مقالة منهجية

مجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب لتوصيف هيكلي أميلويد خال من الملصقات

DOI:

10.3791/65670

⸱

سبتمبر 8, 2023

 ,  , 
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة كيف يمكن تطبيق المجهر ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب لتوصيف التنظيم المحلي داخل الهياكل الفوقية الأميلويد الخالية من التسمية. كما يصف كيفية تحضير العينة وقياسها ، وتجميع الإعداد المطلوب ، وتحليل البيانات للحصول على معلومات حول التنظيم المحلي لألياف الأميلويد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالمقارنة مع نظيره ذو الفوتون الواحد ، فإن الإثارة ثنائية الفوتون مفيدة لتجارب التصوير الحيوي بسبب انخفاض السمية الضوئية ، واختراق الأنسجة الأعمق ، والتشغيل الفعال في الأنظمة المزدحمة ، وتقليل الانتقاء الضوئي الزاوي للفلوروفور. وبالتالي ، فإن إدخال تحليل الاستقطاب في المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PFM) يوفر تحديدا أكثر دقة للتنظيم الجزيئي في عينة مقارنة بطرق التصوير القياسية القائمة على العمليات البصرية الخطية. في هذا العمل ، نركز على 2PFM الحساسة للاستقطاب (ps-2PFM) وتطبيقها في تحديد الترتيب الجزيئي داخل الهياكل الحيوية المعقدة - كرويات الأميلويد. غالبا ما يتم تشخيص الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر أو باركنسون من خلال الكشف عن مجاميع بروتين الأميلويد التي تشكلت بسبب ضعف عملية اختلال البروتين. يؤدي استكشاف هيكلها إلى فهم أفضل لمسار إنشائها وبالتالي تطوير طرق تشخيص أكثر حساسية. تقدم هذه الورقة ps-2PFM التي تم تكييفها لتحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري ومجاميع البروتين النشواني الكروي. علاوة على ذلك ، نثبت أن التقنية المقترحة يمكن أن تحل التنظيم ثلاثي الأبعاد للألياف داخل الكروية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقود الماضية ، على الرغم من حدوث تطور كبير للعديد من تقنيات الفحص المجهري الفلوري للتصوير الحيوي للبروتينات ومجاميعها1 ، فقد تم استخدام عدد قليل فقط لحل ترتيبها المحلي داخل العينة 2,3. تم استخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياةالفلوري 4 لدراسة عدم التجانس الهيكلي الجوهري للهياكل الفوقية الأميلويد الكروية. علاوة على ذلك ، يمكن حل التحديد الكمي للترتيب المحلي داخل الهياكل الحيوية المعقدة والمعبأة بكثافة مثل spherulites باستخدام طرق حساسة للاستقطاب3. ومع ذلك ، فإن تقنيات التألق القياسية مع اختراق الأنسجة السطحية محدودة لأن استخدام الأطوال الموجية للأشعة المرئية وفوق البنفسجية لإثارة الفلوروفورات في الجسم الحي يؤدي إلى تشتت ضوء الأنسجةالعالي 5. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتطلب هذا التصوير تصميم وربط مجسات فلورية محددة بجزيء حيوي مستهدف ، وبالتالي زيادة تكلفة ومقدار العمل اللازم لإجراء التصوير.

في الآونة الأخيرة ، لمعالجة هذه المشكلات ، قام فريقنا بتكييف الفحص المجهري الفلوري المثار ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب (ps-2PFM) للتصوير الخالي من الملصقات للهياكل البيولوجية 6,7. يسمح Ps-2PFM بقياس اعتماد شدة مضان الفوتون على اتجاه الاستقطاب الخطي لحزمة الإثارة وتحليل استقطاب التألق المنبعث8. يتطلب تنفيذ هذه التقنية تكملة مسار إثارة إعداد المجهر متعدد الفوتون القياسي (الشكل 1) بلوحة نصف موجة للتحكم في مستوى استقطاب الضوء. بعد ذلك ، يتم إنشاء الرسوم البيانية القطبية ، التي تصور اعتماد شدة التألق المثارة ثنائية الفوتون على استقطاب شعاع ليزر الإثارة ، من الإشارات التي تم جمعها بواسطة اثنين من الثنائيات الضوئية للانهيار الجليدي ، وبالتالي جمع المكونين المتعامدين بشكل متبادل لاستقطاب التألق.

