مقالة منهجية

تتبع الدهون الجديدة باستخدام وسم النظائر المستقرة LC-TIMS-TOF MS / MS

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65590

⸱

أغسطس 23, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

في هذه المقالة

ملخص

تظهر هنا طريقة لفحص التراكيب الليبيدة من خلال وضع العلامات على النظائر المستقرة باستخدام وقت الاحتفاظ بها وحركتها وتجزئتها.

الملخص

الليبيدات شديدة التنوع ، ويمكن أن يكون للتغيرات الصغيرة في هياكل الدهون وتكوينها تأثيرات عميقة على الوظائف البيولوجية الحرجة. يوفر وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) العديد من المزايا لدراسة توزيع الدهون وتعبئتها واستقلابها ، بالإضافة إلى تخليق الدهون من جديد . يتطلب التنفيذ الناجح لتقنية SIL إزالة التداخلات من الجزيئات الداخلية. في العمل الحالي ، نصف بروتوكولا تحليليا عالي الإنتاجية لفحص دهون SIL من العينات البيولوجية. سيتم عرض أمثلة على تحديد الدهون دي نوفو أثناء تطور مبيض البعوض. يسمح استخدام الكروماتوغرافيا السائلة التكميلية لقياس مطياف الحركة الأيونية المحاصرة وقياس الطيف الكتلي بالفصل وتخصيص الدهون من عينة واحدة في مسح واحد (<1 ساعة). يستفيد النهج الموصوف من التطورات الأخيرة في الاستحواذ المعتمد على البيانات والاكتساب المستقل للبيانات ، باستخدام التراكم المتوازي في فخ التنقل متبوعا بالتجزؤ المتسلسل والتفكك الناجم عن الاصطدام. يكشف قياس SIL على مستوى سلسلة الأحماض الدهنية عن تغيرات في ديناميكيات الدهون أثناء تطور المبيض للبعوض. يتم تعيين هياكل الدهون الجديدة بثقة بناء على وقت الاحتفاظ بها وحركتها ونمط تجزئتها.

المقدمة

عند تحليل بيانات الدهون ، يعد وضع العلامات على النظائر المستقرة (SIL) طريقة فعالة لتقييم المسارات الأيضية في الكائنات الحية. في هذه الطريقة، تستبدل الذرات الموجودة داخل المادة المراد تحليلها بنظائر مستقرة تحتوي على 13C أو 2H. يتم دمج هذه النظائر بشكل أكبر في السلائف ، والتي يتم تضمينها لاحقا داخل الأحماض الدهنية ، مع تسمية المناطق التي توجد فيها. باستخدام هذه النظائر ، يمكن للمرء تحديد توزيع الدهون واستقلابها ، لأنها ستتناقض مع الخلفية غير المسماة1. منصات قياس الطيف الكتلي الشائعة غير قادرة على تمييز الإشارة القادمة من الجزيئات الداخلية2. يتطلب نجاح SIL استخدام أدوات تحليلية فائقة الدقة. يسمح الكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطياف الحركة الأيونية المحاصرة عالية الدقة والتراكم المتوازي والتجزئة المتسلسلة ووقت الطيران (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) بفصل الأنواع الموسومة وغير الموسومة2. تتمثل ميزة تحليل LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS في أنه يمكن ترشيح إشارة MS من خلال وقت الاحتفاظ (RT) والتنقل ، وبالتالي تقليل التداخلات المحتملة للجزيئات الداخلية ، وكذلك القياس الكمي وفصل جميع الأنواعالمرغوبة 2. في TIMS ، يتم تثبيت الأيون أولا مقابل طور متنقل للغاز ثم يتم إطلاقه لاحقا وفقا لحركته. يوفر هذا مخططات نقل عالية الدقة أثناء التشغيل بجهد أقل من أجهزة IMSالسابقة 3. Mobilograms عبارة عن مخططات كتلية للشحن مقابل وقت الانجراف يمكن استخدامها للتمييز بين المركبات بناء على وقت الانجراف ومقدار التداخل4.

باستخدام تقنية PASEF إضافية ، تزداد سرعة التسلسل بشكل كبير دون التضحية بالحساسية5. تتضمن نظرية PASEF تراكم الأيونات متبوعة بإطلاقها المتسلسل بترتيب حركتها. يتم ذلك عن طريق تراكم الأيونات في محاذاة متوازية لحركتها. التراكم بهذه الطريقة يمنع فقدان الأيونات. علاوة على ذلك ، يحدث اختيار أيون السلائف في وقت واحد مع تراكم الأيونات وإطلاقها. وبهذه الطريقة، تختار PASEF سلائف متعددة على التوالي خلال كل مسح TIMS، بدلا من السلائف الفردية لكل مسح نموذجي لأداة TIMS التي لا تستخدم PASEF. عندما تتراكم أيونات السلائف بشكل متزامن وتطلق في قمم 2 مللي ثانية ضمن مسح TIMS يبلغ حوالي 100 مللي ثانية لكل إطار ، يتم تضخيم الإشارة بأكثر من ترتيب واحد من حيث الحجم ، وبالتالي زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء3. وتؤدي إضافة نظام PASEF إلى نظام TIMS إلى زيادة كفاءة نظام إدارة السلامة/الإدارة. وبما أن نظام TIMS-PASEF مقترن بنظام MS/MS ، فمن الممكن إجراء تجزئة أكثر كفاءة. وخلافا للكشف التقليدي عن MS/MS، تضغط إشارة السلائف من TIMS-PASEF، وتكتشف أيونات الشظايا في وقت واحد مع وقت الشطف TIMS وموضع الحركة الأيونية للسلائف3.

