بروتوكول بسيط وسريع ومؤتمت جزئيا لعزل النوى المفردة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل النواة المفردة

Lucas Stalder; Fabian Koechl; Kerstin Hahn; Marc Sultan; Megana K. Prasad

doi:10.3791/65611

Method Article

بروتوكول بسيط وسريع ومؤتمت جزئيا لعزل النوى المفردة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل النواة المفردة

DOI:

10.3791/65611

⸱

July 28th, 2023

Lucas Stalder¹ , Fabian Koechl¹ , Kerstin Hahn¹ , Marc Sultan¹ , Megana K. Prasad¹

¹Roche Pharma Research and Early Development, Pharmaceutical Sciences, Roche Innovation Centre Basel

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف الدراسة بروتوكولا بسيطا وسريعا ومؤتمتا جزئيا لعزل النوى عالية الجودة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في اتجاه مجرى النهر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة تطبيقات معملية شائعة بسبب ثروة المعلومات النسخية التي توفرها. يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ، على وجه الخصوص ، مفيدا في التحقيق في التعبير الجيني في الأنسجة التي يصعب فصلها. علاوة على ذلك ، يتوافق هذا النهج أيضا مع المواد المجمدة (المحفوظة). هنا ، نصف بروتوكولا لعزل النوى المفردة عالية الجودة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في اتجاه مجرى النهر بطريقة مؤتمتة جزئيا باستخدام الأدوات والكواشف المتاحة تجاريا. على وجه التحديد ، يتم استخدام جهاز فصل آلي لأتمتة وتوحيد تجانس الأنسجة ، متبوعا بتدرج كيميائي محسن لتصفية النوى. وأخيرا، نحسب النوى بدقة وتلقائية باستخدام عداد الخلايا الفلورية الآلي. يتم إثبات أداء هذا البروتوكول على دماغ الفأر وكلية الفئران وكبد cynomolgus وأنسجة الطحال. هذا البروتوكول مباشر وسريع وقابل للتكيف بسهولة مع أنسجة الثدييات المختلفة دون الحاجة إلى تحسين واسع النطاق ويوفر نوى ذات نوعية جيدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في المصب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (sc) والنواة الواحدة (sn) بروتوكولات شائعة الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية والخلوية بسبب زيادة دقة التعبير الجيني مقارنة بتسلسل الحمض النووي الريبي السائب. ومع ذلك ، فإن عزل مستحضرات الخلية المفردة والنوى المفردة ذات النوعية الجيدة من الأنسجة الصلبة لا يزال يمثل تحديا وغالبا ما يكون خطوة تحديد المعدل في تجارب sc / sn-RNAseq. في الواقع ، تم تطوير عدد كبير من البروتوكولات التي تستخدم إجراءات كيميائية وميكانيكية مختلفة للحصول على معلقات الخلية / النوى¹،²،³،⁴،⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11،¹²،¹³،¹⁴^،¹⁵. علاوة على ذلك ، تتراوح استراتيجيات تنظيف هذه المستحضرات من الحطام / الكتل ، وما إلى ذلك ، من فرز التدفق إلى الترشيح إلى الغسيل. غالبا ما تكون هذه البروتوكولات يدوية (مما يؤدي إلى التباين المرتبط بالمستخدم) ، ويمكن أن تستغرق وقتا طويلا (مما يؤدي إلى تقليل صلاحية الخلية / النواة) ، و / أو قد تتطلب الوصول إلى مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلية / النواة. ركزت هذه الدراسة على تطوير بروتوكول عزل أحادي النوى بسيط وسريع ومؤتمت جزئيا من أنسجة الثدييات المجمدة لتطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبي النهائية. ركزنا بشكل خاص على عزل النوى بدلا من عزل الخلايا لأنه متوافق مع استخدام الأنسجة المجمدة ، مما يجعل جمع / معالجة العينات أكثر عملية وتمكين التجميع غير المتحيز للعينات ، خاصة في تجارب الدورة الزمنية. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن النسخ النووي لا يعكس تماما النسخ الخلوي ، فقد أظهرت العديد من الدراسات الآن أن بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى قابلة للمقارنة مع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد نوع الخلية ، على الرغم من أن نسب أنواع الخلايا يمكن أن تختلف⁶،¹⁶،¹⁷،¹⁸^،¹⁹.

يتكون عزل النوى من عدة خطوات: 1) التعطيل الميكانيكي أو الكيميائي للأنسجة لإطلاق النوى ، 2) تنظيف الحطام والكتل ، و 3) العد الدقيق للنوى للتحضير للتطبيقات النهائية. في عدد من البروتوكولات ، تتضمن الخطوة 1 بشكل متكرر استخدام خالط Dounce من أجل تعطيل الأنسجة ^3,20. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الطرق الكيميائية ، على الرغم من أنها غالبا ما تحتاج إلى تحسين الأنسجة^{المختلفة 2}،⁵^،⁶. لقد اختبرنا أن إجراء تعطيل الأنسجة اليدوي عرضة للتغيرات المرتبطة بالمشغل ، مما يؤدي إلى جودة متغيرة وإنتاجية النوى. من أجل تقليل التباين التقني والحصول على بروتوكول أكثر اتساقا وقابلية للتكرار يعمل عبر الأنسجة ، تم تطوير بروتوكول يستخدم جهاز فصل الأنسجة الروبوتية المتاح تجاريا²¹. بالنسبة للخطوة 2 ، على الرغم من أن التبادل المؤقت عادة ما يكون أبسط وسيلة لغسل النوى ، فقد اعتمدنا استخدام خطوة طرد مركزي متدرجة قصيرة نسبيا للسكروز لإزالة أكثر شمولا للحطام. بالنسبة لأنسجة المخ على وجه التحديد، نستخدم تدرج غرواني السيليكا بدلا من تدرج السكروز لإزالة الميالين بشكل أكثر فعالية. أخيرا ، بالنسبة للعد ، فإن استخدام مقياس الدم هو المعيار الذهبي لحساب النوى وفحصها بصريا. في بروتوكولنا ، يمكن أتمتة هذه الخطوة بشكل موثوق باستخدام عداد خلايا الفلورسنت الآلي^{المتاح تجاريا 22}. تم اختبار هذا البروتوكول وهو متوافق مع العديد من أنسجة الثدييات المجمدة ، بما في ذلك الدماغ والكلى والطحال والكبد ، من أنواع مختلفة من الثدييات (الفئران والفأر والرئيسيات غير البشرية) ويوفر نوى ذات نوعية جيدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة مع منصة تجارية قائمة على القطيرات. يستغرق البروتوكول حوالي 75 دقيقة من تحضير الأنسجة إلى بدء سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع الدراسات على بموافقة السلطة البيطرية في كانتون بازل شتات مع الالتزام الصارم باللوائح الفيدرالية السويسرية بشأن حماية أو بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام وفقا لقانون رعاية الألماني.

