توضح هذه المقالة كيفية الطباعة الحيوية للهلاميات المائية القابلة للطباعة الضوئية 3D لدراسة تصلب المصفوفة خارج الخلية وتنشيط الخلايا الليفية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
3D Bioprinting الهلاميات المائية الضوئية لدراسة تنشيط الخلايا الليفية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تتحول الهلاميات المائية القابلة للتعديل الضوئي مكانيا وزمانيا استجابة للتعرض للضوء. إن دمج هذه الأنواع من المواد الحيوية في منصات زراعة الخلايا وإحداث تغييرات ديناميكية ، مثل زيادة صلابة البيئة الدقيقة ، يمكن الباحثين من نمذجة التغييرات في المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تحدث أثناء تطور المرض الليفي. هنا ، يتم تقديم طريقة للطباعة الحيوية 3D مادة حيوية هيدروجيل قابلة للتعديل الضوئي قادرة على تفاعلين بلمرة متتاليين داخل حمام دعم الجيلاتين. تم تكييف تقنية التضمين الحر القابل للانعكاس للهلاميات المائية المعلقة (FRESH) عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني لحمام الدعم لتسهيل تفاعل إضافة مايكل. أولا ، تم تفاعل الحبر الحيوي الذي يحتوي على بولي (جلايكول الإثيلين) - ألفا ميثاكريلات (PEGαMA) خارج القياس المتكافئ مع رابط متشابك قابل للتحلل الخلوي لتشكيل هلاميات مائية ناعمة. تعرضت هذه الهلاميات المائية اللينة لاحقا للضوء والضوء للحث على البلمرة المتجانسة للمجموعات غير المتفاعلة وتقوية الهيدروجيل. يغطي هذا البروتوكول تخليق الهيدروجيل ، والطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، والتقوية الضوئية ، وتوصيف نقطة النهاية لتقييم تنشيط الخلايا الليفية داخل هياكل ثلاثية الأبعاد. تمكن الطريقة المعروضة هنا الباحثين من الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لمجموعة متنوعة من المواد التي تخضع لتفاعلات البلمرة المحفزة بالأس الهيدروجيني ويمكن تنفيذها لهندسة نماذج مختلفة من توازن الأنسجة والمرض والإصلاح.
المقدمة
الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد هي تقنية تحويلية تمكن الباحثين من إيداع الخلايا والمواد الحيوية بدقة داخل مجلدات ثلاثية الأبعاد وإعادة إنشاء الهيكل الهرمي المعقد للأنسجة البيولوجية. على مدى العقد الماضي ، أدى التقدم في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد إلى نبض أنسجة القلب البشرية1 ، والنماذج الوظيفية لأنسجة الكلى2 ، ونماذج تبادل الغازات داخل الرئة3 ، ونماذج الأورام لأبحاث السرطان4. إن اختراع تقنيات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المضمنة ، مثل التضمين الحر القابل للانعكاس للطباعة الحيوية للهيدروجيل المعلق (FRESH) ، جعل من الممكن إعادة إنتاج هياكل الأنسجة الرخوة المعقدة مثل الأوع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليف وتوصيف PEGαMA
ملاحظة: تم تكييف تخليق بولي (جلايكول الإثيلين) - ألفا ميثاكريلات (PEGαMA) من Hewawasam et al . وتم إجراؤه في ظروف خالية من الرطوبة9.
- وزن المتفاعلات.
ملاحظة: على سبيل المثال، تزن 5 جم 10 كجم/مول 8 أذرع من هيدروكسيل البولي إيثيلين جليكول (PEG-OH) و0.38 جم هيدريد الصوديوم (NaH) (انظر جدول المواد). - أضف شريط تقليب إلى 250 مل من قارورة Schlenk ونظفها بالأرجون.
- قم بإذابة PEG-OH في أقل حجم من رباعي هيدروفوران اللامائي (THF) المطلوب للذوبان داخل دورق شلينك.