عند الحصول على البيانات من مطياف الكتلة ، هناك خيارات في وضع المسح المطلوب. يحدد الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) أيونات السلائف من فحص MS1 بناء على وفرتها ، قبل تجزئتها وإجراء فحص MS2. يعمل وضع المسح هذا على تجزئة أكبر عدد ممكن من السلائف. نهج DDA مستهدف ، وستعتمد النتائج على اختيار الأيونات3. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه DDA-PASEF مشاكل في قابلية التكرار بين النسخ المتماثلة. في حين أن DDA هي أداة رائعة في التحليل المركز ، فإن المخاليط المعقدة تواجه صعوبة أكبر في الحصول على بياناتها6. وذلك لأنه يمكن مراقبة كمية صغيرة فقط من الأيونات في وقت واحد3. الحصول على البيانات المستقلة (DIA) هو طريقة يتم فيها تجزئة النوافذ المحددة مسبقا من m / z بشكل مستقل عن شدتها ، ويتم مسحها جميعا ضمن النطاق7. باستخدام وضع المسح هذا ، تنتقل السحب الأيونية بأكملها من IMS إلى مطياف الكتلة3. في دراسات البروتينات ، ينتج عن هذا كميات أكبر من البروتينات التي يتم قياسها كميا في فترة زمنية أقصر مقارنة ب DDA. بالإضافة إلى ذلك ، يفتقد DIA عددا أقل من قيم m / z مقارنة ب DDA. لذلك ، أظهر هذا البديل تحسينات كبيرة في استنساخ البيانات في نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقياس الكمي بشكل أفضل من DDA. في هذا العمل الحالي ، هدفنا هو تنفيذ DIA بالطريقة التي أبلغ عنها Tose et al.2. قمنا بتحسين قابلية استنساخ الإشارات وشدتها ، مما أسفر عن معلومات أكثر وأكثر حسما حول تعبئة دهون SIL وتوزيعها واستقلابها في العينات البيولوجية مستفيدين من اكتساب DDA و DIA.

البروتوكول

1. إعداد العينة

  1. تشريح الحشرات
    1. تشريح مبيض البعوضة Aedes aegypti عندما يبلغ عمرها 7 أيام في محلول ملحي مخزن بالفوسفات باستخدام الإبر الدقيقة.
    2. اجمع ثمانية مبايض من محلول ملحي مخزن بالفوسفات باستخدام الإبر الدقيقة واحفظها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل عند -80 درجة مئوية.
    3. جمع المبايض في النسخ المتماثلة البيولوجية.
  2. استخراج الدهون
    1. أضف 10 ميكرولتر من المعيار الداخلي (ISTD) إلى المبايض الثمانية التي تم جمعها بتركيز 1 جزء في المليون. ISTD هو خليط دهني مسمى مع سبعة ديوتيريوم من 1-بنتاديكانويل-2-أوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوكولين-D7 (15: 0-18: 1 (D7) PC) ، ليسوفوسفاتيديل كولين-D7 (18: 1 (D7) Lyso PC) ، 1-بنتاديكانويل -2-أوكتاديسينويل - جليسيرو -3-فوسفو إيثانولامين - D7 (15: 0-18: 1 (D7) PE) ، 1-أوليويل -2-هيدروكسي SN-glycero-3-فوسفو إيثانولامين - D7 (18: 1 (D7) Lyso PE) ، 1-بنتاديكانويل -2-أوليويل SN-glycero-3-فوسفوينوسيتول-D7 (15: 0-18: 1 (D7) PI) ، 1-بنتاديكانويل -2-أوليويل SN-glycero-3-phospho-L-serine-D7 ( 15: 0-18: 1 (D7) PS) ، 1،2-ديبنتاديكانويل -3-أوكتاديسينويل-SN-جلسرين (15: 0-18: 1-15: 0 (D7) TAG) ، 1-بنتاديكانويل -2-أوكتاديسينويل) -sn-جلسرين - D7 (15: 0-18: 1 (D7) DAG) ، 2-أوكتاديسينويل-sn-جلسرينول-D7 (18: 1 MAG (D7)) ، كوليستيريل أوليات-D7 (18: 1 (D7) تشول استر).
    2. انتظر حتى يجف في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من البيوتانول / الميثانول و 3 ميكرولتر من هيدروكسي تولوين البوتيل. تجانس يدويا لمدة 10 ثوان مع مدقات البولي بروبلين 1.5 مل.
    3. اشطف المدقة ب 200 ميكرولتر من البيوتانول / الميثانول واخلطها مع المحلول المتجانس.
    4. قم بتسخين أنبوب الطرد المركزي الدقيق في درجة حرارة الغرفة والطاقة المتوسطة لمدة 30 دقيقة.
    5. أنابيب الطرد المركزي عند 1600 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. انقل المادة الطافية إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية باستخدام 300 ميكرولتر من إدخالات الزجاج المخمل.

