يبلغ هذا البروتوكول عن طريقة فريدة لاستخدام مقياس الخلايا المتدفقة والأجسام المضادة المتعددة للتقييم المتزامن للمعلمات الوظيفية المتعددة للميتوكوندريا ، بما في ذلك التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وكميات الوحدات الفرعية المعقدة لسلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا (MRC) ، وتكرار الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطبيق تحليل قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في عضيات الدماغ ثلاثية الأبعاد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد الخلل الوظيفي للميتوكوندريا مساهما أساسيا أو ثانويا شائعا في العديد من أنواع التنكس العصبي ، وغالبا ما تظهر التغيرات في كتلة الميتوكوندريا ومجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا (MRC) ورقم نسخة الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في هذه العمليات. تلخص عضيات الدماغ البشري المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) الترتيب المعماري الخلوي ثلاثي الأبعاد (3D) للدماغ وتوفر إمكانية دراسة آليات المرض وفحص العلاجات الجديدة في نظام بشري معقد. هنا, نبلغ عن نهج فريد قائم على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في العضيات القشرية المشتقة من iPSC. يفصل هذا التقرير بروتوكولا لتوليد عضيات الدماغ القشرية من iPSCs, تفكك خلية واحدة من العضيات المتولدة, تثبيت, تلطيخ, وتحليل قياس التدفق الخلوي اللاحق لتقييم معلمات الميتوكوندريا المتعددة. تلطيخ مزدوج بالأجسام المضادة ضد الوحدة الفرعية المعقدة MRC NADH: الوحدة الفرعية Ubiquinone Oxidoreductase B10 (NDUFB10) أو عامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM) جنبا إلى جنب مع القناة الانتقائية للأنيون المعتمدة على الجهد (VDAC 1) تسمح بتقييم كمية هذه البروتينات لكل ميتوكوندريا. نظرا لأن كمية TFAM تتوافق مع كمية mtDNA ، فإنها توفر تقديرا غير مباشر لعدد نسخ mtDNA لكل محتوى من الميتوكوندريا. يمكن إكمال هذا الإجراء بأكمله في غضون 2-3 ساعات. بشكل حاسم ، يسمح بالقياس الكمي المتزامن لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة ، بما في ذلك المستويات الإجمالية والمحددة بالنسبة لكتلة الميتوكوندريا.
المقدمة
الميتوكوندريا هي عضيات خلوية أساسية والموقع الرئيسي لإنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). بالإضافة إلى توفير الطاقة للخلايا ، تشارك الميتوكوندريا أيضا في عمليات خلوية متعددة ، بما في ذلك نقل معلومات الخلية ، وتمايز الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، ولديها القدرة على تنظيم نمو الخلايا ودورة الخلية. تم تحديد التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) 1،2 ، ومرض الزهايمر (AD) 3 ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) 4. يلعب الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا دورا في عملية الشيخوخة ، حي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تمايز iPSCs إلى العضيات القشرية
- تحضير الألواح المطلية بالمصفوفة
- قم بإذابة قارورة مصفوفة الغشاء القاعدي المتوفرة تجاريا على الجليد طوال الليل. خفف إلى 1:100 في وسط النسر المعدل المتقدم المتقدم البارد / Ham's F12 DMEM / F12 (تركيز نهائي 1٪). قم بعمل حصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
- قم بإذابة محلول مصفوفة الغشاء عند 4 درجات مئوية (اتركه باردا) وقم بتغطية العدد المطلوب من الآبار (1 مل لبئر واحد في صفيحة 6 آبار). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- خذ الطبق من الحاضنة واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) (اتركه لمدة ساعة).
