الفيروسات الزائفة (PVs) هي فيروسات معيبة في النسخ المتماثل تستخدم لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف في ظل ظروف أكثر أمانا من التعامل مع الفيروسات الأصلية. يظهر هنا بروتوكول مفصل يوضح كيف يمكن استخدام SARS-CoV-2 PVs لاختبار قدرة مصل المرضى على التحييد بعد التطعيم ضد COVID-19.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفيروسات الزائفة كأداة جزيئية لمراقبة الاستجابات المناعية الخلطية ضد SARS-CoV-2 عن طريق مقايسة التحييد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف واختبار القدرة المعادلة لعينات المصل ، بالإضافة إلى استخدامها المعروف في العلاج الجيني لتوصيل جين مهم. PVs معيبة في النسخ المتماثل لأن الجينوم الفيروسي ينقسم إلى بلازميدات مختلفة غير مدمجة في PVs. يسمح هذا النظام الآمن والمتعدد الاستخدامات باستخدام PVs في مختبرات مستوى السلامة البيولوجية 2. هنا ، نقدم منهجية عامة لإنتاج PVs lentiviral على أساس ثلاثة بلازميدات كما هو مذكور هنا: (1) البلازميد الفقري الذي يحمل جين المراسل اللازم لمراقبة العدوى. (2) بلازميد العبوة الذي يحمل الجينات لجميع البروتينات الهيكلية اللازمة لتوليد PVs ؛ (3) تعبير البروتين السكري السطحي المغلف البلازميد الذي يحدد انتحاء الفيروس ويتوسط الدخول الفيروسي إلى الخلية المضيفة. في هذا العمل ، SARS-CoV-2 Spike هو البروتين السكري المغلف المستخدم لإنتاج فيروسات عدسية غير متماثلة من النوع الكاذب SARS-CoV-2.
باختصار ، تم نقل خلايا التغليف (HEK293T) مع البلازميدات الثلاثة المختلفة باستخدام الطرق القياسية. بعد 48 ساعة ، تم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على PVs وتصفيتها وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم اختبار عدوى SARS-CoV-2 PVs من خلال دراسة تعبير الجين المراسل (luciferase) في خط الخلية المستهدف بعد 48 ساعة من الإصابة. كلما زادت قيمة وحدات التلألؤ النسبية (RLUs) ، زاد معدل العدوى / النقل. علاوة على ذلك ، تمت إضافة PVs المعدية إلى عينات المصل المخففة بشكل متسلسل لدراسة عملية تحييد دخول الفيروسات الكاذبة إلى الخلايا المستهدفة ، والتي تم قياسها على أنها انخفاض في كثافة RLU: قيم أقل تتوافق مع نشاط تحييد عالي.
المقدمة
الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية تستخدم في علم الأحياء الدقيقة لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف ومسببات الأمراضالممرضة 1،2،3،4. تتكون PVs من جزء داخلي ، النواة الفيروسية التي تحمي الجينوم الفيروسي ، وجزء خارجي ، البروتينات السكرية المغلفة على سطح الفيروس الذي يحدد الانتحاء5. الفيروس الكاذب غير كفء للتكاثر في الخلية المستهدفة لأنه لا يحتوي على جميع المعلومات الوراثية لتوليد جزيئات فيروسية جديدة. هذا المزيج من الميزات الغريبة يجعل PVs بديلا آمنا لفيروس من النوع البري. من ناحية أخرى ، فإن الفيروسات البرية شديدة الإمر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة فيرونا ويتبع المبادئ التوجيهية لها (رقم بروتوكول الموافقة 1538). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص المشاركين في الدراسة. تم جمع عينات الدم الكامل من متطوعي العاملين في مجال الرعاية الصحية (HCW) الذين كانوا بصدد تلقي لقاحات مضادة ل SARS-CoV-2. تم جمع هذه العينات في أنابيب بلاستيكية تحتوي على مضادات التخثر للعزل اللاحق للمصل15.