2. إعداد الصك

  1. إعداد المرحلة المتنقلة
    1. تحضير الطور المتحرك بتركيبة 30:40:30 (المرحلة المتنقلة A) و 10:5:85 (المرحلة المتنقلة B) باستخدام الأسيتونيتريل والماء والأيزوبروبانول كنسبة لكل منها. في كلتا المرحلتين المتنقلتين ، أضف 10 مليمول / لتر فورمات الأمونيوم في الماء و 0.1٪ حمض الفورميك لخلق حالة عازلة.
    2. وزن 3.15 غرام من فورمات الأمونيوم في 10 مل من الماء. أضف 500 ميكرولتر من هذا المحلول في 12.5 مل من الماء. بالتسلسل ، ضع في دورق حجمي سعة 250 مل واملأه بالإيزوبروبانول إلى حوالي 2/3 من القارورة. تخلط عن طريق الدوامة.
    3. أضف 250 ميكرولتر من حمض الفورميك (85٪) ، واملأ 25 مل من الأسيتونيتريل والأيزوبروبانول إلى خط تعبئة 250 مل ، واخلطها.
  2. في نظام MS ، على الجانب الأيسر من الشاشة في إعدادات MS ، حدد نطاق الكتلة عن طريق تحديد 50 كحد أدنى و 1850 كإعداد المسح الأقصى.
    1. حدد القطبية كوضع أيون موجب. حدد وضع المسح الضوئي ك DIA-PASEF. للقيام بذلك، حدد ضبط وفتح طريقة التحليل من أسلوب DDA سابق مع معلمات LC التالية.
      1. لفصل التدرج:
        حقن العينة: 0٪ ب ، وقت الانتظار 1 دقيقة.
        زيادة إلى 55 ٪ B ، وعقد حتى 6.4 دقيقة.
        زيادة إلى 65 ٪ B ، وعقد حتى 24 دقيقة.
        زيادة إلى 88٪ B ، استمر حتى 40.8 دقيقة.
        زيادة إلى 95٪ B ، استمر حتى 48.1 دقيقة.
        انخفاض إلى 35 ٪ B ، وعقد حتى 56 دقيقة.
        انخفاض إلى 0 ٪ B ، وعقد حتى 60 دقيقة.
      2. لظروف HPLC:
        حجم الحقن: 5 ميكرولتر
        معدل المذيبات: 0.25 مل / دقيقة
        إجمالي وقت التشغيل: 60 دقيقة ، حيث يتم وضع 5 دقائق لتهيئة العمود مسبقا.
      3. قم بإعداد الكروماتوجراف السائل عن طريق إدخال العمود في الكروماتوجراف السائل. قم بتشغيل فراغ لتنظيف العمود واختبار التسريبات. يمكن ملاحظة ذلك في الجهاز الذي لا يحمل الضغط أو التدفق.
  3. لإنشاء طريقة جديدة، قم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه (الشكل 1 و الشكل 2).
    1. افتح البرنامج وانقر على توصيل جميع الأدوات. إذا نجح الاتصال ، فسيصدر نظام LC صوتا مرة واحدة ، وتسرد شاشة التحكم HyStar في مربع الحالة دون أي رسائل خطأ.
    2. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ . في Sample Table Navigator، ابحث عن القائمة المنسدلة علامة وحدد طريقة سابقة.
    3. ضاعف أحدث جدول عينة. انقر فوق حفظ باسم ... واحفظ قائمة عينات جديدة بالتنسيق: YYYYMMDD_LIP_C30_ (XXXX) حيث (XXXX) هو واصف قصير للتحليل.
    4. انقر بزر الماوس الأيمن على طريقة الفصل وانقر فوق طريقة التحرير. انقر فوق طريقة تحرير الوحدة.
    5. انقر فوق تنزيل. إذا نجحت ، فسيظهر نجاح التنزيل. أغلق الشاشة بدون طريقة الحفظ.
    6. ضمن إعدادات MS ، انتقل إلى إعدادات TIMS ، وحدد 1 / k0 تبدأ عند 0.70 وتنتهي 1 / k0 عند 1.85. اضبط وقت المنحدر على 150 مللي ثانية. مع هذا ، يتم ضبط دورة العمل ومعدل المنحدر تلقائيا.
    7. في النافذة السفلية ، حدد علامة التبويب المصدر . حدد نوع المصدر ك ESI واضبط إزاحة لوحة النهاية على 800 فولت والشعيرات الدموية على 4500 فولت. تحقق من صندوق البخاخات واضبط الضغط على 4.0 بار. اضبط الغاز الجاف على 4.0 لتر / دقيقة ودرجة الحرارة الجافة على 250 درجة مئوية.
    8. على يسار علامة التبويب المصدر، حدد علامة التبويب ضبط. انقر فوق علامة التبويب الفرعية العامة وتحت عنوان النقل تأكد من المعلمات التالية:
      انحراف 1 دلتا: 70 فولت
      قمع 1 RF: 250 vpp
      طاقة isCID: 0 فولت
      قمع 2 RF: 250 vpp
      متعدد الأقطاب RF: 500 vpp.
      1. تحت عنوان خلية التصادم ، تأكد من المعلمات التالية:
        طاقة الاصطدام: 6.0 فولت
        تصادم RF: 1200 vpp.
      2. تحت العنوان الرباعي ، تأكد من المعلمات التالية:
        الطاقة الأيونية: 6 فولت
        كتلة منخفضة: 250 م / ض.
      3. ضمن علامة التبويب قبل التركيز TOF ، تأكد من المعلمات التالية:
        وقت النقل: 45 μs
        تخزين ما قبل النبض: 5.0 ميكروثانية.
    9. انقر فوق علامة التبويب الفرعية المعالجة . تحت الكشف عن ذروة أطياف الكتلة ضمان المعلمات التالية:
      العتبة المطلقة: 667
      الحد المطلق (لكل 100 مللي ثانية AccuTime): 445.
      1. تحت اكتشاف ذروة التنقل ، تأكد من المعلمات التالية:
        العتبة المطلقة: 30.00.
    10. انقر فوق علامة التبويب الفرعية TIMS . ضمن علامة التبويب الإزاحات ، تأكد من المعلمات التالية:
      Δt1: -20 فولت
      Δt2: -150 فولت
      Δt3: 70 فولت
      Δt4: 150 فولت
      Δt5: 0 فولت
      Δt6: 150 فولت
      خلية الاصطدام: 300 فولت.
    11. على يسار علامة التبويب اللحن ، انقر فوق علامة التبويب MS / MS . تحت علامة التبويب أيونات السلائف تأكد من المعلمات التالية:
      عدد منحدرات PASEF: 8
      الحد الأدنى للشحن: 1
      الحد الأقصى للشحن: 1.
      1. ضمن علامة التبويب جدولة، انقر فوق خيارات متقدمة وتأكد من المعلمات التالية:
        الشدة: 0,1500 ، 5000 ، 10000
        التكرار: 1 ، 10 ، 5 ، 1
        عتبة الشدة: 1500.
      2. ضمن علامة التبويب الاستبعاد النشط ، تأكد من المعلمات التالية:
        علامة اختيار الاستبعاد النشط
        الإصدار بعد: 0.4 دقيقة.
      3. ضمن إعدادات طاقة الاصطدام ، تأكد من المعلمات التالية:
        K0 (V-s / سم3): 0.70 ، 1.60
        طاقة الاصطدام (فولت): 20.00 ، 35.00.
      4. ضمن إعدادات عرض العزل ، تأكد من المعلمات التالية:
        الكتلة (م / ض): 622 ، 1222
        العرض (م / ض): 1.00 2.50.
    12. إعداد DIA -PASEF: حدد DIA-PASEF من وضع مسح إعدادات MS على اليسار. ضمن علامة التبويب MS / MS ، حدد محرر النوافذ. هنا ، تأكد من المعلمات التالية (الشكل 3):
      إعدادات النافذة: عرض الكتلة: 50 دا ؛ تداخل الكتلة: 0.0 دا ؛ احسب من المضلع: خطوات الكتلة ؛ عدد نوافذ التنقل: 1.