الخطوة الأخيرة هي عملية تحليل البيانات ، مع مراعاة تأثير العناصر البصرية ، مثل المرايا ثنائية اللون أو هدف الفتحة العددية العالية ، على الاستقطاب. نظرا لطبيعة عملية الفوتونين ، توفر هذه الطريقة كلا من اختيار الصورة الزاوي المنخفض والدقة المحورية المحسنة ، حيث أن إثارة الفوتون الثنائي للفلوروفورات خارج المستوى البؤري محدودة على الأرجح. وقد ثبت أيضا أنه يمكن تنفيذ طرق مماثلة بنجاح للتصوير في الجسم الحي لمجسات الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) لتصوير الأنسجة العميقة9. تم تطبيق Ps-2PFM سابقا على صور الفلوروفورات في أغشية الخلايا10 و DNA11,12 ، بالإضافة إلى علامات الفلورسنت غير القياسية للأنظمة البيولوجية ، مثل جسيمات الذهبالنانوية 13. ومع ذلك ، في كل هذه الأمثلة ، تم الحصول على المعلومات حول تنظيم الجزيئات الحيوية بشكل غير مباشر وتتطلب توجها متبادلا محددا مسبقا بين الفلوروفور والجزيء الحيوي.

في إحدى أوراقنا الأخيرة ، أظهرنا أنه يمكن تطبيق ps-2PFM بنجاح لتحديد الاستقطاب المحلي للتألق الذاتي للهياكل الفوقية للأميلويد والتألق من Thioflavin T ، وهي صبغة خاصة بالأميلويد ، مرتبطة بألياف الأميلويد في كروية6. علاوة على ذلك ، في واحد آخر ، أثبتنا أنه يمكن استخدام ps-2PFM للكشف عن اتجاه ليفي الأميلويد داخل كرويات الأميلويد في نظام حجم دون ميكرون ، وهو ما تم تأكيده من خلال ربطه بالتصوير المجهري الإلكتروني (TEM)7. كان تحقيق هذه النتيجة ممكنا بفضل أ) التألق الذاتي الجوهري للكرويات-الأميلويدات ، عند إثارته إما بفوتون واحد أو فوتونين ، يظهر تألقا ذاتيا جوهريا مع الحد الأقصى للانبعاثات الموجود في نطاق من 450 إلى 500 نانومتر ومقطع عرضي لامتصاص الفوتون يمكن مقارنته بالأصباغ الفلورية القياسية14 ، ii) النماذج الرياضية التي تم تقديمها سابقا لوصف كيفية تطبيق ps-2PEF للأصباغ التي تضع علامات على الأغشية البيولوجية وهياكل الحمض النووي مضان أظهرته كرويات وأصباغ مرتبطة بها8،11،15. وبالتالي ، قبل الشروع في التحليل ، نوصي بشدة بالنظر في النظرية المطلوبة الموضحة في كل من النص الرئيسي والمعلومات الداعمة لورقتنا الأولى المتعلقة بهذا الموضوع6. هنا ، نقدم بروتوكول كيفية تطبيق تقنية ps-2PFM للتوصيف الهيكلي للأميلويد الخالي من الملصقات لكويات الأنسولين البقري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير شرائح المجهر مع كرويات كاملة النمو

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. تم تحضير جميع المحاليل بالماء منزوع الأيونات (18.2 متر مكعب سم عند 25 درجة مئوية) تم الحصول عليها من نظام تنقية المياه.

