مقالة منهجية

فحص حساسية الدواء الكروي في خطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

فبراير 2, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

تعد شاشات حساسية الدواء في المختبر أدوات مهمة لاكتشاف تركيبات الأدوية المضادة للسرطان. تعمل الخلايا المزروعة في الكرات على تنشيط مسارات إشارات مختلفة وتعتبر أكثر تمثيلا لنماذج في الجسم الحي من خطوط الخلايا أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول طريقة لفحص المختبر للخطوط الكروية.

الملخص

تعد شاشات حساسية الأدوية في المختبر أدوات مهمة في اكتشاف العلاجات المركبة للأدوية المضادة للسرطان. عادة ، يتم إجراء شاشات الأدوية المختبرية هذه على الخلايا المزروعة في طبقة أحادية. ومع ذلك ، تعتبر هذه النماذج ثنائية الأبعاد (2D) أقل دقة مقارنة بنماذج الخلايا الكروية ثلاثية الأبعاد (3D). هذا ينطبق بشكل خاص على خطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي. تعمل الخلايا المزروعة في الكرات على تنشيط مسارات إشارات مختلفة وتعتبر أكثر تمثيلا لنماذج في الجسم الحي من خطوط الخلايا أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول طريقة لفحص المختبر للخطوط الكروية. تستخدم خطوط الخلايا الجذعية للفأر والورم الدبقي البشري كمثال. يصف هذا البروتوكول حساسية الدواء الكروي ثلاثي الأبعاد ومقايسة التآزر التي يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان دواء أو تركيبة دواء تؤدي إلى موت الخلايا وما إذا كان هناك دواءان يتآزران. يتم تعديل خطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي للتعبير عن RFP. يتم طلاء الخلايا في 96 لوحة مستديرة منخفضة التعلق ، ويسمح للكرات بالتشكل بين عشية وضحاها. تتم إضافة الأدوية ، ويتم مراقبة النمو عن طريق قياس إشارة RFP بمرور الوقت باستخدام نظام التصوير الحي Incucyte ، وهو مجهر فلوري مدمج في حاضنة زراعة الأنسجة. يتم بعد ذلك حساب نصف الحد الأقصى للتركيز المثبط (IC50) ، والجرعة المميتة المتوسطة (LD50) ، ودرجة التآزر لتقييم الحساسيات للأدوية وحدها أو مجتمعة. توفر الطبيعة ثلاثية الأبعاد لهذا الاختبار انعكاسا أكثر دقة لنمو الورم وسلوكه وحساسيته للأدوية في الجسم الحي ، وبالتالي تشكل الأساس لمزيد من الفحص قبل السريري.

المقدمة

الورم الأرومي الدبقي هو ورم مدمر عالي الجودة في الدماغ مع بقاء إجمالي لمدة خمس سنوات بنسبة5٪ 1. تمثل الأورام الدبقية عالية الدرجة (HGG) مثل الورم الأرومي الدبقي السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى الأطفال2 وهي واحدة من أكثر الأورام تمردا للعلاج عند البالغين أيضا3. على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا للمحركات الجزيئية ل HGG ، إلا أن خيارات العلاج لا تزال محدودة3 ، مع التأكيد على الحاجة إلى طرق فحص الأدوية التي تتنبأ بدقة أكبر بالحساسيات العلاجية في العيادة.