1. إعداد الأنسجة والكاشف / الصك

التنظيف وإعداد الصك
1. نظف أسطح المناضدة والملاقط بنسبة 70٪ من الإيثانول ومحلول إزالة التلوث RNase. قم بتبريد أجهزة الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
2. قم بتبريد خراطيش عزل النوى مسبقا في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. ابدأ تشغيل جهاز التفكك الآلي وقم بتشغيل التبريد عن طريق ضبط شريط التمرير في أعلى يمين الشاشة ليبرد وبالنقر فوقه لبدء التبريد بحيث يظهر شريط التمرير باللون البرتقالي. تأكد من أن زجاجة كاشف تخزين النوى المرفقة (NSR) وزجاجة عازلة عزل النوى (NIB) تحتوي على سائل كاف ومتبقي ويتم تبريدها بشكل صحيح.
4. قم بإعداد صندوق رغوة البوليسترين المملوء بالثلج الجاف وأطباق بتري المبردة مسبقا وشفرات المشرط على الثلج الجاف.
إعداد العازلة
1. تحضير محلول وسادة السكروز 1.5 متر (SCS) كما هو موضح في الجدول 1. قم بتوزيع SCS في حصص 500 ميكرولتر في أنابيب DNase / RNase سعة 2 مل للحصول على أربعة حصص SCS سعة 500 ميكرولتر لكل عينة. احتفظ بالحصص على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.
2. في حالة معالجة أنسجة المخ ، قم بإعداد محلول غرواني السيليكا بنسبة 18٪ كما هو موضح في الجدول 2 ، عن طريق تخفيف محلول مخزون الغروانية السيليكا في NSR وإضافة مثبط RNase. تحضير 3 مل من محلول غرواني السيليكا 18٪ لكل عينة والاحتفاظ بها على الجليد.

2. تجانس الأنسجة وعزل النوى

أخرج العينة من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها على الفور على الثلج الجاف.
قطع العينة على طبق بتري مبرد مسبقا أو صفيحة معدنية على ثلج جاف باستخدام مشرط مبرد مسبقا إلى قطعة 15-50 مجم (إذا لم يكن بالحجم المناسب بالفعل). تأكد من قطع العينة في الاتجاه الصحيح بحيث تظل العينة ممثلة لهياكل الأعضاء ذات الأهمية.
ملاحظة: مع هذا البروتوكول ، 15-50 ملغ هو حجم العينة الأمثل للاستخراج النووي. لتحقيق عائد جيد بعد التنظيف ، يوصى بحجم عينة لا يقل عن 25 ملغ. بالنسبة للعينات الأصغر ، تتوفر خراطيش خاصة تم تحسينها لمعالجة المدخلات الصغيرة باستخدام جهاز الانفصال الآلي. تم استخدام خراطيش عزل نوى الإدخال الصغيرة لفصل عينات الأنسجة التي تزن أقل من 4 ملغ مع عائد كاف لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في المصب. يوضح الجدول 3 مثالا على إنتاجية النوى باستخدام خرطوشة الإدخال المنخفضة من أنسجة كبد الفئران.
قم بإزالة خرطوشة عزل النوى من الثلاجة ، وقم بفكها ، وقم بإزالة المطحنة ، وماصة 15 ميكرولتر من مثبط RNase (40 وحدة / ميكرولتر) إلى أسفل الخرطوشة.
ملاحظة: أثناء استخراج النوى ، سيضيف جهاز فك الارتباط الآلي NIB و NSR إلى الخرطوشة إلى حجم إجمالي قدره 3 مل (مع بروتوكول استخراج النوى منخفض الحجم). بإضافة 15 ميكرولتر من مثبط RNase (40 وحدة / ميكرولتر) إلى الخرطوشة قبل الاستخراج ، سيكون للتعليق تركيز مثبط RNAse المطلوب البالغ 0.2 وحدة / ميكرولتر.
ضع عينة الأنسجة في الجزء السفلي من الخرطوشة باستخدام الملقط. لا تضع العينة بالضبط في وسط الخرطوشة من أجل الحصول على كفاءة التعطيل المثلى.
حدد تشغيل بروتوكول على الجهاز وانقر على خيار Nuclei في الزاوية اليسرى العليا.
1. من القائمة ، حدد بروتوكول عزل النوى منخفض الحجم وتحقق من ضبط سرعة التعطيل على سريع بالنقر فوق تعديل. قم بتحميل الخرطوشة على الجهاز عن طريق فتح الباب والانزلاق خارج المسرح عن طريق رفع المقبض الأحمر.
2. أدخل الخرطوشة في المكان المحدد ، وقم بتدوير قفل الخرطوشة ، ثم حرك في المسرح حتى يستقر المقبض الأحمر في مكانه. أغلق الباب وابدأ تشغيل استخراج النوى على الجهاز بالنقر فوق التالي. يستمر الجري حوالي 7 دقائق.
بمجرد الانتهاء من التشغيل ، قم بإزالة الخرطوشة من الجهاز عن طريق رفع المقبض الأحمر وسحب المسرح. ضع الخرطوشة على الثلج على الفور.
بالنسبة لجميع الأنسجة باستثناء الدماغ ، انتقل إلى الخطوة 3.1. بالنسبة لعينات الدماغ، انتقل مباشرة إلى الخطوة 3.2.