  1. احتضان كرويات الأميلويد بناء على البروتوكول الذي وصفه كريبس وآخرون16. مع بعض التعديلات ، كما هو موضح أدناه.
    1. تزن 10 ملغ من مسحوق الأنسولين في أنبوب 1.5 مل.
    2. قم بإذابة المسحوق بحصة 1 مل من محلول H2O / HCl منزوع الأيونات (درجة الحموضة 1.5).
    3. أغلق العينة بالشريط وضعها في خلاط حراري لاحتضانها لمدة 24 ساعة عند 70 درجة مئوية (0 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: لإجراء تصوير الأميلويدات في بيئتها الأصلية (أي المائية) ومنع تشوه العينة بسبب الجفاف ، من الضروري تحضير شرائح المجهر وفقا للوصف التالي (المخطط الموضح في الشكل 2).
  2. اغسل شريحة زجاج المجهر جيدا بالماء.
  3. اغمس الشرائح في الميثانول واتركها حتى تجف في ظل الظروف المحيطة على منديل خال من الغبار.
  4. خذ حصة 100 ميكرولتر من محلول spherulite من الأنبوب باستخدام ماصة أوتوماتيكية (الخطوة 1.1.2) وأضفها إلى البئر الموجود في المنطقة المركزية من شريحة المجهر.
  5. قم بتغطية المحلول بغطاء ، وتجنب تكوين فقاعة الهواء.
  6. قم بتركيب الرواسب على طول حواف الغطاء على الشريحة باستخدام ماصة أوتوماتيكية لإغلاق المحلول الأصلي للكرويات.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان إيداع حامل الشريحة على كل من غطاء الغطاء وكذلك الأسطح المنزلقة. افعل ذلك تحت غطاء الدخان بسبب سمية المذيب المتطاير (الزيلين). انظر الجزء الداخلي في الشكل 2.
  7. اترك عينة المجهر في ظل الظروف المحيطة حتى يتصلب المركب.
    ملاحظة: تعتمد عملية التصلب على درجة الحرارة والرطوبة ولكن يجب إكمالها في غضون 12 ساعة.
  8. تحقق مما إذا كانت كرويات الأنسولين قد تشكلت بشكل صحيح باستخدام المجهر البصري المستقطب (POM) مع المستقطبات المتقاطعة. امسح العينة بحثا عن نمط مميز للمناطق الساطعة، يسمى الصليب المالطي، كما هو موضح في الشكل 3.
    ملاحظة: يمكن تعريف كرويات الأميلويد على أنها هياكل فوقية كروية تتميز بمورفولوجيا غير متجانسة ذات بنية قشرة أساسية. بالتفصيل ، فهي تتألف من نواة غير متبلورة وألياف الأميلويد المتنامية شعاعيا16. نظرا للطابع متباين الخواص للهياكل الكروية ، يمكن أن تتفاعل بشكل مميز مع الضوء المستقطب (على سبيل المثال ، عن طريق الانكسار) وتغيير طورها ، والذي يمكن ملاحظته بسهولة تحت POM مع المستقطبات المتقاطعة. تم استخدام هذه الطريقة لدراسة الكرويات المطورة بالكامل فقط والتي تتميز بنمط متقاطع يشبه النموذج. وبالتالي ، تم استبعاد الركام أو الكرووليت المشوه هيكليا من مزيد من التحقيقات.

2. بناء ومواءمة النظام

ملاحظة: يمكن العثور على تمثيل تخطيطي لمجهر ثنائي الفوتون حساس للاستقطاب في الشكل 1.