تم استخدام مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد بشكل أساسي لنمذجة سلوك الخلية ذي الصلة من الناحيةالفسيولوجية 4. علاوة على ذلك ، يمكن تلخيص البنية ثلاثية الأبعاد للبيئة المكروية للورم في المختبر من خلال إنشاء فحوصات نمو ثلاثية الأبعاد5. ينشط النمو الكروي أيضا مسارات إشارات مختلفة ، وبالتالي يعتبر أكثر تمثيلا للنماذج في الجسم الحي 6،7 مقارنة بالثقافة ثنائية الأبعاد. تنمو الخلايا الجذعية HGG للأطفال وخطوط الخلايا الجذعية للورم الدبقي NF1 للفأر بشكل طبيعي كمجالات عصبية ، وتستخدم خطوط خلايا الورم الدبقي NF1 للفأر في شاشة دواء متوسطةالإنتاجية 8. تم اشتقاق خطوط الأطفال المستخدمة هنا من HGG للأطفال في نصف الكرة الأرضية والخط الأوسط والمخيخ وتم الحصول عليها من شبكة أورام الدماغ للأطفال (ملامح الطفرات والتعبير الجيني) وتميزت بها بالكامل9. تم تعديل هذه الخطوط للتعبير عن بروتين فلورسنت أحمر نووي (RFP) ، والذي يسمح بمراقبة الانتشار والبقاء على قيد الحياة باستخدام نظام التصوير الحي Incucyte. تمثل شدة إشارة RFP عدد الخلايا الموجودة. يمكن أيضا استخدام الفلوروفورات الأخرى ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP).

يعد العلاج الكيميائي المركب لسرطان الدم الليمفاوي الحاد في مرحلة الطفولة والأورام اللمفاوية والأورام الخبيثة الظهارية والعديد من أنواع السرطان الأخرى طريقة فعالة للقضاء على الأورام ومنع مقاومة الأدوية للعوامل الفردية10،11. ومع ذلك ، هناك معلومات محدودة حول العوامل التي يجب دمجها لتحقيق الحساسيات العلاجية في HGG ، مما يشجع على استخدام نماذج كروية أكثر دقة في اختبار المخدرات في المختبر .

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى الأطفال في فيلادلفيا (IRB).

1. 3D طلاء الخلايا الكروية

  1. تحضير وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي: لعمل الوسائط الأساسية ، أضف 50 مل من مكمل التكاثر و 5 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين 100x (10,000 وحدة / مل) إلى الوسط القاعدي (500 مل). لعمل وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي ، أضف عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) إلى التركيز النهائي البالغ 20 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل ، على التوالي ، وفقا لوصف الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي لمدة أسبوع واحد عند تخزينها عند 4 درجات مئوية.
  2. فصل الخلايا التي تعبر عن RFP:
    ملاحظة: في هذا المثال، يتم إستخدام خط الخلايا الجذعية NF1 HGG 5746 للماوس.
    1. انقل كرات الورم الدبقي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وقم بتدوير كرات الورم الدبقي في جهاز طرد مركزي (150 × جم لمدة 5 دقائق). قم بإزالة المادة الطافية وأضف 300 ميكرولتر من الأكوتاز لفصل الكرات (احتضانها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية).
    2. أضف 1 مل من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي وقم بتعطيل الكرات عن طريق سحب العينة اللطيف. الطرد المركزي للخلايا المنفصلة لمدة 5 دقائق عند 150 × جم ، وشفط المادة الطافية ، وإذابة الحبيبات في 1 مل من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي.
  3. قم بقياس تركيز الخلايا باستخدام عداد الخلايا أو مقياس كثافة الدم. عند استخدام عداد الخلايا الفلورية ، أضف 18 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 2 ميكرولتر من صبغة Acridine Orange / Propidium Iodide. قم بتحميل 12 ميكرولتر من هذا المعلق في مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا الحية / الميتة الموجودة في المعلق.
  4. تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي يبلغ 2,000 خلية لكل 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية للورم الدبقي.
    ملاحظة: قد تعتمد التعديلات على تركيز الخلية على خط الخلية ويمكن تعديلها وفقا لذلك.
  5. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (2,000 خلية لكل 100 ميكرولتر) في كل بئر من لوحة التثبيت المنخفضة القاع المستديرة المكونة من 96 بئرا عن طريق سحب العينات العكسي.
    ملاحظة: استخدم لوحات مرفقة منخفضة القاع المستديرة. ستحفز هذه الصفائح تكوين كرة واحدة من الورم الدبقي في كل بئر. يتجنب سحب العينات العكسي تكوين الفقاعات ، والتي ستتداخل مع التقاط الصور لنظام تحليل الخلايا الحية.
  6. جهاز الطرد المركزي للألواح عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: الطرد المركزي هو خطوة حاسمة لبدء تكوين الغلاف العصبي ثلاثي الأبعاد.
  7. احتضن بين عشية وضحاها للسماح بتكوين كرة واحدة في كل بئر.