3. تنظيف النوى

تنظيف تدرج السكروز
ملاحظة: بالنسبة لأنسجة المخ، تخطي هذه الخطوة وانتقل مباشرة إلى الخطوة 3.2. يتم تنفيذ جميع خطوات التنظيف على الجليد من أجل تقليل تدهور الحمض النووي الريبي. يجب تبريد المخازن المؤقتة والأنابيب وكذلك أجهزة الطرد المركزي مسبقا. يتم تنفيذ جميع خطوات إعادة التعليق والخلط عن طريق السحب الدقيق فقط ، لأن الدوامة يمكن أن تضر بجودة وسلامة النوى.
1. اخترق بعناية الرقاقة المستديرة على خرطوشة التفكك بطرف ماصة.
  ملاحظة: بعد التفكك ، يكون لتعليق النوى الناتج حجم تقريبي يبلغ 2 مل. لتسهيل تنظيف تدرج السكروز ، قسم معلق النوى إلى قسامتين 900 ميكرولتر ، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 1.8 مل من معلق النوى أثناء التنظيف.
2. قم بإزالة أول حصة 900 ميكرولتر من تعليق النوى من الخرطوشة وأضفها إلى حصة SCS سعة 500 ميكرولتر تم إعدادها مسبقا في أنبوب سعة 2 مل. تخلط جيدا عن طريق السحب حتى يصبح الخليط متجانسا.
3. قم بإزالة 1400 ميكرولتر من خليط تعليق النوى - SCS وقم بوضعه بعناية على حصة SCS جديدة سعة 500 ميكرولتر عن طريق إمساك الأنبوب بزاوية وإضافة الخليط بالتنقيط ، مما يؤدي إلى فصل طور مرئي بوضوح (انظر الشكل 1 أ).
4. أغلق الأنبوب بعناية وضعه مرة أخرى على الثلج دون الإخلال بفصل الطور.
5. كرر الخطوات 3.1.2-3.1.4 مع القسمة الثانية 900 ميكرولتر من التعليق وحصة SCS الجديدة للحصول على أنبوبين 2 مل لكل عينة مع فصل طور مرئي بوضوح للطرد المركزي المتدرج.
6. أضف الأنابيب بعناية إلى جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا وقم بتدويرها عند 13000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
7. في غضون ذلك ، قم بإعداد NSR الموصوف في الجدول 4 ، عن طريق إضافة مثبط RNase إلى حصة NSR. تحضير 1 مل من NSR لكل عينة.
  ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إزالة حبات هلام كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية من الفريزر -80 درجة مئوية ، مما يسمح لها بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، ويمكن إعادة تعليق oligo مفتاح القالب في مخزن مؤقت منخفض TE.
8. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية من كلا الأنبوبين دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات بعناية في 50 ميكرولتر من NSR المثلج البارد وفقا لتوصية الشركة المصنعة. اجمع الكريتين من نفس العينة في أنبوب جديد سعة 1.5 مل وأضف 900 ميكرولتر من NSR المثلج البارد إلى حجم إجمالي قدره 1 مل. تخلط جيدا عن طريق الماصة.
9. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح.
  ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام دوار دلو متأرجح لتقليل فقد النوى ، خاصة عندما يكون من المتوقع أن يكون إنتاج النوى منخفضا أو عند البدء بكميات صغيرة من الأنسجة.
10. في غضون ذلك ، قم بإعداد 500 ميكرولتر لكل عينة من 1x PBS (بدون Ca2 + و Mg2 +) مع 0.04٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) ومثبط 0.2 U / μL RNase كما هو موضح في الجدول 5.
11. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون التخلص من الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من محلول PBS كما هو محضر أعلاه (1x PBS + 0.04٪ BSA + مثبط RNase عند 0.2 وحدة / ميكرولتر).
  ملاحظة: بالنسبة لعينات الأنسجة الصغيرة ، قد يكون تركيز النوى منخفضا ، وبالتالي يوصى بإعادة تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر فقط من محلول PBS لضمان تركيزات عالية بما فيه الكفاية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.
12. انتقل مباشرة إلى الخطوة 4.
تنظيف تدرج السيليكا الغرواني
ملاحظة: بالنسبة لأنسجة المخ ، يكون تدرج الغرواني السيليكا أكثر ملاءمة من تدرج السكروز لإزالة المايلين والحطام من معلق النوى. يتم تنفيذ جميع خطوات التنظيف على الجليد لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي. يجب تبريد المخازن المؤقتة والأنابيب ، وكذلك أجهزة الطرد المركزي ، مسبقا. يتم تنفيذ جميع خطوات إعادة التعليق والخلط عن طريق السحب الدقيق فقط ، لأن الدوامة يمكن أن تضر بجودة وسلامة النوى.
1. اخترق بعناية الرقاقة المستديرة على خرطوشة التفكك بطرف ماصة.
2. قم بإزالة تعليق النوى من الخرطوشة وأضفه إلى أنبوب سعة 5 مل.
3. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا.
4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول غرواني السيليكا المثلج 18٪.
5. أضف 2 مل إضافية من محلول غرواني السيليكا بنسبة 18٪ للحصول على حجم إجمالي قدره 3 مل واخلطه جيدا عن طريق سحب الماصة.
6. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في دوار دلو متأرجح مع انطلاق الفرامل.
7. في غضون ذلك ، قم بإعداد NSR الموصوف في الجدول 4 عن طريق إضافة مثبط RNase إلى حصصة NSR. تحضير 1 مل من NSR لكل عينة.
  ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إزالة حبات هلام كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية من المجمد -80 درجة مئوية ، مما يسمح لها بالتوازن مع RT ويمكن إعادة تعليق oligo مفتاح القالب في مخزن مؤقت منخفض TE.
8. قم بإزالة العينة بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج طبقة المايلين العائمة في الأعلى.
9. أولا ، قم بإزالة طبقة المايلين من الأعلى وتجاهلها ؛ ثم ، قم بإزالة المادة الطافية بالكامل بعناية دون إزعاج الحبيبات.
  ملاحظة: يمكن إزالة طبقة المايلين بسهولة عن طريق لف منديل معقم خال من النسالة حول طرف ماصة سعة 1 مل لشفط طبقة المايلين مع 1-2 مل من المادة الطافية.
10. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من NSR المثلج البارد وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
11. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح.
  ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام دوار دلو متأرجح لتقليل فقد النوى ، خاصة عندما يكون من المتوقع أن يكون إنتاج النوى منخفضا أو عند البدء بكميات صغيرة من الأنسجة.
12. في غضون ذلك ، قم بإعداد 500 ميكرولتر لكل عينة من 1x PBS (بدون Ca2 + و Mg2 +) مع 0.04٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) ومثبط 0.2 U / μL RNase كما هو موضح في الجدول 5.
13. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من محلول PBS كما هو محضر أعلاه (1x PBS + 0.04٪ BSA + مثبط RNase عند 0.2 وحدة / ميكرولتر).
  ملاحظة: بالنسبة لعينات الأنسجة الصغيرة ، قد يكون تركيز النوى منخفضا ، وبالتالي يوصى بإعادة تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر فقط من محلول PBS لضمان تركيزات عالية بما فيه الكفاية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.