  1. قم بتثبيت ليزر فيمتو ثانية مع قابلية ضبط الطول الموجي الناتج في نطاق 690-1080 نانومتر ، على سبيل المثال ، يعمل على وضع مغلق Ti: ليزر الياقوت مع ~ 100 fs نبضات بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز.
  2. أضف لوحة نصف موجة مثبتة على مرحلة دوران إلى مسار الإثارة الخاص بالإعداد للتحكم في استقطاب الضوء الساقط في مستوى عينة المجهر XY.
  3. قم بتثبيت المرآة ثنائية اللون لقطع شعاع الإثارة من بصريات الكشف.
    ملاحظة: يجب أن تسمح الخصائص البصرية للمرآة ثنائية اللون بعكس حزمة الإثارة (للعينة) في نطاق الأطوال الموجية NIR وأن تكون شفافة في نفس الوقت لنطاق الطول الموجي المقابل للانبعاث من العينات.
  4. قم بتثبيت مرحلة مسح كهرضغطية لعمليات المسح النقطية داخل المستوى XY ل Z المختار.
  5. قم بتركيب هدف الغمر العالي NA ، على سبيل المثال ، هدف غمر الزيت apoochromatic 100x / 1.4 NA.
    ملاحظة: نظرا لأن الإعداد بأكمله يعمل في وضع التألق الوبائي، فإن الإشارات الساقطة والمنبعثة تمر بنفس الهدف.
  6. في مسار الانبعاث ، أضف مقسم شعاع مستقطب يقسم الانبعاث المثار ثنائي الفوتون إلى مكونين مستقطبين بشكل متعامد (IX و IY)
  7. قم بتركيب اثنين من الثنائيات الضوئية لعد الفوتونات (APDs) في تكوين يسمح لهما بجمع الضوء المنقول والمنعكس باستخدام مقسم الحزمة ، على التوالي (الشكل 1).
  8. قم بتركيب مرشحات القطع الصحيحة المعتمدة على الطول الموجي على مسار الإثارة والانبعاث للنظام ، على سبيل المثال ، مرشح تمرير طويل 800 نانومتر مباشرة في المسار البصري للإثارة ومرشح تمرير قصير 700 في مسار الانبعاث.
    ملاحظة: قم بتحليل أطياف الانبعاث من spherulite بحيث يمكن استبعاد أي مساهمة محتملة من الجيل التوافقي الثاني (SHG) أو ضوء الليزر باستخدام مرشحات الانبعاث الصحيحة. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا النظام يجب أن يسمح أيضا بقياسات SHG الحساسة للاستقطاب ، والتي يمكن استخدامها لحل ترتيب الجزيئات الحيوية داخل العينات. ومع ذلك ، فإن تحليل البيانات لإشارة SHG يختلف عن التألق ، والذي وصفه Aït-Belkacem et al.17 بمزيد من التفصيل.
  9. قم بمحاذاة النظام بأكمله (باستخدام وضع المحاذاة المدمج في العديد من أجهزة الليزر) حتى يتم جمع شدة إشارة مماثلة باستخدام كل من الثنائيات الضوئية.
  10. تحقق مما إذا كان شعاع الإثارة الذي يركز عليه هدف NA العالي والمصور على الكاميرا له شكل دائري متحد المركز كما هو موضح في الشكل 4A.
  11. اضبط وقت المسح والطاقة المقابلة لتقليل الضرر الناجم عن الليزر الساقط على العينة. يتم عرض حرق مثالي يشبه النقطة في الشكل 4B. قم بقياس الطاقة الاسمية باستخدام مقياس طاقة رقمي محمول باليد متصل بجهاز استشعار طاقة الصمام الثنائي الضوئي الموجود عند مدخل جسم المجهر.
    ملاحظة: يمكن حرق العينات البيولوجية بسهولة بسبب إضاءة الليزر. في هذه الحالة ، وجد أن نطاق الطاقة 100-900 μW (عند النقطة البؤرية للعدسة الموضوعية) هو مقايضة ممتازة بين استقرار العينة والانبعاثات الشديدة.
  12. قبل قياس العينة ، اختبر جودة محاذاة البصريات مع عينة مرجعية متباينة الخواص (على سبيل المثال ، الفلوريسئين المتجسد في البوليمر غير المتبلور). لإجراء فحص المعايرة ، اتبع الإجراء الموضح في القسم 3 باستخدام مرجع الخواص بدلا من عينة الأميلويد.
    ملاحظة: مع افتراض أن إعداد الفحص المجهري يتم ضبطه بشكل مثالي للعينة ذات الخواص الخواص ، يجب تمييز كل من مكونات انبعاث 2P (IX و IY) المكتشفة مع اثنين من APDs بنفس الكثافة (الشكل 4C).