ملاحظة: يمكن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوفر الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا لعملية التمايز والاستراتيجيات المستخدمة لتحليل قياس التدفق الخلوي. تم استزراع iPSCs البشرية في لوحات غير ملتصقة 96 بئر لتشكيل EBs ثم نقلت إلى لوحات غير ملتصقة 6 آبار للحصول على العضيات القشرية المكتملة النمو. تم التحقق من صحة التركيب الخلوي للعضيات باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بعد التلوين المناعي باستخدام الخلايا العصبية16 والعلامات الدبقية17. تم فصل العضيات إلى خلايا مفردة لتسهيل القياس القائم على قياس التدفق ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم تقديم بروتوكول لتوليد عضيات الدماغ القشرية من iPSCs البشرية ولإجراء تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا في الخلايا المفردة المعزولة من هذه العضيات. تم التحقق من التركيب الخلوي للعضيات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر مع تلطيخ كيميائي مناعي لعلامات الخلايا العصبية والدبقية. ثبت أن الإستراتيجية القائمة على قياس التدفق الخلوي مع anti-NDUFB10 و VDAC 1 و TFAM تسمح بقياس مستويات محددة من المركب I و mtDNA بالنسبة لعدد الميتوكوندريا في الخلية. هذا البروتوكول مناسب لقياس الميتوكوندريا ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نعرب عن خالص امتناننا لغاريث جون سوليفان من معهد العلوم الطبية الأساسية في جامعة أوسلو ، النرويج ، لتزويدنا بسخاء بخط خلايا AG05836 (RRID: CVCL_2B58). نتكرم بالشكر لمركز التصوير الجزيئي ، المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بيرغن في النرويج. تم دعم هذا العمل بالتمويل التالي: تم دعم K.L جزئيا من قبل جامعة Bergen Meltzers Høyskolefonds (رقم المشروع: 103517133) و Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (رقم المشروع: 103816102). تم دعم L.A.B من قبل مجلس البحوث النرويجي (رقم المشروع: 229652) و Rakel og Otto Kr.Bruuns legat و Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأجسام المضادة التي تستخدم في قياس | |||
| المضادة ل DUFB10 Alexa Fluor 405 | NOVUS البيولوجية | NBP2-72915AF405 | |
| المضادة ل VDAC1 Alexa Fluor 647 | تقنية سانتا كروز | sc-390996 | |
| المضادة ل TFAM Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | |
| L / D طقم بقع الخلايا الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء قابلة للإصلاح | الحياة | L10119 | |
| الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ | |||
| المناعي المضاد ل Tuj1 | Abcam | ab78078 | |
| المضاد SOX2 ؛ | Abcam | ab97959 | |
| طحين مضاد لأليكسا 488 | ثيرمو فيشر Scientific | A28175 | |
| دقيق مضاد لأليكسا 594 | ثيرمو فيشر ساینتفيك | A-21442 | |
| <خلايا قوية >تجارية < / قوية > | |||
| AG05836 (RRID: CVCL_2B58) | مقدمة من غاريث جون سوليفان من معهد العلوم الطبية الأساسية في جامعة أوسلو, النرويج | ||
| أساسي 8 متوسط (iPSC ثقافة متوسط) | |||
| أساسي 8 قاعدية متوسطة | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | |
| Essential 8 (50x) 2٪ (حجم / حجم) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | |
| Store عند 4 درجات ؛ C والاحماء إلى RT قبل الاستخدام. | |||
| < قوي > الأدوات < / قوي > Heracell | |||
| 150i حاضنات CO2 | فيشر العلمية ، الولايات المتحدة | ||
| الأمريكية الهزازات المدارية - SSM1 ، SSL1 | معدات ستيوارت ، المملكة المتحدة | ||
| CCD مجهر الكاميرا لايكا DFC3000 G | Leica Microsystems ، ألمانيا | ||