4. العد

لكل عينة يتم حسابها ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من معلق النوى في 20 ميكرولتر من محلول PBS للحصول على تخفيف 1: 3.
للعد ، أضف 25 ميكرولتر من محلول تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) إلى بئر خلط للوحة عد عداد الفلورسنت. أضف 25 ميكرولتر من معلق النوى المخفف واخلطه جيدا عن طريق الماصة. انقل العينة الملطخة سعة 50 ميكرولتر من بئر الخلط إلى بئر التحميل.
قم بتحميل لوحة العد على عداد الخلية وابدأ العد.
ملاحظة: يتم أخذ عدد النوى من قناة الفلورسنت الحمراء مع وقت تعرض يبلغ 700 مللي ثانية. تم تحسين هذه القناة للحصول على عدد دقيق للنوى من خلال المقارنة المتقاطعة مع العد اليدوي باستخدام غرفة نيوباور وتلطيخ تريبان بلو تحت المجهر. في التركيزات العالية ، تكون النوى قريبة جدا من بعضها البعض ، مما يجعل من الصعب على البرنامج فصلها. في هذه الحالة ، يوصى بإعادة فرز العينة في تخفيف مناسب. يمكن تقييم سلامة النوى وكذلك النظافة من صورة المجال الساطع أو تحت المجهر.
قم بتخفيف العينات باستخدام PBS (1x PBS + 0.04٪ BSA + مثبط RNase عند 0.2 وحدة / ميكرولتر) إلى التركيز المطلوب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.
ملاحظة: تعتبر التركيزات بين 700-1200 نواة / ميكرولتر مثالية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. قد تؤدي تركيزات الخلايا المنخفضة ، مثل 700 نواة / ميكرولتر ، إلى تقليل تلوث الخلفية من الحمض النووي الريبي المحيط.

5. إعداد المكتبة

قم بإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى باستخدام كواشف التعبير الجيني أحادي الخلية باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة الذي يستهدف استعادة النوى من 8000-10000 نواة لكل عينة.

6. التسلسل

قم بتسلسل المكتبات بعمق التسلسل المطلوب مع النهاية المزدوجة والفهرسة المزدوجة ، ويقرأ التسلسل التالي: اقرأ 1: 28 دورة ، فهرس i7: 10 دورات ، فهرس i5: 10 دورات وقراءة 2: 90 دورة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إثبات أداء هذا البروتوكول وتعدد استخداماته من خلال إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى على أنسجة القشرة القذالية المجمدة الطازجة في الدماغ من ثلاثة فئران B6 ، وأنسجة الكلى الطازجة المجمدة المقطوعة عبر ثلاثة فئران Wistar ، وأنسجة الكبد والطحال الأرشيفية (البالغة من العمر 11 عاما) من ثلاثة المكاك Cynomolgus في موريشيوس. كانت جميع غير معطلة.