3. قياس كرويات الأنسولين البقري

ملاحظة: لإجراء جميع قياسات ps-2PF الموصوفة ، تم استخدام برنامج مكتوب بخط اليد ، والذي يتحكم في مواضع المرحلة الكهرضغطية ونصف الصفيحة الموجية ويجمع الإشارة من كل من الثنائيات الضوئية ، مما يسمح برسم عمليات المسح XY (المسح النقطية) من مناطق محددة على شرائح المجهر وكذلك الرسوم البيانية القطبية من إحداثيات عينة محددة. كما تمت إضافة ملاحظات إضافية إلى البروتوكول ، والتي ستسمح للمستخدمين بإجراء القياس بدونها ، حيث يمكن التحكم في كل من مرحلة بيزو ومرحلة الدوران المستخدمة لتدوير لوحة نصف الموجة باستخدام وحدات التحكم الخاصة بهم أو البرامج المقابلة. ومع ذلك ، يوصى بشدة بكتابة خوارزمية تجمع بين زاوية دوران لوحة نصف موجة مع شدة 2PEF التي تم جمعها مع كل من الثنائيات الضوئية لأن هذا الارتباط (الرسوم البيانية القطبية) أمر بالغ الأهمية لتحليل البيانات المناسب مما يؤدي إلى معلومات هيكلية.