2. إضافة أدوية لمقايسة التآزر (الشكل 1)

  1. تأكد من أن كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا يتلقى تركيزا محددا لكل من الدواءين 1 و 2. قم بإنشاء شبكة حيث يتم دمج كل تركيز من تركيز الدواء 1 مع كل تركيز من تركيز الدواء 2 في نسختين.
  2. قم بعمل تخفيف تسلسلي للعقارين اللذين سيتم تحديد التآزر لهما (5 تخفيفات من الدواء 1 و 7 تخفيفات من الدواء 2) باستخدام وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام سلسلة تخفيف تسلسلية بنسبة 50٪. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي سلسلة تخفيف.
    1. يجب أن تكون سلسلة التخفيف أكثر تركيزا بمقدار 7 مرات من التركيز النهائي المطلوب في كل بئر. على سبيل المثال ، إذا كان أعلى تركيز نهائي للعقار 1 هو 1 ميكرومتر ، فقم بعمل التركيز الأول لسلسلة التخفيف للعقار 1 أو 7 ميكرومتر (1 مل ، الأنبوب B أو I في الشكل 1 أ).
    2. أضف 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي إلى كل أنبوب إضافي من سلسلة التخفيف (الأنبيبات C-H و J-M ، كما هو موضح في الشكل 1).
    3. لإنشاء سلسلة التخفيف ، قم بشفط 500 ميكرولتر من خليط الدواء من الأنبوب B أو الأنبوب I وأضفه إلى الأنبوب التالي في سلسلة التخفيف Tube C أو Tube J ، على التوالي (يحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا الجذعية للورم الدبقي). تخلط جيدا وتكرر مع الأنبوب التالي في سلسلة التخفيف. قم بإجراء عنصر تحكم DMSO (الأنبوب A) وتأكد من أن تركيز DMSO هو نفسه عبر الظروف.
      ملاحظة: يمكن إجراء تعديلات على تركيزات الدواء وسلسلة التخفيف. تأكد من إدراج تركيزات الدواء الصحيحة في الملف التكميلي 1 إذا تم تغيير سلسلة التخفيف.
  3. إلى كل بئر من ألواح الآبار البالغ عددها 96 ، أضف 20 ميكرولتر من الدواء 1 و 20 ميكرولتر من المخدرات 2 عن طريق سحب العينات العكسي ، كما هو موضح في الشكل 1 ب ، للحصول على حجم نهائي قدره 140 ميكرولتر لكل بئر ؛ يتم تقييم تركيبات الأدوية في نسختين. إذا كنت تستخدم التحليل النهائي المقدم ل IC50 و LD50 ، فاستخدم تخطيط الدواء كما هو موضح في الشكل 1 ب.
    1. في هذا الفحص ، يتم أيضا قياس تأثير كل دواء بمفرده (دون وجود الدواء الآخر). تأكد من إضافة 20 ميكرولتر من وسائط التحكم DMSO (الأنبوب A في الشكل 1 ب) إلى آبار الأدوية المفردة لرفع الحجم النهائي لكل بئر إلى 140 ميكرولتر.
    2. تأكد من أن الآبار لا تحتوي على فقاعات ، لأن ذلك سيؤثر على التصوير.
      ملاحظة: يمكن إجراء تعديلات على المجلد النهائي. ومع ذلك ، تأكد من ضبط التركيزات في النقطة 2.2.
  4. ضع الألواح في جهاز التصوير المباشر وراقب نمو كل كرة في كل بئر باستخدام الوحدة الكروية ، وإعداد الكرة المفردة ، وتصوير كل من المجال الساطع و RFP بتكبير 4x.
  5. مراقبة لوحات لمدة 72 ساعة, تصوير كل بئر من اللوحة في فاصل زمني منتظم, عادة 2 ساعة.
    ملاحظة: قم بتحميل خريطة اللوحة الصحيحة ؛ سيضمن ذلك التحليل النهائي المناسب (الشكل 1 ج).