3. المعايرة

  1. معايرة الأدوات (الشكل 4)
    1. ضمن علامة التبويب الفرعية المعايرة ، انقر فوق m / z ، وحدد Tuning Mix من المربع المنسدل وانقر فوق معايرة في الزاوية اليمنى السفلية.
    2. استمر في النقر فوق معايرة حتى يتم تحقيق درجة 100٪.
    3. الآن حدد علامة التبويب التنقل واتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه حتى يتم الوصول إلى درجة المعايرة بنسبة 100٪.
  2. منحنى المعايرة
    1. خليط قياسي داخلي من الدهون مع 10 ميكرولتر من الخليط القياسي الداخلي المثنى.
      استخدم سبع نقاط معايرة من 0.1-500 نانوغرام / مل من الخليط القياسي مع 10 ميكرولتر من الخليط القياسي الداخلي المخفف.
    2. قم بالتعليق يدويا على سلاسل الأحماض الدهنية بناء على أنماط PASEF MS / MS الموضحة بالفعل في2.
  3. كفاءة وضع العلامات SIL
    1. احسب نسبة مساحة النظائر المحتوية على SIL إلى مساحة النظائر غير المحتوية على SIL.
    2. احسب باتن النظرية عن طريق تحديد احتمال العثور على ذرة مسماة أي موقع.
    3. احسب إثراء SIL عن طريق ملاءمة ملفات تعريف النظائر التجريبية مع النمط النظري المحاكي في برنامج تحليل البيانات.
  4. بدء التشغيل
    1. قم بتنشيط الفرن العمودي بالنقر فوق ميزان الحرارة زر. قم بتنشيط المضخات بالنقر فوق زر الصمام .
    2. قم بتعيين طريقة MS على الطريقة المحفوظة مسبقا. تحقق من أن حجم الحقن هو 5 ميكرولتر وأن الخط 1 سيستهدف القارورة 20: 1.
    3. تأكد من أن القارورة 20: 1 تحتوي على 50٪ IPA / ACN. حفظ قائمة العينات.
    4. ابدأ التسلسل وتحقق من إجراء حقنة ناجحة (تؤكدها رسالة معروضة على النظام تفيد بالحقن).
    5. انسخ السطر 1 والصقه أدناه لإنشاء سطر جديد. املأ السطر 2 بعينات حسب التجربة الحالية. تأكد من استخدام الموضع الصحيح في أخذ العينات التلقائي.
    6. إذا كانت المرحلة المتنقلة جديدة ، فقم بإجراء اختبار شكل الذروة أولا عن طريق حقن معايير خليط الدهون من الشركة المصنعة. قارن مع النتائج السابقة. 2 المعايير عبارة عن خليط دهني من 1-بنتاديكانويل-2-أوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوكولين (15: 0-18: 1 PC) ، ليسوفوسفاتيديل كولين (18: 1 Lyso PC) ، 1-بنتاديكانويل -2-أوكتاديسينويل جليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين (15: 0-18: 1 PE) ، 1-أوليويل -2-هيدروكسي-SN-جليسيرو-3-فوسفو إيثانولامين (18: 1 Lyso PE) ، 1-بنتاديكانويل -2-أوليويل SN-glycero-3-فوسفوينوسيتول (15: 0-18: 1 PI) ، 1-بنتاديكانويل-2-أوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفو-إل-سيرين (15: 0-18: 1 PS) ، 1،2- ديبنتاديكانويل-3-أوكتاديسينويل-سن-جلسرين (15: 0-18: 1-15: 0 TAG) ، 1-بنتاديكانويل-2-أوكتاديسينويل) -sn-جلسرين (15: 0-18: 1 DAG) ، 2-أوكتاديسينويل-سن-جلسرين (18: 1 MAG) ، كوليستيريل أوليات (18: 1 تشول استر).
    7. تأكد من أن الأسطر الجديدة لها طريقة الفصل الصحيحة وليس طريقة التهيئة المسبقة المستخدمة في السطر 1. تأكد من صحة طريقة MS (طريقة اليوم الحالي).
    8. تحقق من تحميل أسلوب المعالجة الصحيح وتمكين تشغيل العملية التلقائية .
    9. احفظ قائمة النماذج للتأكد من تحليل العينات بعد انتهاء التشغيل الحالي.