  1. قم بتركيب العينة باستخدام الكرووليت على المسرح الكهرضغطية (شل حركة الشريحة الزجاجية بشريط). تأكد من تركيبه بطريقة يواجه فيها جانب زجاجي رفيع (غطاء الغطاء) الهدف حيث تتميز الأهداف العددية العالية بمسافات عمل قصيرة نسبيا.
    ملاحظة: عند استخدام غمر الزيت ، يجب وضع قطرة صغيرة من الزيت المعدني على الهدف قبل تركيب العينة وتركيزها.
  2. من خلال تغيير مواضع XY و Z باستخدام مقابض المجهر ، ركز الهدف على أحد الكرويات الموجودة في المحلول ، ولكن اعلم أنه نظرا لأن أقطار الكروية عادة ما تكون في نطاق عشرات الميكرومتر ، ركز داخل المنطقة المركزية للهيكل بأكمله. ابحث عن الهالات السوداء والبيضاء حول الكروية المحددة كعلامات على التركيز السفلي والعلوي ، على التوالي. اضبط المحور "Z" ليكون بين هذين النقيضين.
    ملاحظة: من المهم العثور على عينة معزولة بدون عيوب هيكلية. قد تنجرف الكرويات الصغيرة للغاية بسبب الإجهاد المادي الناتج عن الهدف بينما من المحتمل أن تكون الهياكل الأكبر مجمعة أو مشوهة للغاية.
  3. قم بتوسيط الكروية في مجال رؤية المستوى المجهري المرصود وحدد حجم المسح XY من خلال النظر في عدد خطوات المرحلة الانضغاطية في الاتجاهين X و Y (المعروضة على وحدة التحكم في مرحلة الانضغاطية أو في برنامجها) اللازمة لتغطية مساحة الهيكل بأكمله.
    ملاحظة: يوصى بضبط النظام بحيث تكون بداية فحص XY بالقرب من أحد أركان الكروية وتتزامن مع موضع الصفر للمرحلة (X و Y = 0)
  4. اضبط معلمات المسح التالية:
    1. اضبط استقطاب حزمة الإثارة ، وقم بتدوير لوحة نصف الموجة للحصول على الاستقطاب المقابل للمحورين "X" و "Y" لمستوى عينة المجهر.
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك عن طريق قياس الرسوم البيانية القطبية لوسط الفلورسنت الخواص مثل الفلوريسين. بالنسبة لمثل هذه المواد ، تكون شدة التألق القصوى موازية لاستقطاب شعاع الإثارة ؛ وبالتالي ، فإن تدوير لوحة نصف الموجة يضبط الاستقطاب مع المحور X و Y على مستوى المراقبة ، والذي يشار إليه أيضا بالمحور X و Y على الرسوم البيانية القطبية كما في الشكل 4C. يمكن قياس الرسوم البيانية القطبية الكاملة من خلال جمع شدة 2PEF المقاسة على كل من الثنائيات الضوئية لدوران 180 درجة للوحة نصف الموجة (دوران 360 درجة لاستقطاب ضوء الإثارة) وربط الشدة بزاوية استقطاب ضوء الإثارة. يمكن القيام بذلك يدويا ، عن طريق قياس كثافة الانبعاثات لكل زاوية لوحة نصف موجة بشكل منفصل ثم تجميعها في رسم بياني قطبي في برنامج تحليل البيانات أو تلقائيا ، باستخدام برنامج مخصص أو مكتوب ذاتيا.
    2. اضبط معلمات مرحلة الانضغاطة: سرعة المسح والخطوة والنطاق لتغطية مساحة الكرة الأرضية بأكملها.
      ملاحظة: يجب أن يكون نطاق المسح أعلى من قطر الكروية لتأطير البنية الفوقية بالكامل داخل المسح النقطي. تسمح سرعة المسح المنخفضة والخطوة للمستخدمين بالحصول على صور عالية الجودة ؛ ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى حرق العينة. لذلك ، من الضروري إجراء مقايضة تعتمد على حجم الكروية. لا يمكن تطبيق هذه المعلمات عالميا. المعلمات النموذجية المستخدمة في الشكل 5A: نطاق المسح 45 × 45 ميكرومتر ، خطوة المسح 1 ميكرومتر ، وسرعة المسح 2 ميكرومتر / ثانية.
  5. افتح الغالق ، وقم بتشغيل الثنائيات الضوئية ، وجمع figure-protocol-1 figure-protocol-2 مكونات انبعاث 2P لكل خطوة من منطقة المسح المحددة - لاستقطاب شعاع الإثارة بما يتوافق مع X ثم محاور Y. يتم عرض المسح النقطي النموذجي ثنائي الفوتون (2PAF) للكرويات الأنسولينية في الشكل 5A.
    ملاحظة: يتطلب قياس عمليات المسح النقطية ربط إحداثيات مرحلة بيزو بمكونات figure-protocol-3 الانبعاثات المجمعة figure-protocol-4 ، والتي يمكن إجراؤها يدويا ، عن طريق قياس الكثافة في كل نقطة من المنطقة المحددة ثم تجميعها في مصفوفة 2D ، أو تلقائيا ، عبر برنامج مكتوب ذاتيا. يمكن تقديم عمليات المسح النقطية كجمع لكثافة figure-protocol-5 مكونات الانبعاثات figure-protocol-6 أو بشكل مميز لمكون انبعاث معين. نظرا لأنها تعتمد بشكل كبير على البنية ، فإن التشوهات الهيكلية داخل الكرويات يمكن رؤيتها بسهولة. ومع ذلك ، بسبب حركة مرحلة المجهر ، قد تنجرف بعض العينات من مجال الرؤية. لذلك ، يجب فحص الصور بحثا عن القطع الأثرية. من الضروري التحقق من موضع الكروية قبل وبعد الفحص.
  6. لإجراء تحليل الاستقطاب الكامل من البقعة المحددة في العينة ، قم بإيقاف تشغيل شعاع الإثارة.
  7. بعد ذلك ، اختر إحداثيات محددة من مرحلة الضغط المقابلة للموقع المختار على الكروية حيث تكون المعلومات حول اتجاه الجزيئات مطلوبة بدقة دون ميكرومتر.
  8. اضبط المرحلة الكهرضغطية لتوسيط مجال الرؤية عند الإشارة (X ، Y).
  9. قم بتشغيل شعاع الإثارة وقم بإجراء تحليل figure-protocol-7 استقطاب كامل (360 درجة) وانبعاث figure-protocol-8 عن طريق تشغيل دوران لوحة نصف الموجة (دوران 180 درجة). قدم مكونات 2PF IX و Iy في شكل رسم بياني قطبي (كما هو موضح في الشكل 5B).
    ملاحظة: يمكن تكرار هذه الخطوة في مواقع مختلفة في العينة لجمع كمية كافية من البيانات.