كما هو موضح في الشكلين 1B ، C ، تم الحصول على نوى جيدة النوعية خالية من علامات الارتباك والحطام والتكتل. تم تحسين الترشيح القائم على تدرج السكروز لإزالة غالبية الحطام عن طريق اختبار كثافات مختلفة وسرعات الدوران والأوقات ، وتقييم النقاء / السلامة النووية تحت المجهر بالإضافة إلى تقييم توزيع حجم النوى والعائد (الشكل 1 د). سمح لنا ذلك باختيار كثافة تدرج السكروز 1.5 M واستخدام وقت دوران قصير يبلغ 15 دقيقة. بعد ذلك ، لمزيد من التقييم لجودة النوى ، تمت معالجة البيانات مسبقا باستخدام 10X Cell Ranger ، وتم إجراء مزيد من تحليل البيانات النهائية باستخدام Besca²³. تم ترشيح النوى التي تحتوي على >5٪ من محتوى الميتوكوندريا (حيث تميل إلى أن تكون تالفة / مجهدة) ، وتم الاحتفاظ بالنوى التي تحتوي على 500-7000 جين (لتقليل القطرات الفارغة والمضاعفات). قمنا فقط بتضمين الجينات التي كانت موجودة في 30 نواة على الأقل. استهدفنا 8000 نواة لكل عينة قشرة دماغية و 10000 نواة لكل عينة من الكلى والكبد والطحال. بعد الترشيح ، تم الحصول على 10,644 نواة عالية الجودة من عينات الدماغ الثلاثة ، و 14,960 نواة عالية الجودة من عينات الكلى الثلاث ، و 18,795 نواة عالية الجودة من عينات الكبد الثلاث ، و 13,882 نواة عالية الجودة من عينات الطحال الثلاثة. يوضح الشكل 2A و D و G و J مخططات الكمان التي تمثل توزيع عدد UMI وعدد الجينات ومحتوى الميتوكوندريا في كل عينة. كان متوسط عدد التهم عبر جميع عينات الدماغ 7,563 UMI / نواة و 3,208 جين / نواة. كان متوسط عدد التهم في جميع عينات الكلى 3,841 UMI / نواة و 1,915 جينا / نواة. كان متوسط عدد التهم عبر جميع عينات الكبد 2,649 UMI / نواة و 1,676 جينا / نواة. كان متوسط عدد الأعداد عبر جميع عينات الطحال 1,609 UMI / نوى و 1,138 جينا / نواة. ثم قمنا بإنشاء مجموعات باستخدام جينات متغيرة للغاية وشرحناها باستخدام جينات علامة معروفة¹⁷،²⁴،²⁵^،²⁶. كما هو موضح في الشكل 2B ، E ، H ، K ، تمكنا من تحديد أنواع الخلايا المتوقعة من كل نسيج. علاوة على ذلك ، كما هو موضح في الشكل 2B و E و H و K ، ساهمت جميع في جميع المجموعات ، مما يشير إلى التباين التقني المنخفض بشكل عام الذي أدخله البروتوكول. علاوة على ذلك ، كانت النسب الخلوية قابلة للمقارنة في جميع العينات الثلاث لكل نوع من الأنسجة ، وكذلك UMI وعدد الجينات (الشكل 2A ، C ، D ، F ، G ، I ، J ، L). الاستثناء الملحوظ هو الكبد ، حيث كانت مجموعات خلايا الكبد بين عينات الكبد الثلاث مختلفة في النسب والصورة. هذا على الأرجح بسبب الاختلافات البيولوجية بين (الجنس ، العمر ، الحالة الأيضية).

figure-results-1
الشكل 1: تقييم جودة النوى وتحسين تدرج السكروز . (أ) فصل الطور المتوقع أثناء الطرد المركزي لتدرج السكروز موضح بسهم. (ب) صور فلورية تمثيلية لكلية الفئران الملطخة بيوديديوم (أعلى) ونوى الطحال (السفلي) التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول. (ج) صور مجهرية تمثيلية للمجال الساطع للنوى المعزولة من كبد الفأر (أعلى) ودماغ الفأر (أسفل) ، شريط مقياس 500 ميكرومتر. لاحظ السطح الأملس المنتظم للنوى الذي يشير إلى جودة نووية جيدة. د: تحسين تدرج السكروز. تم اختبار العديد من كثافات السكروز وسرعات الدوران وأوقات الدوران. يتم عرض صور مجهرية المجال الساطع للنوى وتوزيع حجم النوى وإنتاجية النوى لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: بيانات تمثيلية من snRNAseq على القشرة القذالية لدماغ الفأر ، وكلية الفئران (القشرة والنخاع) ، وكبد المكاك والطحال cynomolgus. (أ) مخططات كمان توضح توزيع الجينات/النواة، و UMIs/النواة، والنسبة المئوية لمحتوى الميتوكوندريا لكل عينة دماغية. (ب) اللوحة اليسرى: مخطط UMAP يوضح مساهمة كل عينة في المجموعات المحددة في الدماغ. اللوحة اليمنى: UMAP تظهر هويات المجموعات المشروحة بناء على جينات العلامة في أنسجة المخ. ج: النسب الخلوية التي لوحظت في 3 عينات دماغية. د: مخططات الكمان التي توضح توزيع الجينات/النواة، والأجسام الأحادية المتجانسة/النواة، والنسبة المئوية لمحتوى الميتوكوندريا لكل عينة من الكلى. (ه) اللوحة اليسرى: مخطط UMAP يوضح مساهمة كل عينة في المجموعات المحددة في الكلى. اللوحة اليمنى: UMAP تظهر هويات المجموعات المشروحة بناء على جينات العلامة في أنسجة الكلى. (F) النسب الخلوية التي لوحظت في 3 عينات من الكلى. (ز) مخططات كمان توضح توزيع الجينات / النواة ، و UMIs / النواة ، والنسبة المئوية لمحتوى الميتوكوندريا لكل عينة كبد. (H) اللوحة اليسرى: مخطط UMAP يوضح مساهمة كل عينة في المجموعات المحددة في الكبد. اللوحة اليمنى: UMAP تظهر هويات المجموعات المشروحة بناء على جينات العلامة في أنسجة الكبد. (I) النسب الخلوية التي لوحظت في 3 عينات من الكبد. (ي) مخططات الكمان التي توضح توزيع الجينات / النواة ، و UMIs / النواة ، والنسبة المئوية لمحتوى الميتوكوندريا لكل عينة طحال. (K) اللوحة اليسرى: مخطط UMAP يوضح مساهمة كل عينة في المجموعات المحددة في الطحال. اللوحة اليمنى: UMAP تظهر هويات المجموعات المشروحة بناء على جينات العلامة في أنسجة الطحال. (L) النسب الخلوية التي لوحظت في 3 عينات من الطحال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكونات	تركيز المخزون	الحجم لكل عينة	التركيز النهائي
محلول وسادة السكروز	2 م	1500 ميكرولتر	1.5 م
السكروز وسادة عازلة	-	500 ميكرولتر	-
ديثيوثريتول (DTT)	1 م	2 ميكرولتر	1 مللي متر
مثبطات الحمض النووي الريبي	40 وحدة / ميكرولتر	10 ميكرولتر	0.2 وحدة / ميكرولتر

الجدول 1: تحضير محلول وسادة السكروز 1.5 متر (SCS). يستخدم هذا الحل للطرد المركزي المتدرج للسكروز أثناء التنظيف في الخطوة 3.1 ويجب تحضيره طازجا في كل مرة قبل بدء البروتوكول. احتفظ دائما ب SCS على الجليد أثناء البروتوكول. الحلول المذكورة في هذا الجدول مشار إليها في جدول المواد.