4. تحليل البيانات

  1. برنامج تحليل البيانات المفتوحة (الشكل 5). في الزاوية اليسرى العليا ، انقر فوق الزر "ملف " وحدد فتح ...
  2. حدد الملفات التي تختارها. انقر بزر الماوس الأيمن على اسم الملف وحدد خصائص.
    1. حدد حالة المعايرة (الشكل 6). في المربع المنسدل، حدد المعايرة الأولية لمطياف الكتلة. تأكد من أن جميع الأخطاء أقل من 1 جزء في المليون.
    2. بعد ذلك ، حدد معايرة التنقل الأولية وتأكد من أن الخطأ أقل من 1 جزء في المليون.
    3. انقر بزر الماوس الأيمن على Chromatogram وحدد تحرير Chromatogram (الشكل 6C). في النوع، انقر فوق المربع المنسدل وحدد مخطط كروماتوجرام الأيونات المستخرج (الشكل 6D). ضمن عامل التصفية ، حدد All MS ومع وضع المسح الضوئي ، حدد الكل. هذا لعرض قمم الجزيء محل الاهتمام بدلا من شظاياه فقط.
      1. يوجد أدناه خياران للمرشح لاختيار الجزيئات: الكتل أو الصيغة. إذا تم اختيار الكتل ، يمكن للمرء اختيار m / z النظري للجزيئات ذات الاهتمام. لهذه الحالة حدد 829.7985 م / ض. إذا تم تحديد الصيغة ، يمكن للمرء اختيار صيغة الجزيء بالإضافة إلى الأشكال الأيونية التي تهم الكروماتوجرام. في هذه الحالة ، حدد الأمونيوم [M + NH4]. ويرجع ذلك إلى المخزن المؤقت للأمونيوم في المرحلة المتنقلة التي ستفضل التأين في هذا الشكل الأيوني (الشكل 7).
      2. للعرض حدد ±1. للقطبية تأكد من أنه يحافظ على الوضع الإيجابي. ضمن التنقل ، حدد 1.455-1.465. يتم ذلك لتصفية أي جزيئات لا تندرج ضمن هذه القيم وعزل الجزيء محل الاهتمام.
  3. بمجرد تحديد المعلمات ، انقر فوق إضافة > موافق في أعلى اليمين. بعد فترة قصيرة من الوقت ، سيقوم البرنامج بمعالجة التحديدات وإخراج مخطط كروماتوغرامي.
  4. انقر بزر الماوس الأيمن على خط الأساس في بداية ذروة الاهتمام واسحب أثناء الضغط على نهاية الذروة. سيوفر هذا التكامل اليدوي طيفا جماهيريا حيا من الأجزاء خلال وقت الاحتفاظ هذا.
  5. موبيلوجرام
    1. انقر بزر الماوس الأيمن على يسار الشاشة على Mobilogram وحدد تحرير Mobilogram (الشكل 8). ستظهر نافذة باسم تحرير آثار Mobilogram. اتبع نفس الخطوات C.e.i.1 إلى C.e.i.5 (الشكل 9).
    2. في وقت الاحتفاظ ، أدخل وقت الاحتفاظ بذروة الاهتمام. في هذه الحالة ، 37.45-37.55 دقيقة.
    3. بمجرد تحديد المعلمات ، انقر فوق إضافة > موافق في أعلى اليمين. بعد فترة قصيرة من الوقت ، سيقوم البرنامج بمعالجة التحديدات وإخراج مخطط كروماتوغرامي.
  6. بالنسبة للأيونات المستخرجة، كرر الخطوات 4-2-3-1-4-3-2-2 حتى تتكون قائمة بالأيونات.
  7. في الجزء السفلي من نافذة MS ، حدد ملف تعريف MS وجزء MS. سيسمح ذلك بعرض طيف الأيونات من المسح الكامل و PASEF.
    1. في عرض الطيف ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد نسخ الأطياف المركبة. باستخدام بيانات الطيف التي تظهر على اليمين ، يمكن للمرء العثور على مزيد من المعلومات حول مركب الشخص مثل دقة حل القدرة والشدة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N; الشكل 10).
  8. تجهيز
    1. لمعالجة البيانات ، قم بدمج الكروماتوجرام وقمم التنقل يدويا للحصول على معلومات قيمة عن الجزيء محل الاهتمام (الشكل 10).
    2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق بحث وحدد دمج الكروماتوجرام فقط أو مخطط الحركة (الشكل 11). انقر بزر الماوس الأيسر وقم بتمييز الذروة المطلوبة. تتضمن هذه المعلومات وقت الاحتفاظ والمنطقة و S / N والتنقل.