ملاحظة: حوالي 80 مل من THF سوف يذوب 5 جم PEG-OH. أضف الحد الأدنى من T....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف هذا البروتوكول كيفية الطباعة الحيوية للهلاميات المائية القابلة للطباعة الضوئية 3D داخل حمام الدعم لإنشاء تركيبات قادرة على التقوية الديناميكية والزمنية لدراسة تنشيط الخلايا الليفية في الأشكال الهندسية التي تحاكي الأنسجة البشرية. أولا ، شرح البروتوكول كيفية تجميع PEGαMA ، العمود الفقري لنظام البوليمر القابل للتعديل الضوئي هذا. أظهرت قياسات التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) نجاح تشغيل PEGαMA بنسبة 96.5٪ (الشكل 1). قيم وظيفية بنسبة 90٪ أو أكثر مقبولة لهذا الإجراء. بعد ذلك ، يتم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن لتفاعلات البلمرة ثنائية المرحلة استجابة للتعرض للضوء المتحكم فيه أن تصلب المواد الحيوية بالتحكم المكاني والزماني. سخرت العديد من الدراسات هذه التقنية لتقييم تفاعلات مصفوفة الخلية في منصات مختلفة5،8،9،10،11،21،22،23. وبشكل أكثر تحديدا ، يمكن استخدام الأ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه. أجزاء من هذه المخطوطة مستنسخة بإذن من © https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf IOP للنشر. 5 جميع الحقوق محفوظة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور آدم فاينبرغ (جامعة كارنيجي ميلون) وأولئك الذين استضافوا ورشة عمل 3D Bioprinting مفتوحة المصدر. جعل هؤلاء الأفراد من الممكن تعلم تقنيات الطباعة الحيوية الطازجة وبناء طابعة حيوية 3D المستخدمة في هذه الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، يود المؤلفون الاعتراف Biorender.com ، الذي تم استخدامه لإنتاج أشكال في هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مجموعات متعددة أو مصادر تمويل بما في ذلك مؤسسة مجتمع روز (DDH و CMM) ، وجائزة كولورادو لأبحاث أمراض الأوعية الدموية الرئوية (DDH و CMM) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب جائزة 1941401 (CMM) ، وإدارة الجيش بموجب الجائزة W81XWH-20-1-0037 (CMM) ، والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة R21 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
مقياس ورق الترشيح FS القلم Lumen Dynamics المستخدم في تقوية ضوئيةزراعة الخلايا
ريال
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الإشعاع AccuMax / طقم مقياس الضوء | شركة Spectronics | Corporation XPR-3000 | لقياس شدة الضوء ، تستخدم لتقوية |
| حمض الخليك الضوئي ؛ | فيشر Scientific | BP2401-500 | المستخدمة أثناء تخليق PEGaMA |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | المستخدمة مع عمليات القطع بالتبريد |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | المستخدمة في تلطيخ |
| رقائق الألومنيوم | Reynolds | F28028 | |
| اللامائية رباعي هيدروفوران (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | المستخدمة أثناء تخليق PEGaMA |
| غاز الهواء المضغوط AR | R300 | المستخدم أثناء تخليق PEGaMA | |
| 8 ذراع بولي (إيثيلين جلايكول) - هيدروكسيل (PEG-OH) تقنية | JenKem | 8ARM-PEG-10K | المستخدمة أثناء تخليق PEGaMA |
| 365 نانومتر مرشح ممر النطاق | Edmund Optics | 65-191 | يستخدم لتقوية |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | فيشر Scientific | BP9700-100 | تستخدم أثناء عملية التلوين |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | المستخدمة أثناء تخليق PEGaMA |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | تستخدم أثناء عملية التلوين |
| Celite 545 (مساعد الترشيح) | EMD Millipore | CX0574-1 | تستخدم أثناء تخليق PEGaMA |
| شرائح مجهر مشحونة | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | تستخدم لتوصيف PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | المستخدمة في تلطيخ |
| الأنابيب المخروطية سعة 50 مل | CELLTREAT | 667050B | |
| مجموعة السلامة المبردة | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| أنابيب غسيل الكلى | Repligen | 132105 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | تستخدم لتلوين |
| ثنائي إيثيل الأثير | فيشر Scientific | E1384 | المستخدمة أثناء تخليق PEGaMA |
| 1،4-Dithiothreitol (DTT) | سيجما ألدريتش | 10197777001 | مكون Bioink |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271. | |
| Whatman | 1001-090 | المستخدم أثناء تخليق PEGaMA | |
| المنطقة الحرة 2.5 لتر نظام تجميد الجفاف | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N / A | تنزيل البرنامج |
| 2.5 مل حقنة محكمة | للغاز هاميلتون | 81420 | تستخدم للطباعة الحيوية |
| 15 مقياس 1.5 "تلميح سلسلة تكنولوجيا المعلومات | جنسن العالمية | JG15-1.5X | تستخدم للطباعة الحيوية |
| 30 مقياس 0.5 بوصة تلميح سلسلة HP | Jensen Global | JG30-0.5HPX | تستخدم للطباعة الحيوية |
| للماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 555 الأجسام المضادة | فيشر Scientific | A21422 | تستخدم لتلوين |