4. تحديد ترتيب الألياف المحلية داخل كرويات الأنسولين البقري

ملاحظة: تم إجراء جميع الحسابات العددية المتصلة بتحليل البيانات باستخدام لغة برمجة Python واستنادا إلى الوظائف المتوفرة في مكتبات NumPy و SciPy. يتطلب رسم البيانات مكتبة Matplotlib. تستند جميع الحسابات إلى الصيغ المقدمة في المعلومات الداعمة في إحدى الأوراق التي كتبها Obstarczyk et al.6.

  1. محاكاة شدة مضان ثنائي الفوتون متحمس للتوزيع المحدد للجزيئات مع اتجاه محدد لاستقطاب الضوء الساقط (يشار إليه بالرمز α)
    ملاحظة: تستند الصيغ المقدمة إلى افتراض الامتصاص المتوازي ولحظات الانبعاث ثنائي القطب للفلوروفور. لمناقشة الحالات الأخرى (على سبيل المثال ، الاتجاهات المختلفة لعزوم ثنائي القطب للامتصاص والانبعاث ، ونقل الطاقة بين الفلوروفورات) ، انظر ورقة Le Floc'h et al8.
    1. أوجد المعلمات التي تمثل تغير المجال الكهربائي عن طريق خلط الاستقطاب وتأثيرات إزالة الاستقطاب التي تسببها المرآة ثنائية اللون المثبتة في الإعداد:
      1. يمثل γ عامل السعة بين انعكاسية figure-protocol-9 الضوء المستقطب figure-protocol-10 والمستقطب من مرآة ثنائية اللون.
      2. يمثل δ إزاحة الطور (الإهليلجية) بين figure-protocol-11 الضوء المستقطب figure-protocol-12 .
        ملاحظة: يعد تحديد هاتين المعلمتين بشكل صحيح أمرا بالغ الأهمية لنجاح التوصيف الهيكلي بسبب تأثيرهما القوي على شكل الرسوم البيانية القطبية المقاسة11,18. في حالة النظام المقدم ، تم تحديد كلا المعلمتين أثناء قياسات القياس الإهليلجي لمرآة ثنائية اللون مطبقة في النظام.
    2. احسب متجهات المجال الكهربائي الساقطة التي تنتشر في المحورين X و Y لكل زاوية تم قياسها أثناء قياس ps-TPFM باستخدام المعادلات (1-5).
      figure-protocol-13 (1)
      figure-protocol-14 (2)
      figure-protocol-15 (3)
      figure-protocol-16 (4)
      figure-protocol-17 (5)
      ملاحظة إذا تم قياس الشدة على 360 درجة بأكملها مع الخطوة 1 درجة، حساب متجهات المجال الكهربائي لجميع 360 درجة. يجب أن تكون جميع الزوايا بالراديان. ρ المعلمة متصلة بالتردد البصري ω للمجال الكهربائي المحاكي (ρ = ω ·t) وتستخدم متكاملة من 0 إلى 2π أثناء حسابات متجهات المجال الكهربائي الساقطة التي تنتشر في المحور X و Y لكل زاوية α قياسها أثناء قياس ps-TPFM.
    3. تحديد دوال العزوم ثنائية القطب الانتقالية في اتجاهات ثلاثة محاور للنظام الديكارتي وفقا للمعادلات (6-8):
      figure-protocol-18 (6)
      figure-protocol-19 (7)
      figure-protocol-20 (8)