النتائج

يسهل وضع العلامات على النظائر المستقرة تصور الدهون الثلاثية في دراسات ديناميات الدهون لمبيض البعوض الأنثوي. في مجال التنقل ثنائي الأبعاد ، يتم عرض الدهون الثلاثية 48: 1 في منطقة ذات وقت احتفاظ محدد فيما يتعلق بالتنقل 1 / K0. يمكن تصور شدة الدهون الثلاثية بخط أزرق أغمق. تمثل البقع الأخرى الدهون الثلاثية الإضافية الموجودة داخل المبيض. تختلف أوقات الاحتفاظ والتنقلات بسبب الاختلافات في الكتل والهياكل ، وبالتالي تظهر في مناطق مختلفة من الرسم البياني. هذه الاختلافات أساسية عند التمييز بين الدهون الثلاثية في العينة (الشكل 12 أ ، ب). يعرض إسقاط الطيف الكتلي المضخم للمنطقة أيون ثلاثي الجليسريد 48: 1 مقترنا بأيون الأمونيوم عند 822 م / ض. يتم أيضا تصور الدهون الثلاثية الأخرى ، مثل 50: 2 و 52: 3 ، ولكن في مناطق m / z الأعلى بسبب الاختلافات في البنية والحجم والتجزئة (الشكل 12C ، D). في هذا المثال، كنا مهتمين بتحليل نظائر الديوتيريوم الموسومة. تم تضخيم منطقة TG 48: 1 بشكل أكبر لتصور الأيونات الموسومة نظائريا. مع زيادة كمية الديوتيريوم على الأيون ، تقل شدة القمة. يحدث هذا نظرا لوجود عدد أقل من الأيونات الموسومة بالديوتيريوم العالية. تزداد نسبة m / z قليلا مع كل إضافة للديوتيريوم بسبب زيادة الكتلة. ستحدد هذه الشدة أيضا كمية كل نظير موجود داخل العينة.

عند تقييم شدة الشظايا في الطيف الكتلي ، يجب على المرء مقارنة النظائر غير الموسومة مع تلك الموسومة ب 2H (الشكل 12E). باللون الأزرق هي الكثافة غير المسماة مع الخطوط السوداء المتقطعة كشدة نظرية. باللون الأحمر ، لوحظت النتائج المسماة بالنظير. تظهر شدة أكبر من كل من الشدة غير المسماة والنظرية. وينتج عن إثراء الأنواع بوضع العلامات النظيرية كثافة أكبر من الأنواع النظرية غير الموسومة. تسمح الشدة الأكبر بتصور الدهون الثلاثية بسبب التناقضات في المنطقة. يلعب التجزئة أيضا دورا رئيسيا في تحديد الدهون ، حيث سيوفر PASEF تجزؤا متزايدا مقارنة بالمسح الكامل MS / MS. وذلك لأن الأحماض الدهنية في سلاسل الدهون قد تتفتت في أنماط مختلفة ، وبالتالي فإن الخطوط في الأطياف تظهر شدة الشظايا بناء على عملية تجزئة الدهون الثلاثية (الشكل 12F). يوفر هذا معلومات تركيبية عن الأحماض الدهنية ويساعد على تحديد أيزومر النوع الموجود. عند تحليل البيانات من طريقة DIA ، سيزداد عدد الأجزاء ، مما يؤدي إلى فحص MS / MS أفضل وتحديد متفوق مقارنة بطريقة DDA النموذجية.

