Method Article

تطبيق تحليل قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في عضيات الدماغ ثلاثية الأبعاد

DOI:

10.3791/65621

⸱

August 4th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبلغ هذا البروتوكول عن طريقة فريدة لاستخدام مقياس الخلايا المتدفقة والأجسام المضادة المتعددة للتقييم المتزامن للمعلمات الوظيفية المتعددة للميتوكوندريا ، بما في ذلك التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وكميات الوحدات الفرعية المعقدة لسلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا (MRC) ، وتكرار الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الخلل الوظيفي للميتوكوندريا مساهما أساسيا أو ثانويا شائعا في العديد من أنواع التنكس العصبي ، وغالبا ما تظهر التغيرات في كتلة الميتوكوندريا ومجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا (MRC) ورقم نسخة الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في هذه العمليات. تلخص عضيات الدماغ البشري المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) الترتيب المعماري الخلوي ثلاثي الأبعاد (3D) للدماغ وتوفر إمكانية دراسة آليات المرض وفحص العلاجات الجديدة في نظام بشري معقد. هنا, نبلغ عن نهج فريد قائم على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في العضيات القشرية المشتقة من iPSC. يفصل هذا التقرير بروتوكولا لتوليد عضيات الدماغ القشرية من iPSCs, تفكك خلية واحدة من العضيات المتولدة, تثبيت, تلطيخ, وتحليل قياس التدفق الخلوي اللاحق لتقييم معلمات الميتوكوندريا المتعددة. تلطيخ مزدوج بالأجسام المضادة ضد الوحدة الفرعية المعقدة MRC NADH: الوحدة الفرعية Ubiquinone Oxidoreductase B10 (NDUFB10) أو عامل نسخ الميتوكوندريا A (TFAM) جنبا إلى جنب مع القناة الانتقائية للأنيون المعتمدة على الجهد (VDAC 1) تسمح بتقييم كمية هذه البروتينات لكل ميتوكوندريا. نظرا لأن كمية TFAM تتوافق مع كمية mtDNA ، فإنها توفر تقديرا غير مباشر لعدد نسخ mtDNA لكل محتوى من الميتوكوندريا. يمكن إكمال هذا الإجراء بأكمله في غضون 2-3 ساعات. بشكل حاسم ، يسمح بالقياس الكمي المتزامن لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة ، بما في ذلك المستويات الإجمالية والمحددة بالنسبة لكتلة الميتوكوندريا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي عضيات خلوية أساسية والموقع الرئيسي لإنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). بالإضافة إلى توفير الطاقة للخلايا ، تشارك الميتوكوندريا أيضا في عمليات خلوية متعددة ، بما في ذلك نقل معلومات الخلية ، وتمايز الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، ولديها القدرة على تنظيم نمو الخلايا ودورة الخلية. تم تحديد التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) 1،2 ، ومرض الزهايمر (AD) 3 ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) 4. يلعب الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا دورا في عملية الشيخوخة ، حيث يتراكم طفرات mtDNA الجسدية وتراجع وظيفة السلسلة التنفسية5.

تحدث أنواع مختلفة من الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا في التنكس العصبي ، والقدرة على قياس هذه التغييرات مفيدة للغاية عند دراسة آليات المرض واختبار العلاجات المحتملة. علاوة على ذلك ، يعد إنشاء أنظمة نموذجية مناسبة في المختبر تلخص المرض في خلايا الدماغ البشري أمرا حيويا لفهم آليات المرض بشكل أفضل وتطوير علاجات جديدة. وقد استخدمت iPSCs من المرضى الذين يعانون من أمراض التنكس العصبي لتوليد خلايا الدماغ المتنوعة التي تظهر تلف الميتوكوندريا 6,7,8,9. يعد تطوير عضيات الدماغ ثلاثية الأبعاد المشتقة من iPSCs خطوة رئيسية في نمذجة الأمراض. توفر هذه العضيات الدماغية المشتقة من iPSC تعقيدا وتحتوي على الخلفية الجينية للمريض ، وبالتالي توفير نموذج مرض يعكس بشكل أكثر دقة علم الأمراض في دماغ المريض.

في حين تم إجراء بعض البحوث على دراسات الميتوكوندريا باستخدام عضيات الدماغ المشتقة من iPSC 10,11,12, التقنيات المريحة والموثوقة لتحديد المعلمات الوظيفية متعددة للميتوكوندريا في عضيات الدماغ المشتقة من iPSC لا تزال محدودة. يوفر قياس التدفق الخلوي أداة قوية لقياس معلمات الميتوكوندريا على مستوى الخلية المفردة ، كما أوضحناسابقا 13. توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتوليد العضيات القشرية من iPSCs, جنبا إلى جنب مع نهج جديد قائم على قياس التدفق الخلوي لقياس معلمات متعددة في وقت واحد الميتوكوندريا, بما في ذلك كتلة الميتوكوندريا, الوحدات الفرعية المعقدة لسلسلة الجهاز التنفسي, ورقم نسخة mtDNA (الشكل 1). الأهم من ذلك ، باستخدام كتلة الميتوكوندريا كمقام ، تسمح هذه البروتوكولات للمرء بقياس المستويات الإجمالية والمحددة لكل وحدة ميتوكوندريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تمايز iPSCs إلى العضيات القشرية

  1. تحضير الألواح المطلية بالمصفوفة
    1. قم بإذابة قارورة مصفوفة الغشاء القاعدي المتوفرة تجاريا على الجليد طوال الليل. خفف إلى 1:100 في وسط النسر المعدل المتقدم المتقدم البارد / Ham's F12 DMEM / F12 (تركيز نهائي 1٪). قم بعمل حصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
    2. قم بإذابة محلول مصفوفة الغشاء عند 4 درجات مئوية (اتركه باردا) وقم بتغطية العدد المطلوب من الآبار (1 مل لبئر واحد في صفيحة 6 آبار). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. خذ الطبق من الحاضنة واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) (اتركه لمدة ساعة).
      ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق لمدة تصل إلى أسبوعين في الثلاجة (تذكر إخراجها وتسخين الآبار المطلية المطلوبة لذلك اليوم في RT حتى تختفي باردة الملمس قبل الاستخدام). يوصى باستخدام الأطباق في غضون 3 أيام. للتخزين لفترة طويلة ، أضف 1 مل من Essential 8 Medium (انظر جدول المواد) إلى اللوحة المطلية لتجنب جفاف الجل.

2. التحضير الأساسي 8 (E8) وسيط لثقافة iPSC

  1. في بيئة معقمة ، قم بإعداد E8 Medium عن طريق الجمع بين الوسط القاعدي E8 مع مكمل E8 (انظر جدول المواد). يمكن تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
    ملاحظة: قم بإذابة مكمل E8 المجمد عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل تحضير الوسط الكامل. لا ينصح بإذابة المكملات المجمدة عند 37 درجة مئوية ؛ استخدم E8 Medium لمدة أسبوعين. قبل الاستخدام، يلزم استخدام E8 Medium الدافئ لذلك اليوم في RT حتى يختفي البارد عند لمسه.

3. التثقيف الفرعي ل iPSCs

  1. ألواح مطلية بمصفوفة مسبقة التسخين في RT أو حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. قم بتسخين كمية E8 Medium اللازمة مسبقا في RT.
  2. استنشق وسط الثقافة باستخدام ماصة.
  3. شطف iPSCs (انظر جدول المواد) مع Dulbecco's محلول ملحي مخزن الفوسفات (Ca2+/Mg2+ مجانا) (DPBS-/-) (4 مل لبئر واحد في لوحة 6 آبار).
  4. أضف حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (0.5 مل) (1 مل لبئر واحد في طبق 6 آبار). احتضن عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ حواف المستعمرات في الانفصال عن اللوحة (عادة 3-5 دقائق).
  5. استنشق محلول التفكك.
  6. إضافة E8 متوسط التسخين مسبقا (4 مل لبئر واحد في لوحة 6 آبار) واستخدام الضغط العالي لفصل مستعمرات iPSC.
  7. انقله إلى بئرين مختلفين في صفيحة 6 آبار مطلية بالمصفوفة (2 مل لبئر واحد في صفيحة 6 آبار) واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: رج العبوة برفق قبل وضع الطبق في الحاضنة. يمكن أن تكون نسبة الانقسام 1: 2-1: 4.
  8. تبادل الوسائط يوميا حتى تحصل المستعمرات على التقاء 80٪ بحجم واتصالات جيدة.
    ملاحظة: راقب المستعمرات ذات الحجم المناسب ، والتي تتميز عادة بشكل دائري محدد جيدا وقطر يتراوح من 0.5 إلى 1 مم. يجب أن تظهر المستعمرات هياكل كثيفة ومضغوطة ذات حدود ناعمة محددة بوضوح.

4. تكوين الجسم الجنيني (EB) والحث العصبي

  1. تحضير وسيط الحث العصبي (NIM) من خلال الجمع بين المكونات المدرجة في جدول المواد.
  2. استنشق وسط واشطف الخلايا باستخدام DPBS -/- (4 مل لكل بئر في طبق 6 آبار).
  3. أضف Accutase الدافئ مسبقا (1 مل لكل بئر في طبق 6 آبار) (انظر جدول المواد) في البئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل من 3 إلى 4 مرات باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر.
  5. قم بتحييد الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على الخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام 2 مل DMEM مع مصل بقري الجنين (FBS) وجهاز الطرد المركزي للأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على الخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  6. أعد تعليق كريات الخلية عن طريق سحب الكريات برفق لأعلى ولأسفل حتى منصات نقالة أحادية الخلية.
  7. عد وحساب تركيز الخلايا الحية باستخدام التريبان الأزرق14 في عداد خلية آلي.
  8. احسب نسبة التخفيف وقم بتخفيف الخلايا في NIM لجعل التركيز النهائي للخلية يبلغ 60,000 خلية حية / مل.
  9. أضف مثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط ب Rho Y-27632 (التركيز النهائي 50 ميكرومتر) (انظر جدول المواد) إلى تعليق الخلية واخلطه برفق.
  10. أضف 150 ميكرولتر من نظام التعليق أحادي الخلية في كل بئر من لوحة 96 بئرا منخفضة للغاية (انظر جدول المواد) وضعها في الحاضنة. قم بالإعداد كيوم 0.
  11. في اليوم 1 ، تحقق من الخلايا وأشكال EB في كل بئر.
    ملاحظة: قم بتقييم تكوين EB الناجح بناء على مظهرها اللامع والكروي والشفاف تحت المجهر ، وقدرتها على البقاء عائمة ومنفصلة ، وغياب الخلايا الميتة ، والتي تظهر على شكل بقع داكنة.
  12. في اليوم 2 ، قم بإزالة 75 ميكرولتر من الوسط من كل بئر بعناية وأضف 150 ميكرولتر من NIM مع 50 ميكرومتر Y-27632 إلى كل بئر.
  13. في الأيام 4 و 6 و 8 ، قم بإزالة 100 ميكرولتر متوسط من كل بئر وأضف 150 ميكرولتر NIM إلى كل بئر.

5. توليد العضيات القشرية

  1. تحضير وسط التمايز العصبي مطروحا منه فيتامين أ (NDM-) من خلال الجمع بين المكونات المدرجة في جدول المواد.
  2. في اليوم 10، انقل EBs من لوحة 96 بئرا ذات الملحق المنخفض للغاية إلى لوحة 6 آبار ذات الملحق المنخفض للغاية باستخدام ماصة سعة 5 مل. انقل ثمانية EBs إلى كل بئر بحذر (الشكل 2). أضف 5 مل NDM- إلى كل بئر.
  3. ضع اللوحة على الخلاط المداري داخل الحاضنة وابدأ في الدوران بسرعة 80 دورة في الدقيقة.
  4. في الأيام 12 و 14 و 16 ، استبدل NDM- ب 4 مل بعد شفط 3 مل من الوسط القديم.

6. النضج والثقافة طويلة الأمد للعضيات القشرية

  1. تحضير وسط التمايز العصبي بفيتامين أ (NDM+) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF). للحصول على التفاصيل، راجع جدول المواد.
  2. في اليوم 18 ، قم بإزالة الوسط سعة 3 مل وأضف 4 مل NDM +.
  3. أعد اللوحة إلى ثقافة الغزل.
  4. أطعمه كل 4 أيام وحافظ على العضيات القشرية المتمايزة في NDM + حتى الاستخدام. تم استخدام العضيات القشرية التي يبلغ عمرها 25-40 يوما لتحليل المصب.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على العضيات القشرية لفترة أطول (حتى 3-4 أشهر) ؛ لكن صلاحية الخلية ستنخفض بسبب نقص التبادل الغذائي.

7. توصيف الخلايا عن طريق الكيمياء المناعية وتلوين التألق المناعي

  1. استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتجميع الوسيط برفق ووضعه برفق على وسط مع الحد الأدنى من الوسط على شريحة مجهر قياسية.
  2. اتركه يجف تماما في RT. أضف 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (300 ميكرولتر لكل عينة) لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة PFA ثم اشطفه مرتين باستخدام PBS.
    ملاحظة: PFA سام ويشتبه في أنه مسرطن. تجنب ملامسة الجلد والعينين ، والتعامل معه تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  3. أضف محلول السكروز بنسبة 30٪ (300 ميكرولتر لكل عينة) إلى الشرائح واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بحجب العضيات ونفاذها باستخدام المخزن المؤقت المانع (BB) (300 ميكرولتر لكل عينة) الذي يحتوي على PBS (مع Ca2 + / Mg2+) ، و 0.3٪ Triton X-100 ، و 10٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعتين في RT (أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية). حدد الخطوط العريضة للعضيات بقلم حاجز مسعور للحفاظ على المخزن المؤقت على الشريحة.
  5. تراكب العينات بجسم مضاد أولي في المخزن المؤقت المانع (300 ميكرولتر لكل عينة) ، ومضاد SRY (المنطقة التي تحدد الجنس Y) - المربع 2 (SOX2 ، 1: 100) ، والعلامة العصبية المضادة للعلامات العصبية درنة بيتا III (Tuj1 ، 1: 1000) ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية في الظلام (انظر جدول المواد).
  6. اغسل في PBS لمدة 3 ساعات مع تغييرين إلى ثلاثة تغييرات في المخزن المؤقت على منصة هزازة لطيفة.
  7. احتضان بجسم مضاد ثانوي (300 ميكرولتر لكل عينة) ، ودقيق الأكيكسا المضاد 488 (1: 800) ، ودقيق الأكيسا المضاد 594 (1: 800) ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة رطبة. أضف وصمة عار نووية Hoechst 33342 (1: 5000) في نفس الوقت (انظر جدول المواد).
  8. قم بشفط الجسم المضاد وشطفه بسرعة باستخدام PBS ، ثم أضف PBS الذي يحتوي على 0.01٪ NaAzide لمدة 1-2 أيام عند 4 درجات مئوية لمنع التلوث.
  9. استنشق PBS وإزالة المحلول الزائد. قم بتركيب العضيات بوسيط تركيب (انظر جدول المواد) ، ثم أضف غطاء غطاء. تجنب تكوين فقاعات الهواء وضعها في غرفة مظلمة في RT لمدة 12 ساعة على الأقل للسماح للتركيب بالبلمرة بالكامل.
    ملاحظة: العينة جاهزة الآن للتخيل تحت المجهر الفلوري.

8. تفكك العضيات القشرية

  1. أضف 30 مل DPBS -/- في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
  2. اجمع عضيات الدماغ برفق في الأنبوب باستخدام ماصة سعة 10 مل. يتم استخدام 3 عضيات على الأقل في تلطيخ واحد ، ويجب أن يكون عمرها أكثر من 25 يوما ولكن أقل من 40 يوما.
  3. عضيات الرواسب لمدة 5 دقائق تقريبا. لا تستخدم أجهزة الطرد المركزي.
  4. قم بشفط DPBS وأضف 2 مل من Accutase الدافئ مسبقا في الأنبوب. احتضان العينة في الحمام المائي لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. قم بترتيث 15 مرة برفق باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر دون توليد فقاعات. احتضان العينة لمدة 5 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  6. يتم فصلها برفق باستخدام أطراف ماصة سعة 1000 ميكرولتر 15 مرة دون توليد فقاعات (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: إذا كان لا يزال هناك بعض الخلايا غير المنفصلة ، فقم بنقل الخلايا غير المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل ثم احتضانه لمدة 5 دقائق أخرى عند حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم انفصلك برفق باستخدام أطراف ماصة سعة 1000 ميكرولتر 20 مرة.
  7. قم بتحييد الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على الخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام 4 مل من DMEM مع FBS وجهاز طرد مركزي.
  8. قم بالشفط الطافي وإعادة التعليق باستخدام 200 ميكرولتر DPBS باستخدام أطراف ماصة 1000 ميكرولتر 10 مرات دون توليد فقاعات.
  9. أضف 200 ميكرولتر DPBS لتكوين حجم إجمالي يبلغ 400 ميكرولتر من معلقات الخلايا في DPBS.
  10. قم بالفلتر أو أنبوب الفلتر (استخدم مرشحات 35 أو 40 ميكرومتر واشطف الفلتر باستخدام DPBS قبل استخدام الفلتر).
  11. افصل نصف المحلول في أنبوب واستخدمه كعينة غير ملطخة.

9. قياس قياس التدفق الخلوي للوحدات الفرعية المعقدة MRC و TFAM في الخلايا الثابتة

  1. أضف صبغة تلطيخ حية وميتة (L / D) (1: 1000) (انظر جدول المواد) (إما باللون الأحمر البعيد أو الأشعة تحت الحمراء القريبة ، اعتمادا على إعداد علامات قياس التدفق الخلوي).
    ملاحظة: إذا تم فتح قارورة جديدة لصبغة L / D ، أضف 50 ميكرولتر DMSO لإعادة التكوين وقم بعمل 10 ميكرولتر لتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  2. يحفظ في RT والظلام لمدة 30 دقيقة. أضف 40 مل DPBS -/-. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. أعد التعليق في معلق أحادي الخلية بعد التخلص من المادة الطافية.
  4. قم بإصلاح الخلايا وتنفذها ب 1 مل من الميثانول المثلج البارد بنسبة 90٪ عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. قم بحظر العينات في مخزن كتلة 1 مل يحتوي على 0.3 M glycine و 5٪ مصل الماعز و 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS (مع Ca2 + / Mg2+).
  6. يغسل بمخزن مؤقت للتدفق سعة 20 مل يحتوي على PBS (مع Ca2 +/Mg2+) مع 0.2٪ BSA مرة أو مرتين.
  7. أضف الأجسام المضادة الأولية المضادة NDUFB10 المترافقة مع Alexa Fluor 405 (1:100) ، ومضاد VDAC 1 مترافق مع Alexa Fluor PE (1: 100) والجسم المضاد المضاد ل TFAM المقترن ب Alexa Fluor 488 (1: 200) لمدة 30 دقيقة (انظر جدول المواد).
  8. يغسل بمخزن مؤقت للتدفق 20 مل.
  9. استنشق واترك ما يقرب من 100 ميكرولتر وأعد تشكيل كريات الخلية في 300 ميكرولتر مخزن مؤقت للتدفق.
  10. نقل الخلايا إلى أنابيب تدفق 1.5 مل. ابق في الظلام والجليد.
  11. قم بالتحليل على مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد). تم الكشف عن إشارات Anti NDUFB10-Alexa 405 باستخدام مرشح ممر النطاق 450/50 ، و TFAM-Alexa 488 باستخدام مرشح ممر النطاق 530/30 ، و VDAC 1-Alexa 647 باستخدام مرشح ممر النطاق 670/14 وصبغة L / D في مرشح ممر النطاق 780/60 (الشكل 3 ب).

10. اكتساب وتحليل قياس التدفق الخلوي

  1. استخدم عينات غير ملطخة ومفردة من جهاز التحكم لضبط جهد إعدادات مقياس الخلايا.
  2. استخدم أنبوب التحكم غير الملوثة لضبط منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومخططات مبعثر منطقة التشتت الجانبية (SSC-A) بناء على حجم ودقة مجموعة الخلايا (الشكل 4 أ).
  3. قم بإخراج الحطام لتحديد الخلايا الحية من مخططات FSC-A و SSC-A. بوابة مضاعفة باستخدام ارتفاع مبعثر الجانب (SSC-H) مقابل. مؤامرة SSC-A (الشكل 4 ب).
  4. حدد الخلايا الحية بناء على تلطيخ صبغة L / D عن طريق التبديل إلى APC-cy7 مقابل. مؤامرة FSC-A (الشكل 4 ج).
  5. باستخدام العينات غير الملوثة لكل سطر ، ارسم بوابة فوق المجموعة الرئيسية للأحداث في FSC-A مقابل. قنوات الفلوروكروم (FITC ، APC ، BV 421) المؤامات.
  6. إعداد يعوض مقياس التدفقالخلوي 15.
  7. استخدم التحكم في النمط المتماثل للتحكم السلبي لمراقبة تلطيخ الخلفية.
  8. إجراء الحصول على البيانات.
    1. حدد الخلايا الحية بناء على تلطيخ صبغة L / D عن طريق التبديل إلى APC-cy7 مقابل. مؤامرة FSC-A (الشكل 4C).
    2. استخدم غير الملوثة كتحكم سلبي. ثم ، أثناء فحص FSC-A مقابل. تنشئ مخططات قنوات الفلوروكروم (FITC ، APC ، BV 421) بوابة فوق المجموعة الرئيسية للأحداث أحادية الخلية (الشكل 4D-F).
  9. قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo (انظر جدول المواد).
    1. قم بتكرار مواضع البوابات على عينات الخلايا الملطخة. قم بتوثيق عدد الخلايا التي تظهر عليها تلطيخا إيجابيا.
    2. لكل مجموعة مستهدفة ، قم بتقييم متوسط شدة التألق (MFI) للقنوات المختلفة (FITC ، APC ، BV 421) المرسومة على المحور X للرسم البياني لتحديد إشارة الميتوكوندريا. يمكن تحديد القيم المحددة للوحدة الفرعية المعقدة I NDUFB10 و TFAM بقسمة MFI للتعبير المركب أو TFAM على مؤشر كتلة الميتوكوندريا ، VDAC 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا لعملية التمايز والاستراتيجيات المستخدمة لتحليل قياس التدفق الخلوي. تم استزراع iPSCs البشرية في لوحات غير ملتصقة 96 بئر لتشكيل EBs ثم نقلت إلى لوحات غير ملتصقة 6 آبار للحصول على العضيات القشرية المكتملة النمو. تم التحقق من صحة التركيب الخلوي للعضيات باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بعد التلوين المناعي باستخدام الخلايا العصبية16 والعلامات الدبقية17. تم فصل العضيات إلى خلايا مفردة لتسهيل القياس القائم على قياس التدفق ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول لتوليد عضيات الدماغ القشرية من iPSCs البشرية ولإجراء تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا في الخلايا المفردة المعزولة من هذه العضيات. تم التحقق من التركيب الخلوي للعضيات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر مع تلطيخ كيميائي مناعي لعلامات الخلايا العصبية والدبقية. ثبت أن الإستراتيجية القائمة على قياس التدفق الخلوي مع anti-NDUFB10 و VDAC 1 و TFAM تسمح بقياس مستويات محددة من المركب I و mtDNA بالنسبة لعدد الميتوكوندريا في الخلية. هذا البروتوكول مناسب لقياس الميتوكوندريا ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعرب عن خالص امتناننا لغاريث جون سوليفان من معهد العلوم الطبية الأساسية في جامعة أوسلو ، النرويج ، لتزويدنا بسخاء بخط خلايا AG05836 (RRID: CVCL_2B58). نتكرم بالشكر لمركز التصوير الجزيئي ، المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بيرغن في النرويج. تم دعم هذا العمل بالتمويل التالي: تم دعم K.L جزئيا من قبل جامعة Bergen Meltzers Høyskolefonds (رقم المشروع: 103517133) و Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (رقم المشروع: 103816102). تم دعم L.A.B من قبل مجلس البحوث النرويجي (رقم المشروع: 229652) و Rakel og Otto Kr.Bruuns legat و Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الأجسام المضادة التي تستخدم في قياس
المضادة ل DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS البيولوجيةNBP2-72915AF405
المضادة ل VDAC1 Alexa Fluor 647تقنية سانتا كروزsc-390996
المضادة ل TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L / D طقم بقع الخلايا الميتة القريبة من الأشعة تحت الحمراء قابلة للإصلاحالحياةL10119
الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ
المناعي المضاد ل Tuj1Abcamab78078
المضاد SOX2   ؛Abcamab97959
طحين مضاد لأليكسا 488ثيرمو فيشر ScientificA28175
دقيق مضاد لأليكسا 594ثيرمو فيشر ساینتفيكA-21442
<خلايا قوية >تجارية < / قوية >
AG05836 (RRID: CVCL_2B58)مقدمة من غاريث جون سوليفان من معهد العلوم الطبية الأساسية في جامعة أوسلو, النرويج
أساسي 8 متوسط (iPSC ثقافة متوسط)
أساسي 8 قاعدية متوسطة Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 (50x) 2٪ (حجم / حجم)Thermo Fisher ScientificA1517101
Store عند 4 درجات ؛ C والاحماء إلى RT قبل الاستخدام.
< قوي > الأدوات < / قوي > Heracell
150i حاضنات CO2فيشر العلمية ، الولايات المتحدة
الأمريكية الهزازات المدارية - SSM1 ، SSL1معدات ستيوارت ، المملكة المتحدة
CCD مجهر الكاميرا لايكا DFC3000 GLeica Microsystems ، ألمانيا
حمام المياه أكاديمية Jb الأساسية Jba5 JBA5 Grant أدواتمنح الأدوات ، الولايات المتحدة الأمريكية
نظام شفط السوائل BVC التحكمفي Vacuubrand ، ألمانيا
Leica TCS SP8 STED مجهر متحد البؤرLeica Microsystems ، ألمانيا
50 مل أنبوب الصقرSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية
تحليل عينات Flowjoفلولجو ذ.م.م، الولايات المتحدة الأمريكية
ماصة 10 ملسيجما-ألدريتشSIAL1100
1، 10، 100، 1000 مل ماصةسيجما-ألدريتش
40 وميكرو؛ m Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
منخفض للغاية 96 بئر لوحةS-BIOMS-9096UZ
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآليThermo Fisher Scientific
Neural Differentiation Medium  (NDM +) < / strong>
DMEM / F12تقنيات الحياة11330032
تقنيات الحياة العصبية القاعدية2110349
مكمل Glutamax 1٪ (v / v)تقنيات الحياة35050
N2 supplement 0.5٪ (v / v) تقنياتالحياة17502-048
ملحق B27 1٪ (v / v)الحياة تقنيات17504-044
& بيتا ؛ -Mercaptoethanol 50 & micro ؛ MSigma-aldrichM3148
BDNF 20 نانوغرام / ملPeprotech450-02
حمض الأسكوربيك 200 & مايكرو ؛ MSigma-Aldrich A92902
مخزن في 4 درجة ؛ C لمدة تصل إلى أسبوعين
<قوي> التمايز العصبي المتوسط ناقص viatmin A (NDM-) < / strong>
DMEM / F12تقنيات الحياة11330032
الحياة المتوسطة العصبية2110349
مكمل Glutamax 1٪ (v / v)تقنيات الحياة35050
N2 0.5٪ (v / v)تقنيات الحياة17502-048
B27 الملحق W / O vit. أ 1٪ (حجم / حجم) تقنياتالحياة12587010
&بيتا;-Mercaptoethanol 50 & micro; MSigma-aldrichM3148
مخزن في 4 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 8 أيام
<قوي>وسيط الحث العصبي (NIM) < / قوي >
DMEM / F12تقنيات الحياة11330032
استبدال مصل خروج المغلوب 15٪ (حجم / حجم)تقنيات الحياة10828028
مكمل Glutamax 1٪ (v / v) تقنياتالحياة35050
بيتا ؛ - ميركابتو إيثانول 100 & ميكرو; MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 نانومترStemgent / Reprocell04-0074
SB431542 10 & micro ؛ MTocris1614
XAV939 2 & micro; متجر MSigma-AldrichX3004
في 4 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 10 أيام
<قوية>متوسطة تحييد
IMDMLife21980032 FBS
10٪سيجما-ألدريتش12103C
<قوي>كواشف أخرى
DPBS (خال من Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific
مصل الأبقار ألبومينEuropa BioproductsEQBAH62-1000
تقنيات AccutaseLifeتقنيات A11105-01
تقنيات GeltrexLifeA1413302
EDTALife15575038
تقنيات DMEM / F12 Life المتقدمة12634010
الأنسجة العصبية طقم التفككMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 مثبط الصخور ثنائي هيدروكلوريدBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G & trade ؛ تصاعد متوسطSouthernBiotech0100-20
PFAثيرمو فيشر Scientific28908
التدفق الخلوي تقنيات الفلورمكمل مرفق تقنيات 14190250 تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  3. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  4. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  5. Trifunovic, A., Larsson, N. G. Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing. Journal of Internal Medicine. 263 (2), 167-178 (2008).
  6. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  7. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  10. Xu, L., et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome iPSC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1868 (6), 166388(2022).
  11. Liu, C., et al. Mitochondrial HSF1 triggers mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Huntington's disease. EMBO Molecular Medicine. 14 (7), e15851(2022).
  12. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  13. Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives. The Journal of Visualized Experiments. 177, e63116(2021).
  14. Strober, W. Trypan Blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  15. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. Chapter 1 (Unit 1), 14(2002).
  16. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biology. 6 (1), 204(2005).
  17. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  18. Xiang, Y., et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 47 (1), e61(2018).
  19. Pevny, L., Placzek, M. SOX genes and neural progenitor identity. Current Opinion in Neurobiology. 15 (1), 7-13 (2005).
  20. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cytoskeleton and Cell Motility. 17 (2), 118-132 (1990).
  21. Rosebrock, D., et al. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nature Cell Biology. 24 (6), 981-995 (2022).
  22. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  23. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  24. Yan, Y., Zhang, S. C. Generation of cerebral cortical neurons from human pluripotent stem cells in 3D culture. Methods in Molecular Biology. 2683, 1-11 (2023).
  25. Pamies, D., et al. Human IPSC 3D brain model as a tool to study chemical-induced dopaminergic neuronal toxicity. Neurobiology of Disease. 169, 105719(2022).
  26. Pamies, D., Hartung, T., Hogberg, H. T. Biological and medical applications of a brain-on-a-chip. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J. : Online). 239 (9), 1096-1107 (2014).
  27. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  28. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryBrain OrganoidsMitochondrial ParametersiPSC Derived OrganoidsMitochondrial DysfunctionSingle Cell DissociationMitochondrial MassMRC ComplexesTFAM StainingmtDNA Copy Number
Video Coming Soon

Related Articles