| جلايسين | فيشر C2H5NO2 العلمي | المستخدمة أثناء عملية تلطيخ | |
| مقياس الدم | فيشر العلمي | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | يستخدم أثناء عملية تلطيخ |
| الخلايا الليفية العرضية للشريان الرئوي البشري (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 ؛ | من مريض يبلغ من العمر عامين |
| حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) فيشر | العلمي | A144-500 | يستخدم لضبط الأس الهيدروجيني الحلول |
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة (NIH) | N / A | تنزيل برنامج |
| مجاني ImmEdge & reg ؛ | مختبرات ناقلات | H-4000 | تستخدم أثناء عملية التلوين |
| حاضنة | VWR | VWR51014991 | |
| ملاط الجسيمات الدقيقة الجيلاتين LifeSupport (ملاط الجيلاتين) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | تستخدم للطباعة الحيوية |
| المجهر الخفيف | أوليمبوس | CKX53 | مجهر ضوئي مقلوب |
| ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات ( في lap) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator المستخدمة في تقوية |
| النيتروجين السائل | N / A | N / A | |
| LulzBot Mini 2 & nbsp ؛ | LulzBot | N / A | Bioprinter Adapt |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B & nbsp ؛ | شركة Polysciences | 669775-30-8 | |
| 2-ميثيل بوتان | سيجما-ألدريتش | M32631-4L | |
| ميكرومان مكابس شعرية CP1000 | VWR | 76178-166 | أطراف ماصة الإزاحة الإيجابية |
| MMP2 متشابكة قابلة للتحلل (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N / A | مكون Bioink |
| ماوس مضاد للإنسان &alpha SMA أحادي النسيلة الجسم المضاد | فيشر Scientific | MA5-11547 | تستخدم للتلطيخ |
| سلسلة OmniCure 2000 | مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية | S2000-XLA | |
| بارافورمالدهيد (PFA) ؛ | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | تستخدم لإصلاح العينات |
| مقياس الأس الهيدروجيني | Mettler Toledo | FP20 | |
| شرائط الأس الهيدروجيني | Cytiva | 10362010 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Hyclone Laboratories، Inc. | سيتيفا SH30256. مجموعة ماصات FS | |
| فيشر Scientific | 14-388-100 | ||
| 10 & micro; L نصائح الماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1120-3710 | |
| 20 & L نصائح الماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1183-1510 | |
| 200 & micro ؛ L نصائح الماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1111-0700 | |
| 1000 & L نصائح الماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1111-2721 | |
| بولي (إيثيلين جلايكول) -ألفا ميثاكريلات (PEG & alpha ؛ MA) | N / A | N / A | الرجوع إلى المخطوطة لخطوات التوليف |
| Poly (أكسيد الإيثيلين) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | مكون Bioink |
| الإزاحة الإيجابية ماصة | فيشر العلمية | FD10004G | 100-1000 & L |
| هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | يستخدم لضبط الرقم الهيدروجيني المحاليل |
| إطالة كاشف الذهب المضاد للتلاشي | Invitrogen | P36930 | يستخدم أثناء عملية التلوين |
| Pronterface | All3DP | N / A | تنزيل |
| برنامج Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | يستخدم في تلطيخ |
| ببتيد RGD (CGRGDS) | GL Biochem | N / A | Bioink مكون |
| الروك | VWR | 10127-876 | |
| المبخر الدوار | Thomas Scientific | 11100V2022 | المستخدمة أثناء دبابيس الشريط المطاطي لتوليف PEGaMA |
| 808659 | |||
| Schlenk Flask ؛ | Kemtech | America F902450 | المستخدمة أثناء تخليق PEGaMA |
| Slic3r | Slic3r | N / A | تنزيل برنامج |
| نمو خلايا العضلات الملساء متوسط-2 (SmGM-2) BulletKit | تحتوي مجموعة Lonza | CC-3182 | على مكونات CC-3181 و CC-4149 |
| هيدريد الصوديوم ؛ | Sigma-Aldrich | 223441-50G | تستخدم أثناء تخليق PEGaMA |
| Sorvall ST 40R أجهزة الطرد المركزي | فيشر Scientific | 75-004-525 | |
| شريط التحريك | VWR | 58948-091 | |
| مرشح الحقنة | VWR | 28145-483 | تستخدم لتعقيم محاليل الترشيح |
| T-75 قارورة معالجة بزراعة | الأنسجة VWR | 82050-856 | تستخدم لعمل |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T COMPOUND (OCT) | ساكورا | 4583 | |
| تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) | سيجما ألدريتش | C4706-2G | |
| تريتون X-100 | فيشر C34H622O11 | تستخدم أثناء عملية التلوين | |
| تريبان بلو | سيجما-ألدريتش | T8154-20ML | تستخدم لزراعة الخلايا العمل |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | تستخدم لأعمال زراعة الخلايا |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | تستخدم أثناء عملية تلطيخ |
| مجهر مستقيم | Olympus | BX63F | قدرات المجهر الفلوري |
| حمام الماء | PolyScience | WBE20A11B | |
| لوحات زراعة الأنسجة 24 بئر | Corning | 3527 |
المراجع
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
- Lin, N. Y. C., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