figure-results-1
الشكل 1: الشاشة الرئيسية النموذجية للبرنامج. تسمح الشاشة الرئيسية بإنشاء الطريقة وبدء تشغيل الأداة. ( أ) شاشة برمجية تحتوي على إعدادات التحكم في نظام TIMS و MS/MS. في الجزء السفلي من الشاشة توجد علامة تبويب المصدر لتحرير عناصر التحكم هذه على الأداة. ( ب) شاشة البرنامج مع فتح علامة تبويب الضبط. (ج) هنا، يمكن إعداد الآلة للضبط العام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: شاشة البرنامج مع فتح علامة تبويب اللحن. هنا يمكن للمرء تحرير معلمات ضبط المعالجة. ( A) شاشة البرنامج مع فتح علامة تبويب الضبط. هنا يمكن للمرء تحرير معلمات اللحن لجزء TIMS من الأداة. ( ب) شاشة البرنامج مع تحديد علامة التبويب MS/MS في أسفل الشاشة. (ج) هنا يمكن تحرير معلمات مطياف الكتلة الترادفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: شاشة لاختيار عرض نافذة DIA-PASEF. هنا يمكن للمرء تحرير الألوان من أجل الوفرة وكذلك تحرير حجم النوافذ للحصول على البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: معايرة مطياف الكتلة حسب نسبة الكتلة إلى الشحنة (m / z). يتم تحديد قائمة المراجع للمعايرة. ( أ) في أسفل اليسار، يتم النقر على زر المعايرة حتى تظهر قيمة مقبولة. معايرة مطياف الحركة الأيونية عن طريق التنقل. يتم تحديد قائمة المراجع للمعايرة. (B) في أسفل اليمين، يتم النقر على زر المعايرة حتى تظهر قيمة مقبولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: شاشة رئيسية نموذجية لبرنامج تحليل البيانات. لفتح ملف ، يتم النقر فوق الزر "ملف " العلوي الأيسر ليظهر المربع المنسدل مع ظهور الخيارات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: برنامج تحليل البيانات. شاشة البرنامج تؤكد المعايرة الناجحة مع (A) كيفية تحديد نتائج المعايرة و (B) تحديد فئة المعايرة. ج: اختيار مخطط كروماتوجرام لتحليله، د: اختيار كروماتوجرام أيوني مستخلص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: شاشة منبثقة. نافذة منبثقة لاختيار واستخراج مخطط كروماتوجرام الأيونات بواسطة مرشح الكتلة (A) ومرشح الصيغة (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: برنامج تحليل البيانات. شاشة البرنامج حيث على اليسار ، يتم تحديد مخطط متحرك للتحليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: شاشة منبثقة لمخطط موبيلوجرام. نافذة منبثقة لاختيار مخطط متحرك أيوني مستخرج بواسطة (A) مرشح الكتلة و (B) مرشح الصيغة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10
الشكل 10: شاشة تحليل البيانات. (أ) شاشة البرامج؛ يمكن للمرء المميز على اليسار تشكيل قائمة أيون مستخرجة. (ب) شاشة تحليل البيانات حيث يتم تحضير طيف مركب من الأيونات المستخرجة في الأسفل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-11
الشكل 11: شاشة تحليل البيانات. شاشة البرنامج توضح نتائج التكامل اليدوي للأطياف المركبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-12
الشكل 12: نتيجة LC-TIMS MS. (A) يمكن رؤية LC-TIMS MS بعد 4 أيام من تغذية 2حمية السكروز الموسومة H ومبيض الحشرات في مجال التنقل ثنائي الأبعاد. (B) إسقاطات MS النموذجية للإشارة المقابلة ل TG 48: 1 و TG 50: 2 و TG 52: 3 من العينة الموسومة. (ج) تضخيم منطقة MS 822-827 m/z التي تشير إلى ملف تعريف TGs الموسوم. (د) إيلاء اهتمام خاص لقمم MS باللون الأحمر يتم تضخيم ملف تعريف النظائر. (إ-و) يتم تمييز ملف تعريف النظير المسمى 2H باللون الأحمر ؛ يتم تمييز ملف تعريف النظائر غير المسمى أدناه باللون الأزرق. يشار إلى ملامح النظائر النظرية كخطوط شرطة (13C باللون الأسود; 2H باللون الأخضر). يتم أيضا عرض بنية محتملة للدهون الثلاثية 48: 3 في أعلى اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

عند تقييم استخدام هذا البروتوكول ، من الضروري التأكد من أن معلمات DIA-PASEF و MS / MS قابلة للتطبيق على الدهون الثلاثية المعنية. على وجه التحديد ، يجب أن تتبع نوافذ التنقل وعرض النافذة نمط الدهون الثلاثية. يمكن تحديد ذلك من خلال تشغيل سابق باستخدام طريقة DDA. عند تتبع الدهون الثلاثية في المعيار الداخلي ، يجب أن تغطي نوافذ إعداد DIA جميع الجزيئات المحددة مسبقا ذات الأهمية. يجب أن تكون جميع النوافذ متساوية الأحجام ، وتقع النطاقات ضمن m / z و 1 / k0 من المركبات المرغوبة (الشكل 7). مع التحجيم غير الصحيح للنوافذ ، سيتم تخطي الأيونات المراد تجزئتها وسيكون لأطياف العائد قابلية استنساخ أقل. بشكل أساسي ، بدون التحسين المناسب لنطاق النافذة في علم الدهون ، لن تعزز نتائج DIA بيانات DDA. يجب أن تمثل النوافذ شكلا متدرجا لعملية الحصول على البيانات. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب تغيير المعلمات بين نافذة DIA-PASEF التي تم إعدادها لتكون ممثلة لملف تعريف الدهون الكامل. بدون هذه الخطوة ، سيتم حذف الأحماض الدهنية الحرجة من البيانات المكتسبة.