3. حساب IC50 و LD50 ودرجة التآزر (الشكل 2 والشكل 3)

  1. قم بتحليل شدة طلب تقديم العروض لكل بئر وكل نقطة زمنية باستخدام برنامج التصوير المباشر. يتم سرد معلمات التحليل المستخدمة في الملفات التكميلية (الملف التكميلي 2).
    ملاحظة: يمكن استخدام معلمات التحليل المختلفة حسب الرغبة.
  2. قم بتصدير بيانات طلب تقديم العروض كإجمالي كثافة طلب تقديم العروض المتكاملة باللون الأحمر لكل بئر ، مع التأكد من تصدير البيانات الأولية غير المجمعة (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم النموذج المقدم (الملف التكميلي 1) لحساب IC50 و LD50 ، فمن الضروري الالتزام بالنقطة 3.2
  3. حدد المتوسط والانحراف المعياري لكل مجموعة دوائية من (1) تغيير الطية مقارنة ب DMSO فقط (لهذا الحساب ، ليست هناك حاجة إلى قيم 0 ساعة) و (2) Log2 لتغيير الطي مقارنة ب 0 ساعة عن طريق لصق البيانات الأولية في ورقة Excel المقدمة (الشكل 2 ب وانظر المثال في الملف التكميلي 1).
  4. اضبط الحد الأقصى لتركيز الأدوية 1 و 2 في جدول البيانات (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: تأكد من ضبط تركيزات الأدوية 1 و 2 ؛ خلاف ذلك ، سيتم حساب قيم LD50 و IC50 غير الصحيحة.
  5. احسب قيم IC50 باستخدام تطبيق برمجي مناسب لتحليل البيانات (هنا ، يتم استخدام GraphPad). لحساب قيمة IC50 ، استخدم متوسط تغيير الطية وتغيير أضعاف الانحراف المعياري مقارنة ب DMSO المحدد فقط في الخطوة 3.4 ، وانسخ جداول IC50 للأدوية 1 و 2 إلى برنامج تحليل البيانات (Log (المثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية ، المنحدر المتغير) (الشكل 3 أ).
    1. استخدم فقط البيانات من الآبار التي تمت إضافة مكونات واحدة إليها لحسابات IC50. استخدم قيم تركيز الدواء Log في برنامج تحليل البيانات، والتي يتم حسابها تلقائيا في جدول البيانات المقدم.
  6. احسب درجة التآزر:
    1. استخدم متوسط تغيير الطية مقارنة ب DMSO فقط لكل مجموعة لحساب درجة التآزر باستخدام حزمة برامج أو موقع ويب. على سبيل المثال ، https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (المعلمات: ملاءمة منحنى LL4 ، طريقة ZIP لحساب درجة التآزر). يقوم الملف التكميلي 1 تلقائيا بحساب القيم اللازمة لإنشاء جدول إدخال التآزر الذي يمكن تحميله إلى SynergyFinder (الشكل 3 ب). يتم توفير مثال على جدول إدخال التآزر في الملف التكميلي 3.
      ملاحظة: تشير النتيجة التي تزيد عن 10 إلى التآزر ، وتشير الدرجة الأقل من -10 إلى العداء والقيمة بين -10 تظهر تأثيرات مضافة.
  7. احسب درجة LD50:
    1. لكل تركيز من الدواء 1 ، احسب LD50 للعقار 2. يقوم الملف التكميلي تلقائيا بحساب قيمة Log2 والانحراف المعياري لكل تركيز (الشكل 3C).
    2. أدخل المتوسط والانحراف المعياري لتغيير أضعاف Log2 مقارنة ب 0 ساعة ، بالإضافة إلى عدد التكرارات في برنامج تحليل البيانات (في هذه الدراسة ، 2 ،) واحسب قيمة LD50 والانحراف المعياري LD50 عن طريق تحديد التركيز عند -1 (يمثل Log2 = -1 قيمة log2 التي يتم فقد 50٪ من الإشارة مقارنة ب 0 ساعة). في هذه العمليات الحسابية ، استخدم نموذج معلمات Log (inhibitor) مقابل الاستجابة ، المنحدر المتغير 4 المعلمات.
      ملاحظة: لا يحسب برنامج تحليل البيانات تلقائيا تركيز الدواء المقابل لقيمة log2 = -1 ؛ ومع ذلك ، يمكن إضافة هذه القيمة إلى الحسابات المبلغ عنها لبرنامج تحليل البيانات كمعادلة محددة من قبل المستخدم (الشكل 3C). تأكد من استخدام قيم تركيز السجل في برنامج تحليل البيانات، والتي يتم حسابها تلقائيا في جدول البيانات المقدم. يعرض الملف التكميلي 4 لوحتي IC50 و LD50 في برنامج GraphPad.