مكونات	تركيز المخزون	الحجم لكل عينة	التركيز النهائي
محلول مخزون الغرواني السيليكا	90%	600 ميكرولتر	18%
كاشف تخزين النوى (علم الجينوم S2)	-	2400 ميكرولتر	-
مثبطات الحمض النووي الريبي	40 وحدة / ميكرولتر	15 ميكرولتر	0.2 وحدة / ميكرولتر

الجدول 2: تحضير محلول غرواني السيليكا بنسبة 18٪. يستخدم هذا الحل للطرد المركزي المتدرج الغرواني السيليكا أثناء التنظيف في الخطوة 3.2 ويجب تحضيره طازجا في كل مرة قبل بدء البروتوكول. احتفظ دائما بمحلول غرواني السيليكا بنسبة 18٪ على الجليد أثناء البروتوكول.

نسيج	وزن العينة	خرطوش	أدر
كبد الفئران	25 ملغ	خرطوشة عزل النوى	65000 نواة لكل ملغ من الأنسجة
كبد الفئران	4 ملغ	خرطوشة عزل نوى الإدخال الصغيرة	32000 نواة لكل ملغ من الأنسجة

الجدول 3: تنتج النوى من خرطوشة عزل النوى منخفضة الإدخال مقابل خرطوشة عزل النوى بعد تنظيف تدرج السكروز.

مكونات	تركيز المخزون	الحجم لكل عينة	التركيز النهائي
كاشف تخزين النوى	-	1000 ميكرولتر	-
مثبطات الحمض النووي الريبي	40 وحدة / ميكرولتر	5 ميكرولتر	0.2 وحدة / ميكرولتر

الجدول 4: تحضير كاشف تخزين النوى (NSR). يستخدم هذا الحل أثناء عزل النوى في الخطوات 3-5 وكذلك أثناء التنظيف في الخطوة 3.1.8. يمكن تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. قم بإعداد حصة جديدة مع مثبط RNase أثناء خطوة الطرد المركزي في خطوة التنظيف 6. الحلول المذكورة في هذا الجدول مشار إليها في جدول المواد.

1x PBS + 0.04٪ حل مخزون BSA
مكونات	تركيز المخزون	حجم المخزون	التركيز النهائي
برنامج تلفزيوني (بدون Ca 2+ ، بدون Mg²⁺)	1x	30 مل	-
مصل البقر الزلال (BSA)	30%	40 ميكرولتر	0.04%
1x PBS + 0.04٪ BSA + 0.2 U / μL مثبط RNAse
مكونات	تركيز المخزون	الحجم لكل عينة	التركيز النهائي
1x PBS + 0.04٪ حل مخزون BSA	-	500 ميكرولتر	-
مثبطات الحمض النووي الريبي	40 وحدة / ميكرولتر	2.5 ميكرولتر	0.2 وحدة / ميكرولتر

الجدول 5: إعداد PBS + 0.04٪ BSA. يستخدم هذا المحلول في نهاية التنظيف في الخطوة 3.1.10 وبعد العد لتخفيف تعليق النوى إلى التركيز المطلوب لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى 10X (عد الخطوة 4.4). يمكن تخزين محلول المخزون عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر. قم بإعداد حصة جديدة مع مثبط RNase أثناء خطوة الطرد المركزي في خطوة التنظيف 6.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا بروتوكولا متعدد الاستخدامات ومؤتمتا جزئيا للحصول على نوى مفردة عالية الجودة من أنسجة الثدييات المجمدة وأظهرنا البروتوكول على دماغ الفأر وكلية الفئران وكبد cynomolgus وأنسجة الطحال.

عند مقارنة أداء هذا البروتوكول بأداء البروتوكولات المنشورة الأخرى لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في أنسجة الدماغ والكلى والطحال والكبد⁶،⁷^،^20،24،²⁵،²⁶ ^، نلاحظ أننا قادرون على اكتشاف عدد مماثل من الجينات وعدد UMI لكل نواة وقادرون على استعادة أنواع الخلايا المتوقعة. بالمقارنة مع الطرق الحالية ، هناك العديد من المزايا لهذا البروتوكول. أولا ، يعمل البروتوكول في هذه الدراسة على أتمتة تجانس الأنسجة وعزل النوى المفردة. يتم تحقيق ذلك باستخدام اضطراب الأنسجة الروبوتية²¹. في معظم البروتوكولات ، يتم تجانس الأنسجة باستخدام خالط Dounce من أجل تحرير نواة واحدة ^3,20. ومع ذلك ، فقد لاحظنا أن هذه الخطوة اليدوية يمكن أن تؤدي إلى تباين تجريبي في إنتاجية النوى وسلامتها اعتمادا على مقدار القوة التي تمارس أثناء التجانس ، مما يضر بقابلية استنساخ التجارب. هنا ، باستخدام مطحنة الأنسجة الآلية ذات الإعدادات الثابتة ، تم الحصول على جودة نوى جيدة وعائد مع تناسق أكبر عبر التجارب. علاوة على ذلك ، فإن أتمتة هذه الخطوة تقلل أيضا من الوقت العملي للبروتوكول (تستغرق خطوة تعطيل الأنسجة حوالي 7 دقائق) ، مما يسمح للمستخدم بالاستعداد للخطوات اللاحقة. ثانيا ، البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة متعدد الاستخدامات ، أي أنه متوافق مع الأنسجة المختلفة من الأنواع المختلفة. يتيح لنا ذلك تجنب تحسين البروتوكول المطول ، على سبيل المثال ، لتحديد مخازن / منظفات التجانس للأنسجة^{المختلفة 2}،⁵^،⁶. ثالثا ، لا يعتمد هذا البروتوكول على الوصول إلى فارز التدفق من أجل الحصول على نوى نظيفة ، مما يجعله في متناول المختبرات التي لا تملك المعدات / الخبرة المطلوبة لفرز التدفق. بدلا من ذلك ، قمنا بتحسين الترشيح القائم على تدرج السكروز لإزالة معظم الحطام. ومع ذلك ، بالنسبة لأنسجة المخ على وجه الخصوص ، يوصى باستخدام تدرج غرواني السيليكا بدلا من تدرج السكروز لإزالة الميالين بشكل أكثر كفاءة. لقد وجدنا أيضا أن استخدام دوار دلو متأرجح في نهاية خطوة الطرد المركزي المتدرجة للسكروز / السيليكا يقلل من فقد النوى. وبالتالي ، يوصى بشدة باستخدام مثل هذا الدوار. رابعا ، بعد اختبار طرق متعددة لحساب النوى (العد اليدوي تحت المجهر ، واستخدام العديد من العدادات الآلية) ، يوصى باستخدام عداد خلية الفلورسنت^{الآلي 22}. يزيد استخدام صبغة إقحام الحمض النووي ، مثل يوديد البروبيديوم ، من دقة عد النواة. خامسا ، يستغرق هذا البروتوكول حوالي 75 دقيقة من البداية إلى تحميل شريحة الموائع الدقيقة. يساعد هذا في ضمان بقاء سلامة النوى عالية عند معالجة عينات متعددة. أخيرا ، وجدنا أن البروتوكول متوافق أيضا مع الأنسجة المضمنة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). في حالة استخدام مثل هذه المواد ، يمكن إزالة الأنسجة من كتلة OCT باستخدام مشرط قبل التجانس.