يجب إجراء جميع العمليات التالية في غطاء بيولوجي من الفئة 2 ، يعمل في ظل ظروف معقمة. يجب إجراء معالجة الفيروسات بعناية ، ويجب تحييد جميع منتجات النفايات في محلول مبيض مخفف. يتم عرض نظرة عامة على البروتوكول في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف هذا البروتوكول إنتاج الخلايا الكهروضوئية SARS-CoV-2 والتطبيق النهائي لهذه الخلايا الكهروضوئية لتحليل نشاط تحييد المصل / البلازما للأشخاص الذين يتلقون التطعيم المضاد ل COVID-1917. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإنتاج أنماط زائفة لكل متغير مثير للقلق SARS-CoV-2 (VOC) لاختبار تطور الاستجابة المعادلة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يسهل دراسة الاستجابة المناعية الخلطية بعد التطعيم ضد COVID-19 ، إلا أنه يمكن تكييفه لاختبار تحييد الأمصال / البلازما المختلفة بسهولة ضد الفيروسات المختلفة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن استخدام فيروس من النوع البري يحاكي العدوى الفعلية ، إلا أن الفيروسات العدسية PVs هي خيار أكثر أمانا لدراسة الآليات المرتبطة بدخول الفيروس والعدوى دون متطلبات السلامة الصارمة اللازمة للعمل مع الفيروسات المسببة للأمراض4،20،21. تتكون PVs من نواة فيروسية معيبة في التكاثر محاطة ببروتين سكري مغلف سطحي لفيروس ممرض وهو هدف الدراسة.
تعد الخلايا الكهروضوئية القائمة على فيروس نقص المناعة البشرية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونعترف بمساهمة المتطوعين العاملين في مجال الرعاية الصحية. تم دعم هذا المشروع من قبل إدارة التميز 2023/2027 ، MUR ، إيطاليا. تم دعم AR و DZ من قبل PRIN2022 (تمويل الاتحاد الأوروبي; الجيل القادمالاتحاد الأوروبي)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.45 مو ؛ مرشح m | SARSTEDT | 83 1826 | |
| لوحة 6 آبار | SARSTEDT | 83 3920 | |
| لوحة 96 بئر | SARSTEDT | 8،33،924 | |
| Amicon Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي Merck | 10403892 | ||
| أسود غير شفاف 96 بئر صفيحة | دقيقة Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium ؛ | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500 مل | |
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| مصل الأبقار الجنيني | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism الإصدار 7 | graphpad dotmatics | NA | في المخطوطة ، نستبدل الاسم التجاري ب "برنامج تحليل البيانات" |
| HEK293T الخلايا | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T / ACE2 | ATCC | CRL-3216 | HEK293T إلى الإفراط في التعبير عن ACE2 مع ناقل فيروسي. |
| L-الجلوتامين | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| مقياس الإضاءة - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | في المخطوطة ، نستبدل الاسم التجاري ب 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | في المخطوطة ، نستبدل الاسم التجاري ب "وسط المصل المخفض" |
| ص 8.91 التعبئة والتغليف البلازميد | دي جينوفا وآخرون ، 2021 | هدية لطيفة من البروفيسور نايجل تيمبرتون (المرجع 16.) | |
| مراسل pCSFLW بلازميد | دي جينوفا وآخرون ، 2021 | هدية لطيفة من البروفيسور نايجل تيمبرتون (المرجع 16.) | |
| البنسلين / الستربتومايسين | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| بولي إيثيلينيمين ، متفرع (PEI) (25 كيلو دالتون) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV / Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | تم استخدام هذا البلازميد لتوليد HEK293Tcells / ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike الذي يعبر عن البلازميد | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | في المخطوطة ، استبدلنا الاسم التجاري ب "كاشف قراءة لوسيفيراز" |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
المراجع
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