النتائج

على سبيل المثال ، تم تقييم التآزر بين Trametinib (مثبط MEK) و GDC-0941 (مثبط PI3K) ، والذي يثبط مسارين مستجيبين من RAS في خط الخلايا الجذعية للورم الدبقي للفأر 5746 (التعبير عن RFP) (الشكل 4). يوضح الشكل 4 أ نفس الكرة في 0 ساعة و 72 ساعة معالجة بمزيج من Trametinib و GDC-0941. تم تصدير هذه الصور مباشرة من برنامج التصوير المباشر. تم حساب IC50 و LD50 كما هو موضح في GraphPad (الشكل 4B ، D) ، تم حساب التآزر باستخدام SynergyFinder (الشكل 4C). يوضح الشكل 4 ب مخرجات حسابات IC50 ؛ يتم عرض قيم LogIC50 و Hillslope و IC50 لكلا الدواءين ، بالإضافة إلى فاصل الثقة بنسبة 95٪ وجودة الملاءمة. يوضح الشكل 4C منحنى الاستجابة للجرعة لكل دواء بمفرده (تركيز الدواء مقابل النسبة المئوية للتثبيط) ، ومصفوفة مرمزة بالألوان توضح النسبة المئوية لتثبيط النمو لكل مجموعة دوائية ، ورسم بياني ثلاثي الأبعاد لدرجة التآزر بين كلا الدواءين ، في هذه الحالة ، درجة التآزر هي 22.356. يوضح الشكل 4D إخراج قيم LD50 للأدوية بمفردها أو مجتمعة. من الأهمية بمكان قيم LogLD50 و LD50 وفترات الثقة البالغة 95٪ لكل منهما. كما هو متوقع ، فإن LD50s ل Trametinib أقل مع تركيزات GDC-0941 أقل. من المهم أن تتذكر أن LD50 هي علامة موت الخلية وتشير إلى 50٪ من موت الخلايا مقارنة بنقطة البداية في الفحص.