| حمام المياه أكاديمية Jb الأساسية Jba5 JBA5 Grant أدوات | منح الأدوات ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| نظام شفط السوائل BVC التحكم | في Vacuubrand ، ألمانيا | ||
| Leica TCS SP8 STED مجهر متحد البؤر | Leica Microsystems ، ألمانيا | ||
| 50 مل أنبوب الصقر | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| تحليل عينات Flowjo | فلولجو ذ.م.م، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| ماصة 10 مل | سيجما-ألدريتش | SIAL1100 | |
| 1، 10، 100، 1000 مل ماصة | سيجما-ألدريتش | ||
| 40 وميكرو؛ m Cell stariner | Sigma-Aldrich | CLS431750 | |
| منخفض للغاية 96 بئر لوحة | S-BIO | MS-9096UZ | |
| الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآلي | Thermo Fisher Scientific | ||
| Neural Differentiation Medium (NDM +) < / strong> | |||
| DMEM / F12 | تقنيات الحياة | 11330032 | |
| تقنيات الحياة العصبية القاعدية | 2110349 | ||
| مكمل Glutamax 1٪ (v / v) | تقنيات الحياة | 35050 | |
| N2 supplement 0.5٪ (v / v) تقنيات | الحياة | 17502-048 | |
| ملحق B27 1٪ (v / v) | الحياة تقنيات | 17504-044 | |
| & بيتا ؛ -Mercaptoethanol 50 & micro ؛ M | Sigma-aldrich | M3148 | |
| BDNF 20 نانوغرام / مل | Peprotech | 450-02 | |
| حمض الأسكوربيك 200 & مايكرو ؛ M | Sigma-Aldrich | A92902 | |
| مخزن في 4 درجة ؛ C لمدة تصل إلى أسبوعين | |||
| <قوي> التمايز العصبي المتوسط ناقص viatmin A (NDM-) < / strong> | |||
| DMEM / F12 | تقنيات الحياة | 11330032 | |
| الحياة المتوسطة العصبية | 2110349 | ||
| مكمل Glutamax 1٪ (v / v) | تقنيات الحياة | 35050 | |
| N2 0.5٪ (v / v) | تقنيات الحياة | 17502-048 | |
| B27 الملحق W / O vit. أ 1٪ (حجم / حجم) تقنيات | الحياة | 12587010 | |
| &بيتا;-Mercaptoethanol 50 & micro; M | Sigma-aldrich | M3148 | |
| مخزن في 4 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 8 أيام | |||
| <قوي>وسيط الحث العصبي (NIM) < / قوي > | |||
| DMEM / F12 | تقنيات الحياة | 11330032 | |
| استبدال مصل خروج المغلوب 15٪ (حجم / حجم) | تقنيات الحياة | 10828028 | |
| مكمل Glutamax 1٪ (v / v) تقنيات | الحياة | 35050 | |
| بيتا ؛ - ميركابتو إيثانول 100 & ميكرو; M | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| LDN-193189 100 نانومتر | Stemgent / Reprocell | 04-0074 | |
| SB431542 10 & micro ؛ M | Tocris | 1614 | |
| XAV939 2 & micro; متجر M | Sigma-Aldrich | X3004 | |
| في 4 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 10 أيام | |||
| <قوية>متوسطة تحييد | |||
| IMDM | Life | 21980032 FBS | |
| 10٪ | سيجما-ألدريتش | 12103C | |
| <قوي>كواشف أخرى | |||
| DPBS (خال من Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | ||
| مصل الأبقار ألبومين | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | |
| تقنيات Accutase | Life | تقنيات A11105-01 | |
| تقنيات Geltrex | Life | A1413302 | |
| EDTA | Life | 15575038 | |
| تقنيات DMEM / F12 Life المتقدمة | 12634010 | ||
| الأنسجة العصبية طقم التفكك | Miltenyi biotec | 130-092-628 | |
| Y-27632 مثبط الصخور ثنائي هيدروكلوريد | Biotechne Tocris | 1254 | |
| Fluoromount-G & trade ؛ تصاعد متوسط | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| PFA | ثيرمو فيشر Scientific | 28908 |
المراجع
- Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
- Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 59....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