أحد التحديات المتكررة في مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى هو وجود الحمض النووي الريبي المحيط ، والذي يمكن أن يكون غير نووي (على سبيل المثال ، الميتوكوندريا) وكذلك مشتق من الطاقة^{النووية 27,28}. في بروتوكولنا ، يكون الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا (وكيل للحمض النووي الريبي المحيط غير النووي) منخفضا حتى قبل التصفية (0.1-1.6٪ للأنسجة الموضحة). ومع ذلك ، على غرار البروتوكولات ومجموعات البيانات الأخرى ، لا يزال تلوث الحمض النووي الريبي المحيط من الجينات عالية التعبير في نوى أنواع الخلايا الوفيرة (مثل خلايا الكبد في الكبد ، والخلايا العصبية في الأدمغة ، وما إلى ذلك) موجودا²⁷. توجد العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية ، مثل CellBender و SoupX وما إلى ذلك ، والتي يمكنها إزالة تلوث الحمض النووي الريبي المحيط قبل التعليق التوضيحي^{للنوى 29}،³⁰^،³¹. هناك قيد آخر لهذا البروتوكول وهو أنه على الرغم من أن خطوات تعطيل الأنسجة وعزل النوى مؤتمتة ، إلا أن إنتاجية هذه الخطوة لا تزال محدودة حيث يمكن معالجة عينة واحدة فقط في كل مرة. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه الخطوة تستغرق حوالي 7 دقائق فقط لكل قطعة من الأنسجة ، فلا يزال من الممكن معالجة عينات متعددة دفعة واحدة. نقوم عادة بمعالجة أربع عينات لكل دفعة ولكننا قمنا بعمل ما يصل إلى ست عينات لكل دفعة بنتائج جيدة. ستمكن التحسينات الأخيرة في جهاز الانفصال الآلي للسماح بالمعالجة المتوازية لعينتين في وقت واحد من معالجة 8-12 عينة لكل دفعة ، وهو ما يتوافق مع إنتاجية رقاقة الموائع الدقيقة المستخدمة في تغليف النوى المفردة.

على الرغم من أننا لم نستخدم النوى المعزولة بواسطة هذا البروتوكول لتطبيقات المصب الأخرى مثل ATAC-seq أو snRNAseq باستخدام منصات أخرى ، بناء على جودة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام كواشف التعبير الجيني المستخدمة هنا ، نعتقد أن بروتوكولنا يجب أن يكون متوافقا مع تطبيقات المصب الإضافية. ومع ذلك ، سيشمل العمل المستقبلي اختبار هذا البروتوكول مع تطبيقات المصب الأخرى ، مثل ATAC-seq.