figure-results-1
الشكل 1: إعداد صفيحة 96 بئرا من التآزر ثنائي الدواء. (أ) التمثيل التخطيطي لسلسلة التخفيف 1/2 من الأدوية 1 و 2. يجب أن تكون تركيزات الدواء أعلى بمقدار 7 مرات من التركيز النهائي في كل بئر. (ب) صورة لنقطة 0 ساعة لصفيحة مكونة من 96 بئرا مع 5746 كرة RFP. تتم إضافة سلسلة تخفيف الدواء 1 إلى كل صف كما هو موضح ليصبح المجموع 7 تخفيفات وتحكم DMSO. تتم إضافة سلسلة تخفيف الدواء 2 في كل مرة إلى عمودين كما هو موضح ليصبح المجموع 5 تخفيفات وعنصر تحكم DMSO. (ج) مثال على خريطة اللوحة التي تم تحميلها في برنامج التصوير المباشر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تصدير البيانات المكتسبة. (أ) بعد 72 ساعة من القياسات ، يتم تصدير إجمالي الكثافة المتكاملة للجسم الأحمر لكل بئر وكل نقطة زمنية. تم تعيين التجميع إلى بلا. بالنسبة لخيارات التصدير (على اليمين)، اختر التنظيم حسب النسخ المتماثلة والوجهة إلى الحافظة. (ب) الصق البيانات المصدرة في الخلية المشار إليها في جدول البيانات (الملف التكميلي 1). قم بتحديث أعلى تركيز لكل دواء كما هو موضح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: معالجة البيانات المكتسبة. (أ) جداول إدخال IC50 التي يمكن نسخها في الحرب الناعمة لتحليل البيانات لتحليلها (الملف التكميلي 4 ، لوحة IC50). يتم إنشاء هذه الجداول تلقائيا في الملف التكميلي 1. (ب) يمكن إنشاء جدول مدخلات تآزرية لبرنامج SynergyFinder عن طريق نسخ جدول الجدوى إلى الملف التكميلي 3. يتم تحميل هذا الملف إلى https://synergyfinder.fimm.fi/ مع التحديدات المشار إليها. يتم حساب درجة التآزر والمصفوفة تلقائيا. (ج) جداول إدخال LD50 التي يمكن نسخها إلى برنامج تحليل البيانات (الملف التكميلي 4 ، لوحة LD50) للتحليل. يتم إنشاء هذه الجداول تلقائيا في الملف التكميلي 1. يوضح الجزء السفلي كيف تمت إضافة LD50 إلى القيم المبلغ عنها في برنامج تحليل البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مثال على نتائج دراسة التآزر ل Trametinib و GDC-0941 في 5746 كرة الخلايا الجذعية للورم الدبقي. (أ) الصورة بعد 0 ساعة و 72 ساعة بعد المعالجة لكرة 5746 RFP المعالجة ب 10 نانومتر تراميتينيب و 1000 نانومتر GDC-0941. (ب) ناتج حسابات IC50 التي توضح قيمة IC50 والانحراف المعياري ل IC50. (ج) مخرجات برنامج SynergyFinder. إلى اليسار: منحنيات التثبيط ، الوسط: جدول النسبة المئوية للتثبيط ، على اليمين: خريطة التآزر التي تظهر Trametinib و GDC-0941 لها درجة تآزر 22.3. (د) إخراج حسابات LD50 ، التي توضح قيم LD50 والانحراف المعياري المحسوب على LD50. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: المعلمات المستخدمة لتحليل إشارة RFP في Incucyte. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: جدول البيانات حيث تتم معالجة البيانات التي تم إنشاؤها ، ويتم إنشاء جداول الإدخال ل GraphPad و SynergyFinder. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: جدول بيانات جدول إدخال SynergyFinder. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: ملف GraphPad لحساب قيم IC50 و LD50 الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول فحوصات فحص الأدوية ثلاثية الأبعاد التي تم استخدامها بشكل فعال لتقييم نقاط الضعف الدوائية في النماذج الكروية للورم الدبقي8. تم تصميم نظام الفحص الكروي ثلاثي الأبعاد هذا خصيصا للسماح بإجراء تحقيق أكثر دقة قبل السريرية للعلاجات الكيميائية التوافقية لخطوط خلايا الورم الدبقي المزروعة في المجالات. بالنسبة إلى HGG ، توفر هذه الطريقة إطارا لتحديد نقاط الضعف الدوائية المحتملة لهذا المرض المدمر. ومع ذلك ، فإن التطبيقات المحتملة لهذا النظام لا تقتصر على الورم الدبقي ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم العلاجات الجديدة في نماذج ثلاثية الأبعاد لمختلف الحالات الأخرى.

الهدف من هذه الدراسة هو تعزيز القدرة على التنبؤ بشاشات الأدوية في المختبر لتحديد أولويات مجموعات الأدوية التي لديها أعلى احتمالية للنجاح في الدراسات قبل السريرية ، وفي النهاية ، العيادة. خاصة في الورم الدبقي ، ظل تحديد مجموعات الأدوية القوية باستخدام شاشات الأدوية في المختبر التي تترجم بشكل جيد إلى العيادة محدودا. ويرجع ذلك جزئيا إلى استخدام خطوط خلايا الورم الدبقي المزروعة في المصلالأقل مثالية 13 ، واستخدام فحوصات أحادية الطبقةثنائية الأبعاد 4 ، والتركيز على IC50 (نمو منخفض بنسبة 50٪) بدلا من LD50 (خلايا أقل بنسبة 50٪ مقارنة ببداية الفحص) قيم14. تستخدم فحوصات النمو الكروي في المختبر للخلايا الجذعية للورم الدبقي لتحديد أولويات تركيبات الأدوية لتقييمها في نماذجنا قبل السريرية. في تحديد أولوياتنا لتركيبات الأدوية ، تؤخذ بعض التدابير في الاعتبار: 1) قيم LD50 المنخفضة ، والتركيز على موت الخلايا بدلا من تقليل التكاثر يرفع من النجاح المحتمل. 2) من الناحية المثالية, هذه القيم LD50 أقل من قيمة Cmax, الحد الأقصى لتركيز المصل الذي يمكن تحقيقه بأمان خلال دراسات المخدرات الدوائية للتجارب السريرية, إذا كان ذلك متاحا; 3) درجة تآزر عالية ، إذا كان كلا الدواءين يعملان بشكل تآزري ، فهذا يشير إلى التعاون الميكانيكي بين كلا الدواءين. على الرغم من أن هذه النقطة الأخيرة ليست مطلوبة لتحديد تركيبات الأدوية القوية ، إلا أن التآزر يمكن أن يعزز فعالية الدواء دون زيادة سمية الأدوية.

الأهم من ذلك ، تظل التقييمات المختبرية لحساسية الأدوية أداة مهمة لاكتشاف علاجات جديدة أو تركيبات أدوية يمكن أن تقلص الأورام. يسمح لنا البروتوكول المقدم هنا بتحديد حساسية الدواء وتآزره مع نظام فحص النمو الكروي ثلاثي الأبعاد والذي يمكن استخدامه لتحديد أولويات مجموعات الأدوية لتقييمها في النماذج قبل السريرية.

يتضمن البروتوكول عدة خطوات حاسمة. نحن نقيس نمو مستعمرات مفردة في كل بئر من صفيحة 96 بئر. يعد استخدام ألواح البئر المستديرة ذات القاع المنخفض أمرا بالغ الأهمية لضمان عدم ارتباط الخلايا بالبئر وتحفيز تكوين الكرة. يضمن البئر السفلي المستدير أن الكرة المفردة موجودة دائما في نفس المكان من لوحة البئر 96.

بعد طلاء الخلايا ، يجب طرد الألواح للتأكد من أن جميع الخلايا المطلية تجتمع معا في أدنى نقطة من بئر القاع المستدير وتشكيل كرة ثلاثية الأبعاد واحدة. يجب أن يكون الحجم الكلي لكل بئر 140 ميكرولتر. سيضمن ذلك التركيزات النهائية الصحيحة للأدوية المعنية في كل بئر.

عند سحب العينات في لوحة البئر 96، استخدم تقنية سحب العينات العكسية، وهذا يقلل من خطر توليد فقاعات هواء في الآبار. تعيق فقاعات الهواء المصور الحي من تصوير كل بئر بشكل صحيح ، وستكون شدة التألق غير صحيحة ، مما يؤثر على التحليل النهائي للنتائج.

تخطيط اللوحة وجداول البيانات المتوفرة خاصة بالبروتوكول الموصوف. إذا انحرف المرء عن الطلاء ، حساب قيم IC50 و LD50 غير الصحيحة. يحسب جدول البيانات التخفيفات تلقائيا عند توفير أعلى تركيز. لكل تجربة ، قم بتحديث أعلى تركيز وإلا ، سيتم حساب قيم IC50 و LD50 غير الصحيحة.

يستخدم Graphpad تركيزات لوغاريتمية لحساب قيم IC50 و LD50. يتم حساب هذه التركيزات اللوغاريتمية تلقائيا في جدول البيانات المقدم ويمكن نسخها مباشرة إلى البرنامج. سيؤدي عدم استخدام التركيزات اللوغاريتمية إلى قيم IC50 و LD50 غير صحيحة.

نحن نستخدم خطوط الخلايا التي تنمو بشكل طبيعي ككرات. يمكن للمرء أن يجبر الخلايا الملتصقة على الكرة باستخدام هذا البروتوكول. ومع ذلك ، ليس من المضمون أنهم سيكونون قادرين على التكاثر. قد يعتمد عدد الخلايا المطلية في كل بئر على خط الخلية ويعتمد على خصائص النمو الفريدة لخطوط الخلايا الفردية ، والتي يمكن تعديلها بسهولة. منحنيات التخفيف المقترحة هي اقتراحات فقط. يمكن إجراء تعديلات على تركيزات الدواء وسلسلة التخفيف. ومع ذلك ، من المهم سرد تركيزات الدواء الصحيحة في الملف التكميلي 1 إذا تم تغيير سلسلة التخفيف ؛ خلاف ذلك ، ستكون قيم IC50 و LD50 المحسوبة غير صحيحة. يمكن للمرء أن يختار استخدام تخطيط لوحة مختلف. على سبيل المثال، استخدم نسخة متماثلة واحدة فقط بدلا من اثنتين. لهذا الغرض، يجب على المستخدم تحديث جدول البيانات ليعكس هذا التغيير.

بعد الطلاء ، تتشكل كرات ثلاثية الأبعاد متعددة في بئر واحد في مناسبات نادرة. في مثل هذه الحالة ، يؤدي تكرار خطوة الطرد المركزي (150 × جم) إلى اندماج هذه المجالات في كرة واحدة. إذا حدث خطأ في الطلاء ، مما أدى إلى تخطيط لوحة مختلف ، فيمكن تعديل جدول البيانات المقدم ليعكس خريطة اللوحة الجديدة. إذا كانت نقطة البيانات متطرفة وتحتاج إلى إزالتها من التحليل، فيمكن تحديث جدول البيانات المقدم.

يتمثل القيد الرئيسي لهذا النظام في أنه يستخدم خطوط الخلايا المزروعة بشكل طبيعي ككرات وليس خطوط ملتصقة تزرع في طبقات أحادية. إذا لم تتمكن خطوط الخلايا من تكوين المجالات ، فيجب استخدام فحوصات الانتشار ثنائية الأبعاد التقليدية. تتمثل ميزة استخدام فحوصات النمو الشبيهة بالعضوية ثلاثية الأبعاد مثل هذه عند مقارنتها بالطبقات الأحادية التقليدية ثنائية الأبعاد في أن الهندسة المعمارية ومسارات الإشارات المنشطة تعكس بدقة أكبر تلك التي لوحظت في نماذج في الجسم الحي للأمراض البشرية ، مع التركيز على الإمكانات الانتقالية وقابلية تطبيق هذه الأساليب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل CELLTREAT22941115 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين ، معقمة
96 - لوحةS-bioMS9096UZ96 بئر مستديرة القاع لوحة تعلق منخفضة للغاية
AccutaseSTEMCELL Technologies7922محلول انفصال الخلية
Acridine Orange / Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001حي / ميت وصمة عار لعد الخلايا
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2المؤتلف البشري bFGF
خليةعداد الشعارات BiosystemsL20001LUNA-FL خلايا مضادة للخلية المضاقة
الطرد المركزيEppendorf5810Rخلايا وألواح الطرد المركزي
DMSOPierce20688المذيب للمركبات
EGFSTEMCELL تقنيات78006.2المؤتلفة البشرية
Costar07-200-534أنابيب الطرد المركزي
الدقيقة ExcelMicrosoftMicrosoft excel
GDC-0941SelleckchemS1065Drug 1
GraphPadGraphPad GraphPad Prism 9IC50 و LD50
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3مجهر مضان مدمج في حاضنة زراعة الأنسجة التي تصور كل بئر على فترات زمنية محددة.
برنامج IncucyteSartoriusIncucyte 2022Bتحليل بيانات الانتشار
MediaSTEMCELL Technologies5702مجموعة انتشار NeuroCult (الفأر والجرذان) التي تحتوي على الوسط القاعدي ومكملات
النمو Penicillin-Streptomycin جيبكو15140122المضادات الحيوية لإضافتها إلى وسائل الإعلام
TrametinibSelleckchemS2673Drug 2
المزدوجة أجهزة أنابيب EGF Eppendorf حساب شعارات مقياس الدم

المراجع

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RFP IC50

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.