تشمل القيود الآلية في الغالب تلك التي تأتي مع طرق LC-MS. يتضمن ذلك قيود تعدد الإرسال في عرض الذروة. لذلك ، يجب أن يكون هناك تحسين في ذروة الشطف من أجل كمية مناسبة ، وتعزيز الانتقائية أثناء الحصول على البيانات. عادة ، هذا مع السلائف المختارة مثل DDA. ومع ذلك ، مع DIA ، لا يتم اختيار السلائف ، وبالتالي المخاطرة بالقيود في انتقائية الأدوات8. في حين أن أساليب DIA توفر تجزؤا متزايدا ، لا تزال هناك قيود. وأبرز القيود هو الحد من انتقائية السلائف. نوافذ طريقة DIA أعرض من 5 إلى 10 مرات من طريقة DDA النموذجية. وبالتالي، فإنه في حين يسمح بمزيد من التجزؤ، فإنه يمكن أن يقلل من دورة العمل والاقتناء المتسلسل. يمكن ملاحظة ذلك في مطياف الكتلة الذي يستخدم رباعي القطب. نظرا لعدم وجود اختيار للسلائف والأيونات التي يجب تجزئتها ، يتم تدوير نوافذ العزل الثابتة بالتتابع لتغطية نافذة m / z. نظرا لأن النافذة أكبر بكثير من طريقة DDA النموذجية ، يجب على المرء استخدام نطاقات أوسع لمحاولة اكتساب الحساسية9. وبالتالي فإن المشكلة في الاستحواذ التسلسلي تقلل من الحساسية. القيد الثاني ينطوي على إنشاء مكتبة. إنها تستغرق وقتا طويلا وتتطلب كميات كبيرة من العينات لصياغتها. بينما يمكن استخدام المكتبات الخارجية ، قد تختلف أنماط التجزئة بين الظروف التجريبية والأجهزة10.

عند تحليل بيانات الدهون باستخدام وسم النظائر المستقرة ، من الضروري تقليل التداخل من الجزيئات الأخرى الموجودة في الكائن الحي. يتم ذلك باستخدام أدوات تحليل عالية الدقة مثل LC-TIMS-TOF-MS /MS 2. في الوقت الحالي ، لا يزال استخدام هذه الأدوات عالية الدقة لفصل النظائر الموسومة عن ضوضاء الخلفية جديدا جدا مقارنة بالطرق التقليدية. تنفذ الاعتبارات الآلية التقليدية الفصل بواسطة كروماتوغرافيا الغاز متبوعة بالتأين الكيميائي أو الإلكتروني. وهذا يسمح إما بالاشتقاق الكيميائي مع بروميد خماسي فلورو بنزيل أو التجزئة من تأين الإلكترونات. في الآونة الأخيرة حيث يتم استخدام LC-MS في الدراسات النظيرية. ويتيح استخدام مطياف الكتلة العالي الاستبانة دقة عالية للكتلة والقدرة على إجراء دراسة متعددة التتبع باستخدام علامات نظيرية متعددة بدلا من نظير واحد. بدون الدقة العالية للأداة ، لن يتمكن المرء من التمييز بين درجات وضع العلامات المختلفة مثل 13C2 و 13C. وهذا يسمح بزيادة المعلومات من تشغيل واحد مقارنة بالأجهزة التقليدية ذات الدقةالمنخفضة 10.

في حين أن DIA لديها قابلية استنساخ أفضل من DDA ، يمكن مقارنة طرق الحصول على البيانات الناشئة الأخرى. استراتيجيات DIA-DDA الهجينة مثل p-SMART قادرة على الجمع بين نقاط القوة في كل طريقة للحفاظ على قدر كبير من الكشف والكمية، مع الحفاظ على المستوى العالي من التحليلات النوعية المستهدفة. في هذه الطريقة ، يمكن أن يؤدي استخدام أيون منتج واحد مطابق إلى زيادة حساسية DIA وانتقائيتها ، حيث سيؤدي ذلك إلى تضييق نوافذ DIA مقارنة بنهج واسع غير مستهدف8. في علم الدهون ، يمكن أن يختلف هيكل الدهون الثلاثية مع التركيب الأيزومري. يسمح PASEF بتصور أنماط التجزئة المختلفة ، وتحسين تحديد الأنواع2. وباستخدام DIA-PASEF، توفر زيادة التجزؤ معلومات عن الأيزومرات بقدر ما هو مماثل للشظايا الأخرى، التي لا يمكن حلها عادة بسبب القيود المفروضة على طريقة DDA. توفر هذه المعلومات دليلا على الأحماض الدهنية الموجودة في مبيض البعوض. يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسات الدهون الجديدة الأخرى في الكائنات الحية المتنوعة.

الإفصاحات

ماثيو ويليتس وملفين أ. بارك موظفان في شركة Bruker Daltonics Inc ، الشركة المصنعة للأداة التجارية timsTOF. يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يحب المؤلفون الاعتراف بمساهمات الدكتور سيزار راميريز خلال تطورات الطريقة الأولية. تم تمويل هذا البحث من خلال منح NIAID R21AI167849 إلى FGN ، المشروع 22-21244S من مؤسسة العلوم التشيكية ، جمهورية التشيك إلى MN.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Data AnalysisBruker Daltonics Inc2363525870الإصدار 5.2
d-Glucose-13C6Sigma-Aldrich  389374
أنابيب eppendorfفيشر Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
قوارير زجاجيةThermo Fisher Scientific11-417-236
الماء الثقيل (2H2O)Sigma-Aldrich   ؛1.13366
مدقات البولي بروبلينفيشر ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE كروماتوجراف سائل فائق السرعةShimadzuإدراج
Thermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich & nbsp ؛605417
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E + 11
معايرة مزيج الضبط القياسيةAgilent Technologies36
زجاج سيلان L20234651907

المراجع

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تتبع الدهون الجديدة باستخدام وسم النظائر المستقرة LC-TIMS-TOF MS / MS
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.