في الختام ، قمنا بتطوير بروتوكول عزل نوى سريع وبسيط ومؤتمت جزئيا لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في اتجاه مجرى النهر والذي ثبت أنه متوافق مع أنواع مختلفة من أنسجة الثدييات المجمدة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين هم / كانوا موظفين لدى F. Hoffmann-La Roche أثناء إجراء الدراسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا فيليب بوشنر وماريون ريتشاردسون وبيترا ستويبل وماتياس سيلهاوزن على توفير الأنسجة الحيوانية التي تم تحليلها في هذه المخطوطة. نود أيضا أن نشكر بيترا شوالي وكلاس هاتجي ورولاند شموكي ومارتن إبلينغ على دعمهم للمعلوماتية الحيوية.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1 متر DTT	Thermo Fisher Scientific	P2325
10٪ Tween 20	Bio-Rad	1662404
10x فاصل مغناطيسي	10x علم الجينوم	PN-120250
10x محول دوامة	10x علم الجينوم	PN-120251
1x DPBS (10x) ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم	Thermo Fisher Scientific	14190144	مخزنة عند 4 درجات ؛ C
30٪ ألبومين مصل البقر	سيجما ألدريتش	A9576_50ML
400 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0	ثيرمو فيشر العلمي	15568025
40U/&mu ؛ ل RNaseOUT مثبط ريبونوكلياز المؤتلف	10777019 الحراري فيشر العلمي		المخزن عند -20 درجة ؛
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية	Agilent	5067-4626
Cellaca MX عداد الخلايا الآلي عالي الإنتاجية	Nexcelom Bioscience	CELMXSYSF2	عداد الخلايا الفلورية الآلي
Chromium Next GEM Chip G مجموعة خلية واحدة ، 16 rxns	10x genomics	PN-1000127	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية ، مخزن في درجة حرارة الغرفة
الكروم التالي حامل GEM الثانوي	10x الجينوم	PN-1000195
الكروم التالي GEM خلية واحدة 3 'جل بيد كيت v3.1 ، 4 rxns	10x الجينوم	PN-1000129	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية ، مخزن عند -80 درجة ؛ C
الكروم التالي GEM خلية واحدة 3 'GEM ، مكتبة & مجموعة حبة الجل v3.1 ، 4 rxns	10x الجينوم	PN-1000128	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية
الكروم التالي GEM Single Cell 3 'Library Kit v3.1 4 rxns	10x genomics	PN-1000158	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية ، مخزن عند -20 درجة ؛ C
الكروم التالي GEM خلية واحدة 3'GEM Kit v3.1 4 rxns	10x genomics	PN-1000130	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية ، مخزن عند -20 درجة ؛ خزانات
البوليسترين المقسمة	VWR	41428-958
أنابيب DNA LoBind 1.5 مل Eppendorf	Sigma-Aldrich	EP0030108051
DNA LoBind Tubes 2 مل Eppendorf	Sigma-Aldrich	EP0030108078
الجليد الجاف	-
Dynabeads MyOne SILANE	10x genomics	PN-2000048	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية، مخزنة في 4 درجات ؛ C
الإيثانول النقي	سيجما-ألدريتش	E7023
الجلسرين (الجلسرين) ، 50٪ (حجم / حجم)	شركة ريكا للكيماويات	3290-16
لوحات عد Nexcelom
عالية الإنتاجية	Heatblock Nexcelom Bioscience	CHM24-A100-001	لوحة عد عداد الخلايا
منخفضة TE Buffer (10 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 ، 0.1 ملي مولار EDTA)	ثيرمو فيشر جهاز
	-
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 دورة)	Illumina	2002840
Nuclei Isolation Buffer	S2 Genomics	100-063-396	مخزنة عند 4 درجات ؛
خرطوشة عزل النوى	C S2 الجينوم	100-063-287	مبرد مسبقا عند 4 درجات ؛ C قبل الاستخدام
Nuclei PURE 2 M محلول وسادة السكروز	Sigma-Aldrich	NUC201-1KT	وسادة السكروز
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer	Sigma-Aldrich	NUC201-1KT
كاشف تخزين النوى	S2 الجينوم	100-063-405	مخزنة في 4 درجات ؛ أنابيب
C PCR 0.2 مل شرائط 8 أنابيب	Eppendorf	30124359
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02	محلول غروي السيليكا
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32854
أجهزة الطرد المركزي المبردة (Eppendorf 5804R)	Eppendorf	5805000010
جهاز طرد مركزي مبرد مع دوار دلو متأرجح (Eppendorf 5810R)	Eppendorf ؛	5811000015
RNAseZap	Ambion	AM9780	RNAse محلول إزالة
التلوث ثقافة الخلايا المستديرة طبق بتري	SPL	330005
مشرط يمكن التخلص	Aesculap AG	BA210	مبرد مسبقا على الثلج الجاف قبل الاستخدام
مجموعة مؤشر واحد T مجموعة A ، 96 rxns	10x علم الجينوم	PN-1000213	كاشف التعبير الجيني أحادي الخلية ، مخزن عند -20 درجة ؛ C
Singulator 100 System	S2 Genomics	-	مفكك الأنسجة الروبوتية المتوفرة
تجاريا هيدروكسيد الصوديوم 1M	Sigma-Aldrich	72068
SPRIselect Recode Kit	Beckman Coulter	b23318
ملاقط معقمة	-
UltraPure DNase / RNase خالية من الماء المقطر	ثيرمو فيشر العلمي	10977049
ViaStain PI Stain Solution	Nexcelom Bioscience	CS1-0109-5mL	محلول تلطيخ يوديد البروبيديوم
خلاط دوامة + A2: D44	VWR-

C C الطرد المركزي الصغير Scientific 12090015 محلول منه

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burja, B., et al. An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
Kimbley, L. M., et al. Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue. Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).
Maitra, M., et al. Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications. Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).
Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Current Protocols. 1 (5), e132(2021).
Rousselle, T. V., et al. An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq. Scientific Reports. 12, 9851(2022).
Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901(2021).
Alvarez, M., et al. Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing. Bio-Protocol. 13 (3), e4601(2023).
Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).
Joshi, N., Misharin, A. Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).
Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. 'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).
Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100. Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).
Matson, K. J. E., et al. Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413(2018).
Mendelev, N., et al. Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue. STAR Protocols. 3 (2), 101446(2022).
Soule, T. G., et al. A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle. Life Science Alliance. 6 (5), e202201806(2023).
Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).
Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, 6031(2017).
Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542(2020).
Jovanovich, S., et al. Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator™ 100 and 200 systems. , S2 Genomics, Livermore, CA. https://s2genomics.com/poster-download-automated-processing-of-solid-tissues-into-single-cells-or-nuclei-with-the-singulator-100-system-scrna-seq-and-atac-seq-data-on-human-and-mouse-tissues-agbt-2022 (2022).
Bell, J., et al. Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method. Cell & Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).
Madler, S. C., et al. Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research. NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102(2021).
Wu, H., et al. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).
Han, L., et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis. Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).
Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), 1(2019).
Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets. Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).
Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746(2019).
Fleming, S. J., et al. Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender. bioRxiv. , (2022).
Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biology. 21 (1), 57(2020).
Young, M. D., Behjati, S. SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data. Gigascience. 9 (12), giaa151(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

بروتوكول بسيط وسريع ومؤتمت جزئيا لعزل النوى المفردة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل النواة المفردة

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles