يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحضير وتلطيخ التألق المناعي للحزم وخلايا الألياف المفردة من قشرة ونواة عدسة العين

3.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65638

⸱

يونيو 9, 2023

 , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طرقا لإعداد خلايا ألياف عدسة العين المحيطية والناضجة والنووية للتلطيخ المناعي لدراسة التداخل المعقد من خلية إلى أخرى وبنية الغشاء.

الملخص

العدسة عبارة عن عضو شفاف وبيضاوي الشكل في الحجرة الأمامية للعين يتغير شكله لتركيز الضوء بدقة على شبكية العين لتشكيل صورة واضحة. يتكون الجزء الأكبر من هذا النسيج من خلايا ليفية متخصصة ومتمايزة لها مقطع عرضي سداسي وتمتد من القطب الأمامي إلى القطب الخلفي للعدسة. هذه الخلايا الطويلة والنحيفة تعارض بشدة الخلايا المجاورة ولها تداخلات معقدة على طول الخلية. الهياكل المتشابكة المتخصصة مطلوبة للخصائص الميكانيكية الحيوية العادية للعدسة وقد تم وصفها على نطاق واسع باستخدام تقنيات المجهر الإلكتروني. يوضح هذا البروتوكول الطريقة الأولى للحفاظ على وتلوين المفرد وكذلك حزم خلايا ألياف عدسة الماوس للسماح بالتوطين التفصيلي للبروتينات داخل هذه الخلايا ذات الشكل المركب. توضح البيانات التمثيلية تلطيخ خلايا الألياف الطرفية والتمايزية والناضجة والنووية في جميع مناطق العدسة. يمكن استخدام هذه الطريقة على خلايا الألياف المعزولة من عدسات الأنواع الأخرى.

المقدمة

العدسة عبارة عن نسيج شفاف وبيضاوي الشكل في الحجرة الأمامية للعين يتكون من نوعين من الخلايا ، الخلايا الظهارية والليفية 1 (الشكل 1). هناك طبقة أحادية من الخلايا الظهارية التي تغطي نصف الكرة الأمامي للعدسة. تتمايز الخلايا الليفية عن الخلايا الطلائية، وتشكل الجزء الأكبر من العدسة. تخضع خلايا الألياف عالية التخصص لبرمجة الاستطالة والتمايز والنضج ، والتي تتميز بتغيرات واضحة في مورفولوجيا غشاء الخلية من محيط العدسة إلى مركز العدسة2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12، المعروف أيضا باسم نواة العدسة. تعتمد وظيفة العدسة في التركيز الدقيق للضوء القادم من مسافات مختلفة على شبكية العين على خصائصها الميكانيكية الحيوية ، بما في ذلك الصلابة والمرونة13،14،15،16،17،18،19. تم افتراض التداخلات المعقدة لألياف العدسة20,21 وثبت مؤخرا أنها مهمة لصلابةالعدسة 22,23.

figure-introduction-1
الشكل 1: مخططات تشريح العدسة وصور المجهر الإلكتروني الماسح التمثيلي (SEM) من ألياف العدسة. يظهر الرسم الكاريكاتوري منظرا طوليا (من الأمام إلى الخلف من الأعلى إلى الأسفل) للطبقة الأحادية الأمامية للخلايا الظهارية (مظللة باللون الأزرق الفاتح) وكتلة كبيرة من خلايا ألياف العدسة (بيضاء). يعرف مركز العدسة (المظلل باللون الوردي) باسم النواة ويتكون من خلايا ليفية مضغوطة للغاية. على اليمين ، يكشف رسم كاريكاتوري مقطع عرضي عن شكل الخلية السداسية الممدودة لألياف العدسة المعبأة في نمط قرص العسل. الخلايا الليفية لها جانبان عريضان وأربعة جوانب قصيرة. تظهر صور SEM التمثيلية على طول الجزء السفلي التداخل الغشائي المعقد بين خلايا ألياف العدسة على أعماق مختلفة من العدسة. من اليمين ، تحتوي ألياف العدسة المشكلة حديثا في محيط العدسة على نتوءات صغيرة على طول الجوانب القصيرة والكرات والمقابس على طول الجانب العريض (الصناديق الحمراء). أثناء النضج ، تطور ألياف العدسة مجالات مجداف كبيرة مزينة بنتوءات صغيرة على طول الجوانب القصيرة (الصناديق الزرقاء). تحتوي خلايا الألياف الناضجة على مجالات مجداف كبيرة موضحة بنتوءات صغيرة. هذه المجالات المتشابكة مهمة للخصائص الميكانيكية الحيوية للعدسة. تحتوي الخلايا الليفية في نواة العدسة على عدد أقل من النتوءات الصغيرة على طول جوانبها القصيرة ولها تداخلات معقدة بين اللسان والأخدود (مربعات أرجوانية). تعرض الجوانب العريضة للخلية مورفولوجيا غشاء كروي. تم تعديل الرسوم المتحركة من22,32 ولم يتم رسمها على نطاق واسع. شريط المقياس = 3 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تنمو العدسة عن طريق إضافة أغلفة من خلايا الألياف الجديدة المتراكبة فوق الأجيال السابقة من الألياف24,25. الخلايا الليفية لها شكل مقطع عرضي سداسي ممدود مع جانبين عريضين وأربعة جوانب قصيرة. تمتد هذه الخلايا من القطب الأمامي إلى القطب الخلفي للعدسة ، واعتمادا على الأنواع ، يمكن أن يصل طول ألياف العدسة إلى عدة ملليمترات. لدعم بنية هذه الخلايا الممدودة والنحيفة ، تخلق التداخلات المتخصصة على طول الجانبين العريض والقصير هياكل متشابكة للحفاظ على شكل العدسة والخصائص الميكانيكية الحيوية. تم توثيق التغييرات في شكل غشاء الخلية أثناء تمايز الخلايا الليفية ونضجها على نطاق واسع من خلال دراسات المجهر الإلكتروني (EM)2،3،4،5،6،7،8،9،10،20،26،27،28،29. تحتوي الخلايا الليفية المشكلة حديثا على كرات ومآخذ على طول جوانبها العريضة مع نتوءات صغيرة جدا على طول جوانبها القصيرة ، بينما تحتوي الألياف الناضجة على نتوءات ومجاديف متشابكة على طول جوانبها القصيرة. تعرض الألياف النووية تداخلات اللسان والأخدود ومورفولوجيا الغشاء الكروي. لا يعرف سوى القليل عن البروتينات المطلوبة لهذه الأغشية المتشابكة المعقدة. اعتمدت الدراسات السابقة حول توطين البروتين في خلايا الألياف على أقسام أنسجة العدسة ، والتي لا تسمح بتصور واضح لبنية الخلية المعقدة.

ابتكر هذا العمل وأتقن طريقة جديدة لإصلاح خلايا ألياف العدسة المفردة والحزم للحفاظ على التشكل المعقد والسماح بتلطيخ المناعة للبروتينات في غشاء الخلية وداخل السيتوبلازم. تحافظ هذه الطريقة بأمانة على بنية غشاء الخلية ، مقارنة بالبيانات من دراسات EM ، وتسمح بتلطيخ الأجسام المضادة الأولية لبروتينات معينة. لقد سبق لنا أن خضعنا ألياف العدسات القشرية الملطخة بالمناعة والتي تخضع للتمايز والنضج22,23. في هذا البروتوكول ، هناك أيضا طريقة جديدة لتلطيخ خلايا الألياف من نواة العدسة. يفتح هذا البروتوكول الباب لفهم آليات التكوين والتغيرات في تداخل الغشاء أثناء نضوج الخلايا الليفية وضغط نواة العدسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الاعتناء بالفئران بناء على بروتوكول حيواني وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة إنديانا بلومنجتون. كانت الفئران المستخدمة لتوليد بيانات تمثيلية هي التحكم (من النوع البري) في خلفية C57BL6 / J ، وأنثى ، وعمر 8-12 أسبوعا. يمكن استخدام كل من ذكور وإناث الفئران في هذه التجربة ، لأنه من غير المرجح أن يؤثر جنس الفئران على نتيجة التجربة.

1. تشريح العدسة وفك الكبسولة

  1. القتل الرحيم للفئران باتباع "دليل رعاية واستخدام المختبر" الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة بالإضافة إلى بروتوكولات استخدام الحيوانات المعتمدة من قبل المؤسسة.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من CO2 متبوعة بخلع عنق الرحم وفقا لبروتوكول حيواني معتمد (جامعة إنديانا).
  2. استئصال العينين من الفئران باستخدام ملقط منحني عن طريق الضغط على الأنسجة حول العينين مع جانب واحد من الملقط لإزاحة العين من التجويف. بعد ذلك ، أغلق الملقط الموجود أسفل العين وارفعه لإزالة العين من التجويف. انقل العينين إلى محلول ملحي طازج 1x مخزن بالفوسفات (PBS) في صينية تشريح.
  3. قطع العصب البصري مع مقص دقيق للغاية أقرب ما يمكن إلى مقلة العين. أدخل بعناية ملاقط مستقيمة ذات طرف رفيع في مقلة العين من خلال مخرج العصب البصري في الجزء الخلفي من العين.
  4. أدخل المقص بعناية في نفس موقع الملقط في الخطوة 1.3 وابدأ في قطع شق من الخلف باتجاه تقاطع القرنية الصلبة.
    ملاحظة: عدسات القوارض تحتل ~ 30٪ من عيونهم. سيحدث تلف عرضي إذا تم إدخال الملقط أو المقص في عمق العين.
  5. استمر في القطع على طول تقاطع القرنية الصلبة حتى يتم فصل نصف الوصلة على الأقل.
  6. استخدم الملقط للضغط برفق على القرنية حتى تتمكن العدسة من الخروج من خلال الشق المصنوع بالخطوتين 1.4 و 1.5.
  7. قم بإزالة أي قطع كبيرة من الأنسجة بعناية من العدسة باستخدام ملاقط مستقيمة ذات طرف رفيع. افحص العدسة للعثور على المنطقة الاستوائية.
  8. اخترق العدسة بسطحية باستخدام ملاقط مستقيمة ذات طرف رفيع ، ثم قم بإزالة كبسولة العدسة. ستبقى كتلة خلايا ألياف العدسة سليمة ، وستظل الطبقة الأحادية الطلائية للعدسة متصلة بكبسولة العدسة. تخلص من كبسولة العدسة.

2. تلطيخ خلية الألياف المفردة للعدسة

  1. انقل كتلة خلية ألياف العدسة إلى صفيحة بئر تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهايد الطازج بنسبة 1٪ (PFA ؛ في 1x PBS) واحتضان العينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع التقطيع اللطيف (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: تم تحسين أحجام الحلول المقدمة لألواح 48 بئرا. إذا تم استخدام لوحة أو أنابيب جيدة بحجم آخر ، فاضبط أحجام المحاليل وفقا لذلك. تم إجراء حلول التثبيت والحجب والغسيل (1x PTX ، 0.1٪ Triton X-100 in 1x PBS) باستخدام 10x PBS وماء مقطر مزدوج (ddH2O) إلى تركيز نهائي قدره 1x PBS.
  2. انقل خلايا ألياف العدسة إلى طبق 60 مم مع 1٪ PFA. استخدم مشرطا حادا لتقسيم كرة الخلايا الليفية إلى نصفين على طول محورها الأمامي الخلفي (الشكل 2 ب). قطع النصفين إلى النصف مرة أخرى على طول نفس المحور لإنتاج أرباع.
    ملاحظة: يمكن التعرف بسهولة على المحور الأمامي الخلفي من خلال اتجاه خلايا الألياف في كتلة الأنسجة.
  3. استخدم ملاقط مستقيمة لإزالة منطقة النواة من أرباع خلايا ألياف العدسة (الشكل 2C).
    ملاحظة: تكون منطقة نواة العدسة صلبة في عدسات القوارض ، وسوف ينفصل مركز العدسة عن الألياف القشرية الأكثر ليونة بسهولة.
  4. بعد التثبيت أرباع منطقة قشرة العدسة في 200 ميكرولتر من 1٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع اهتزاز لطيف (300 دورة في الدقيقة على شاكر اللوحة).
  5. اغسل أرباع المناديل مرتين في 750 ميكرولتر من 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما مع رج لطيف في RT.
  6. قم بحظر العينات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الحجب (5٪ مصل ، 0.3٪ Triton X-100 ، 1x PBS) لمدة 1 ساعة في RT مع اهتزاز لطيف.
    ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية في هذا البروتوكول ، لم تكن العينات ملطخة بالأجسام المضادة الأولية أو الثانوية. بعد خطوة الحجب ، تم تحضين العينات ب agglutinin جرثومة القمح (WGA ؛ 1: 100) و phalloidin (1: 100) (انظر جدول المواد) لمدة 3 ساعات في RT مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء. تم إثبات تلطيخ الأجسام المضادة الأولية في المنشورات السابقة22,23.
  7. احتضن مع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
    ملاحظة: يتم تخفيف الأجسام المضادة في محلول مانع. بالمقارنة مع الشرائح ذات أقسام الأنسجة ، هناك المزيد من الخلايا في هذا النوع من التحضير. يجب زيادة تركيزات الأجسام المضادة الأولية لتوفير أجسام مضادة وافرة لتلطيخ المزيد من الخلايا. يوصى بمضاعفة تركيز الأجسام المضادة مما يستخدم في أقسام الأنسجة. الأمر نفسه ينطبق على الأجسام المضادة الثانوية.
  8. اغسل أرباع المناديل ثلاث مرات باستخدام 1x PTX (0.1٪ Triton X-100 ، 1x PBS) لمدة 5 دقائق لكل منها في RT مع اهتزاز لطيف.
  9. احتضان خلايا الألياف ب 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة / الصبغة الثانوية لمدة 3 ساعات في RT مع اهتزاز لطيف. حماية العينات من الضوء خلال هذه الخطوة والخطوات اللاحقة.
    ملاحظة: يمكن إضافة WGA و phaloidin والأصباغ الفلورية الأخرى إلى محلول الأجسام المضادة الثانوي لوضع العلامات المتزامنة على غشاء الخلية أو الهيكل الخلوي أو العضيات الأخرى مع تسمية الجسم المضاد الأساسي أيضا.
  10. اغسل خلايا الألياف أربع مرات باستخدام 1x PTX لمدة 5 دقائق لكل منها في RT مع اهتزاز لطيف.
  11. أضف قطرة واحدة أو 50 ميكرولتر من وسائط التركيب على شريحة مجهر مشحونة زائد قبل نقل أرباع الأنسجة إلى الشريحة.
  12. استخدم الملقط لفصل خلايا الألياف برفق عن بعضها البعض وحاول الحد من تداخل حزم الخلايا.
  13. ضع غطاء #1.5 برفق أعلى العينة في وسائط التركيب. يجب أن تنتشر وسائط التركيب إلى حافة غطاء الغطاء ؛ إذا لم يحدث ذلك، فأضف بعض وسائط التركيب الإضافية إلى حافة قسيمة الغطاء. قم بشفط أي وسائط تثبيت زائدة حول حافة غطاء الغطاء واستخدم طلاء الأظافر لإغلاق حواف غطاء الغطاء على الشريحة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع من وسائط التركيب المصممة للفحص المجهري متحد البؤر لهذه التجارب.

3. تلطيخ خلية الألياف المفردة لنواة العدسة

  1. أكمل التشريح الموضح في القسم 1.
  2. قم بإزالة الألياف القشرية ميكانيكيا من كرة خلايا ألياف العدسة ، تاركا نواة العدسة ، عن طريق نقل كتلة الخلايا الليفية برفق إلى أطراف الأصابع المبللة والقفاز ولف كتلة الأنسجة برفق.
    ملاحظة: في عدسات الماوس ، يعد دحرجة كرة خلايا ألياف العدسة بين أطراف الأصابع القفاز طريقة فعالة لإزالة خلايا الألياف القشرية من نواة العدسة الصلبة28,30. بالنسبة للعدسات التي لا تكون فيها هذه الطريقة الميكانيكية فعالة ، يمكن استخدام تشريح دقيق أو طريقة دوامة29 لإزالة خلايا الألياف القشرية.
  3. انقل نواة العدسة إلى محلول PFA 1٪ طازج في طبق جيد واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
  4. انقل العينة إلى طبق 60 مم مع 1٪ PFA واستخدم مشرطا حادا لتقسيم نواة العدسة على طول المحور الأمامي الخلفي. اقطع عينات الأنسجة إلى النصف مرة أخرى لإنتاج أرباع النواة.
  5. اتبع العملية الموضحة في الخطوات 2.4-2.13 للتلطيخ المناعي وتركيب العينة.

figure-protocol-1
الشكل 2: ملخص بياني يوضح بالتفصيل تحضير خلايا ألياف العدسة وتلطيخها المناعي . (أ) تم ترميز هذه اللوحة المكونة من 48 بئرا بالألوان حسب العمود لتوضيح إعداد لوحة العينة للطرق الموصوفة ، مما يسمح بسهولة نقل العينات بين خطوات التلوين المناعي المختلفة عن طريق المناولة اللطيفة باستخدام الملقط. في حين أن البيانات التمثيلية لهذا البروتوكول لا يتم تحضينها بجسم مضاد أولي ، فإن الرسم البياني يتضمن عمودا لحضانة الأجسام المضادة الأولية ، ويمكن إعادة استخدام آبار الغسيل بعد إزالة مخازن الغسيل المستخدمة عن طريق الشفط. (ب) بعد تثبيت كتلة خلية الليفة العدسة، ينقسم النسيج على طول المحور الأمامي الخلفي (خطوط حمراء متقطعة) للحفاظ على التركيب الأصلي للخلايا. بمجرد خفض كتلة الأنسجة إلى النصف ، يتم تدوير العينات وتقسيم النصفين إلى أرباع على طول المحور الأمامي الخلفي (خطوط حمراء متقطعة). (ج) تتم إزالة منطقة نواة العدسة (باللون الوردي) بسهولة باستخدام ملاقط لاستخراج الأنسجة المركزية الكثيفة من خلايا الألياف القشرية (باللون الأزرق). تم إنشاء مخططات الرسوم المتحركة جزئيا باستخدام BioRender.com ولم يتم رسمها على نطاق واسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تحضير خلايا ألياف العدسة من قشرة العدسة (الألياف المتمايزة والألياف الناضجة) والنواة ، ويتم تلطيخ الخلايا بالقضيب ل F-actin و WGA لغشاء الخلية. يتم ملاحظة وتصوير خليط من حزم الخلايا أو ألياف العدسة المفردة (الشكل 3). من قشرة العدسة ، تم العثور على نوعين من الخلايا (الشكل 3 أ). تكون خلايا الألياف المتمايزة في محيط العدسة مستقيمة، مع نتوءات صغيرة جدا على طول جوانبها القصيرة. عندما تتمايز الخلية ، تصبح خلايا الألياف متموجة مع نتوءات صغيرة متشابكة. علاوة على ذلك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد أظهر هذا البروتوكول طرق التثبيت والحفظ والمناعة التي تحافظ بأمانة على مورفولوجيا غشاء 3D للحزم أو خلايا ألياف العدسة المفردة من أعماق مختلفة في العدسة. تتم مقارنة ألياف العدسة الملطخة مع مستحضرات SEM التي تستخدم منذ فترة طويلة لدراسة مورفولوجيا خلايا ألياف العدسة. تظهر النتائج هياكل غشائية قابلة للمقارنة بين كلا المستحضرين. يظل EM هو المعيار الذهبي لدراسة مورفولوجيا الخلية ، لكن وضع العلامات المناعية أكثر صعوبة في عينات SEM لتوطين البروتينات33،34،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة R01 EY032056 (إلى CC) من المعهد الوطني للعيون. يشكر المؤلفون الدكتورة تيريزا فاسيل وكيمبرلي فاندربول في مرفق سكريبس للأبحاث المجهرية الأساسية لمساعدتهم في صور المجهر الإلكتروني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100% Triton X-100FisherScientificBP151-500
60mm plateFisherScientificFB0875713A
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
10X phosphate buffered salineThermoFisher70011-044
1X phosphate buffered salineThermoFisher14190136
48-well plateCytoOneCC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)FisherScientific12-553-467
Curved tweezersWorld Precision Instruments501981
Dissection microscopeCarl ZeissStereo Discovery V8
Fine tip straight tweezersElectron Microscopy Sciences72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherScientific12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 SoftwareCarl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin (rhodamine)ThermoFisherR415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11VWR76241-186
Secondary antibody
Straight forcepsWorld Precision Instruments11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)FisherScientific12-565-154
Ultra-fine scissorsWorld Precision Instruments501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)Vector LaboratoriesFL-1021-5

المراجع

  1. Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
  2. Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
  4. Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
  5. Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
  6. Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
  7. Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
  8. Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
  9. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
  10. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
  11. Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
  12. Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
  13. Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
  14. Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
  15. Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
  16. Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
  17. Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
  18. Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
  19. Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
  20. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
  21. Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
  22. Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
  23. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  24. Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
  25. Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
  26. Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
  27. Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
  28. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
  29. Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2(2022).
  30. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986(2016).
  31. Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1(2016).
  32. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
  33. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  34. Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
  35. Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
  36. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التحضير وتلطيخ التألق المناعي للحزم وخلايا الألياف المفردة من قشرة ونواة عدسة العين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.