وتر العضلات الفخذية الإنسية ، وإدخال وتر الفخذ المستقيم ، وإدخال وتر العضلة ذات الرأسين الفخذية ، والجراب ذو القدم الأوز. بمناسبة التصلب المرضي للعضلات المحلية مع علامة الجلد المعقمة. تطهير مفصل الركبة ثلاث مرات مع جولات متناوبة من اليودوفور الطبي و 75 ٪ من الكحول الطبي.
- عملية بضع الوخز بالإبر
- حافظ على شفرة بضع الوخز بالوازي لاتجاه السفر الموازي للوتر والمحور الطولي للطرف.
- استخدم إبهام اليد اليسرى للضغط لأسفل على الجلد الداخل إلى نقطة العلامة والتحرك بشكل جانبي بحيث يتم فصل الأوعية الدموية والأعصاب على الجانب البطني من الإبهام.
- باستخدام مقبض بضع الوخز بالإبر في اليد اليمنى ، اضغط لأسفل بسرعة بقوة صغيرة حتى تمر شفرة بضع الوخز بالإبر على الفور عبر الجلد. تقدم شفرة بضع الوخز بالإبر ببطء إلى التصلب العضلي المحلي وقم بعمل جروح طولية وتأرجح جانبي.
- بعد اكتمال عملية بضع الوخز بالإبر ، قم بتطهير مفصل الركبة مرة أخرى وتطبيق ضمادة.
- قم بإجراء هذه العملية مرة واحدة في الأسبوع لمدة 4 أسابيع (الشكل 2).
ملاحظة: 1) إذا لم يكن هناك تصلب أو نسيج يشبه الحبل السري تم لمسه عند إدخال وتر الأسهر الإنسي أو الأسهر الجانبي أو المستقيم الفخذي أو العضلة ذات الرأسين الفخذية أو الجراب الأنسيرين ، فيجب استخدام إبرة بضع الوخز بالإبر لتحرير إدخالات الأوتار مباشرة. 2) أثناء التدخل بالإبر ، لا تشل حركة الأطراف الخلفية اليسرى للأرانب في مجموعة بضع الإبر والمجموعة النموذجية في وضع التمديد.
3. معامل مرونة عضلات الفخذ الفخذية
ملاحظة: 1) استخدمت هذه التجربة أداة التشخيص بالموجات فوق الصوتية للتصوير الإلستوجرافي بالموجات فوق الصوتية (SWE) في الوقت الفعلي لقياس معامل المرونة لعضلات الفخذ الرباعية في الجسم الحي في كل مجموعة من الأرانب. 2) يجب أن يكون المختبر أخصائي تخطيط بالموجات فوق الصوتية من ذوي الخبرة في الكشف عن الموجات فوق الصوتية. عند القياس ، يجب وضع مسبار الموجات فوق الصوتية برفق على سطح الجلد من عضلات الفخذ لتجنب توتر العضلات المحلية. يجب أخذ القياسات عندما يكون في حالة هادئة ، دون أن يكافح أو نشاط. إذا كان نشطا ، انتظر حتى يهدأ قبل إجراء الاختبار.
- حلق الفراء لكشف الجلد في منطقة عضلات الفخذ من الطرف الخلفي الأيسر.
- استخدم الموجات فوق الصوتية التقليدية ثنائية الأبعاد لتحديد موقع عضلات البطن الرباعية وتحديد منطقة الاهتمام (ROI) ، على عمق 1-2 سم.
- ابدأ وضع SWE للفحص.
- اضبط منطقة الاهتمام بشكل موحد على منطقة دائرية بقطر 2 مم ومنطقة الاهتمام بعمق ~ 0.5-1 سم من سطح الجلد.
- استخدم أداة التشخيص بالموجات فوق الصوتية لتوليد نبضة قوة الإشعاع الصوتي لتحفيز الأنسجة العضلية والحصول على التصوير الإلستوجرافي للأنسجة.
- انتظر حتى تستقر الصورة لمدة 2-3 ثوان ثم قم بتجميد الصورة. قم بتنشيط وظيفة Q-BOX للأداة لقياس معامل يونغ لعضلة الفخذ.
- انتظر حتى يقوم النظام تلقائيا بحساب القيم القصوى والدنيا والمتوسطة (الوحدة: KPa) لمعامل Young لعائد الاستثمار. حدد ثلاثة عائد استثمار بنفس العمق لثلاثة قياسات وخذ متوسط القيمة للتحليل الإحصائي.
ملاحظة: يجب أن يكون المختبر أخصائي تصوير بالموجات فوق الصوتية من ذوي الخبرة في الكشف عن الموجات فوق الصوتية. عند القياس ، يجب وضع مسبار الموجات فوق الصوتية برفق على سطح الجلد من عضلات الفخذ لتجنب توتر العضلات المحلية. يجب أخذ القياسات عندما يكون في حالة هادئة ، دون أن يكافح أو نشاط. إذا كان نشطا ، انتظر حتى يهدأ قبل إجراء الاختبار.
4. قياس قوة انقباض عضلات الفخذ الفخذية
ملاحظة: بعد قياس قوة انقباض عضلات الفخذ الفخذية ، تم القتل الرحيم للأرانب عن طريق انسداد الهواء تحت التخدير.
- تخدير الأرانب ب 3٪ بنتوباربيتال الصوديوم (30 مجم / كجم) عن طريق الوريد عند حافة الأذن. للتأكد من الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير ، ابحث عن منعكس القرنية الضعيف أو الغائب بشكل كبير وغياب الألم عند تثبيت الجلد بالملقط المرقئ. أثناء التخدير ، أضف 2-3 قطرات من مواد التشحيم إلى عيون الأرانب كل 15 دقيقة لمنع عيون الأرانب من الجفاف.
- كشف عضلات الفخذ وإرفاق محول التوتر.
- قطع الجلد تحت الرضفة ، على طول المحور الطولي للطرف صعودا إلى قاعدة الفخذ ، والاستمرار في قطع الجلد لأعلى بمقدار 3-4 سم. تقشر بعناية الجلد واللفافة ، وفضح العضلات. قطع الرباط الرضفي وفصل بعناية عضلات الفخذ من تقاطع الحرقفي ، والحفاظ على عضلات الفخذ في اتصال مع iliacium.
- ربط الغرز الجراحية عند تقاطع الوتر بين الرضفة وعضلة الفخذ. قم بتمديد العضلة إلى طولها الكامل في حالتها الطبيعية ثم قم بتوصيلها بمحول التوتر. حافظ على خط الربط على العضلة في خط مستقيم مع خط الربط على محول القوة.
- قم بتثبيت محول التوتر على الحامل. قم بتوصيل خط اكتساب الإشارة على محول التوتر بمعالج نظام اكتساب الإشارات الحيوية.
- قياس الأداء المقلص لعضلة الفخذ.
- أدخل الأقطاب الكهربائية الموازية لعضلات الفخذ وتجنب أي اتصال بين الأقطاب الكهربائية.
- اضغط على زر راسم الذبذبات. اضبط موضع محول القوة على الحامل للحفاظ على خط الأساس عند الصفر. حدد معلمات التحفيز للمحفز بعرض موجة 5 مللي ثانية وتأخير 10 مللي ثانية.
- استخدم محفزا واحدا أولا واضبط شدة التحفيز تدريجيا من الصفر بزيادة قدرها 0.1 فولت في كل مرة. راقب التغيرات في منحنى تقلص العضلات وسعة الانقباض حتى يتم تحديد الحد الأقصى لسعة الانقباض الفردي (Pt) لعضلات الفخذ. سجلها للإحصاءات اللاحقة.
- استخدم المثير العنقودي ، واستخدم سعة المثير التي تحفز أقصى سعة انكماش مفردة كخط أساس لتحفيز العضلات باستمرار وزيادة تردد المثير تدريجيا. راقب التغيرات في منحنى تقلص العضلات حتى يتم تحديد أقصى سعة تقلص (Pt) لعضلات الفخذ. سجلها للإحصاءات اللاحقة.
ملاحظة: 1) بعد كل تقلص عضلي ، يجب إعطاء العضلات 30 ثانية للاسترخاء مع تقطير محلول العضلات العازل باستمرار على العضلات. 2) أثناء العملية ، احكم على حالة التخدير من خلال مراقبة منعكس جفن الأرانب ، وإيقاع الجهاز التنفسي ، واسترخاء العضلات واستجابة قرص الجلد.
5. الأداء الميكانيكي لوتر عضلات الفخذ
- المعالجة المسبقة: في يوم الاختبار ، قم بقياس طول وعرض وسمك وتر عضلات الفخذ باستخدام الفرجار الورني ، وقم بتثبيت مشبك خاص مضاد للانزلاق في آلة اختبار التعب. كرر التحميل والتفريغ 15x للمعالجة المسبقة.
- اختبار استرخاء الإجهاد: استخدم المستشعر الذي يتراوح من 0 نيوتن إلى 100 نيوتن ، وقم بتمديده بسرعة 5 مم / دقيقة حتى يصل إلى الطول المطلوب ، ثم ابدأ في جمع البيانات. اضبط وقت الحصول على بيانات الكمبيوتر من t (0) ، وجمع البيانات كل 0.1 ثانية ، واستمر لمدة 1800 ثانية. بعد الوصول إلى الوقت المحدد ، قم بتسجيل البيانات والمنحنيات.
- اختبار الشد: استخدم المستشعر الذي يتراوح من 0 نيوتن إلى 100 نيوتن وقم بتمديده بسرعة 5 مم / دقيقة إلى أقصى حمل حتى يتم سحب العينة. بعد الاختبار ، احسب الحد الأقصى للإزاحة والحمل النهائي وصلابة العينة.
6. ضغط سطح ملامسة المفصل والضغط لكل وحدة مساحة من الغضروف
- إصلاح عينات عظم الفخذ والساق على كلا الجانبين في وضع مستقيم على المباراة وإجراء اختبار التحميل المسبق. قم بقياس النطاق التقريبي لمفصل الركبة ، وقم بقص الورق الحساس للضغط بنفس الشكل ، وختمه بغلاف بلاستيكي.
- ضع الورق الحساس للضغط المختوم بين مفاصل الساق وعظم الفخذ ، وقم بإجراء اختبار ضغط على مفصل الركبة بضغط 5 مم / دقيقة وضغط أقصى 50 نيوتن. حافظ على الضغط لمدة 2 دقيقة حتى يصل إلى 50 نيوتن عندما يكون الورق الحساس للضغط ملونا بثبات.
- بعد 2 دقيقة ، قم بإزالة الورق الحساس للضغط ، وثبت السطح الملون على ورقة بحجم A4 ، واحصل على صور مع وضع المقياس جانبا.
- قم بتحميل الصورة إلى الكمبيوتر. استخدم البرنامج المرجعي لقياس المساحة والقياس متعدد الأجزاء للأرقام غير المنتظمة. قياس الضغط على داخل وخارج مفاصل عظم الفخذ والساق وتسجيل النتائج.
7. Safranin O / تلطيخ أخضر سريع لغضروف مفصل الركبة
- بعد نهاية التدخل بالإبر ، خذ الأنسجة المعقدة للعظام الغضروفية تحت الغضروف وقم بتضمينها في البارافين. شريحة كتل الشمع الأنسجة المعدة وإعداد الشرائح. إزالة الشرائح الورقية المحضرة بمحلول إزالة الشمع البيئي (I) ومحلول إزالة الشمع البيئي (II) لمدة 15 دقيقة لكل منهما ؛ ثم قم بغمسها على التوالي في الزيلين والإيثانول اللامائي (1: 1) ، والإيثانول اللامائي (I) ، والإيثانول 95٪ ، والإيثانول 85٪ ، والإيثانول 75٪ ، 2-5 دقائق لكل خطوة ؛ وأخيرا ، انقعها في الماء المقطر لمدة 15 دقيقة.
- أداء تلطيخ.
- تلطيخ الشرائح بمحلول Fast Green لمدة 1 دقيقة. خلال هذه العملية ، أخرج الشرائح من المحلول وراقبها تحت المجهر حتى تصبح الأنسجة ملطخة باللون الأخضر الداكن.
- فصل اللون: اشطف محلول Fast Green الزائد بالماء عالي النقاء. نقع الشرائح بسرعة في محلول حمض الخليك 1 ٪ لمدة 5 - 10 ثوان. مرة أخرى ، شطف الشريحة بالماء عالي النقاء.
- قم بتلطيخ الشرائح في محلول Safranine O لمدة 10-15 دقيقة حتى يصبح الغضروف ملطخا باللون الأحمر.
- قم بتجفيف الأنسجة وتوضيحها ، وختم الشرائح الزجاجية ، ومراقبتها تحت المجهر.
- انقع الشرائح في 75٪ إيثانول و 85٪ إيثانول و 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول لمدة 3-5 ثوان متتالية.
- اغمس الشرائح في محلول إزالة الشمع البيئي (I) ومحلول إزالة الشمع البيئي (II) لمدة 10 دقائق متتالية. أخرج الشرائح وأسقط الوسط الراتنجي المحايد في مقدمة الشرائح ، وتجنب الأنسجة. ضع حافة غطاء الغطاء على الشريحة ثم ضعها ببطء لتغطية البلسم المحايد. قم بإزالة الهواء وتجنب فقاعات الهواء. امسح الزيلين الإضافي والبلسم المحايد ، واتركه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- مراقبة الشرائح تحت المجهر والحصول على الصور. لكل مجموعة ، حدد ست عينات من غضروف ركبة الأرنب وحدد عشوائيا أربعة حقول عرض مختلفة لكل عينة للتقييم. سجل أنسجة الغضروف لكل مجموعة وفقا لطريقة مانكين (الجدول 1).
8. التحليل الإحصائي
- التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (
± ثانية).
- إجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) واختبار LSD لتحديد الأهمية الإحصائية لمقارنات المجموعات المتعددة.
- ضع في اعتبارك الفروق ذات دلالة إحصائية عندما < P 0.05.