      ملاحظة: φ هي زاوية اتجاه المحور الطويل لألياف الأميلويد في إطار العينة XY. θ وزوايا φ هي الزوايا القطبية والسمتية المستخدمة لتحديد اتجاه عزم ثنائي القطب الانتقالي للفلوروفور.
    4. استخدم الدالات المحددة في الخطوة 4.1.3. لتحديد وظائف Jx (Φ ، θ ، φ) و JY (Φ ، θ ، φ) ، والتي تمثل مساهمة تركيز الضوء الضيق مع هدف الفتحة العددية العالية في اكتشاف استقطاب التألق في اتجاه X و Y باستخدام المعادلات (9 ، 10).
      figure-protocol-21 (9)
      figure-protocol-22 (10)
      ملاحظة: ترتبط عوامل K1 و K2 و K3 بهدف المجهر المستخدم أثناء قياس ps-TPFM. في هذه التجارب ، تم استخدام هدف غمر الزيت apochromatic 100x / 1.4 NA وكانت عوامل K1 و K2 و K3 2.945 و 0.069 و 1.016 على التوالي.
    5. تحديد دالة ل f (Ω) ، وهو توزيع زاوي جزيئي ، اعتمادا على نصف فتحة مخروط الفلوروفور Ψ ، بسمك متغير ΔΨ ؛ استخدم المعادلة (11). يتم عرض التمثيل البياني لجميع الزوايا الثلاث المتعلقة بالألياف النشوانية في الشكل 6.
      figure-protocol-23(11)
      ملاحظة: كن حذرا أثناء كتابة الأس - قوة 2 تعمل على وسيطة الدالة ، وليس الدالة بأكملها!
    6. حدد جميع عوامل fWWIJKL كما هو موضح في المعادلات (12-21).
      figure-protocol-24 (12)
      figure-protocol-25 (13)
      figure-protocol-26 (14)
      figure-protocol-27 (15)
      figure-protocol-28 (16)
      figure-protocol-29 (17)
      figure-protocol-30 (18)
      figure-protocol-31 (19)
      figure-protocol-32 (20)
      figure-protocol-33 (21)
    7. احسب شدة figure-protocol-34 التألق المثارة ثنائية الفوتون ولكل figure-protocol-35 زاوية مقاسة (كما في النقطة 4.1.2) باستخدام المعادلات (22 ، 23).
      figure-protocol-36figure-protocol-37 = (22)
      figure-protocol-38figure-protocol-39 = (23)
    8. تحقق مما إذا كانت المحاكاة تعمل بشكل صحيح باستخدام قيم المتغيرات التالية (الموضوعة في وسيلة الإيضاح إلى الشكل 7) وقارن النتائج التي تم الحصول عليها بالشكل 7A-C.
      ملاحظة: يجب كتابة جميع الدرجات بالراديان.
  2. تناسب الشدة المحاكاة مع شدة التألق الذاتي ثنائي الفوتون لكرويات الأنسولين البقري التي تم جمعها أثناء قياسات ps-2PFM.
    ملاحظة: يتطلب حل بنية الكروية بناء على قياسات ps-2PFM استخدام المعادلات المكتوبة في البروتوكول لمحاكاة الكثافة النظرية للتألق المثار ثنائي الفوتون وملاءمة جميع المعلمات المتصلة بترتيب الفلوروفور الجزيئي. يتطلب تكرارات متعددة على القيم المختلفة ل Φ ، زاوية تصف دوران الألياف في عينة المجهر XY ، و ΔΨ ، انحرافات التوزيع المخروطي لثنائي القطب الانبعاث Ψ بسبب الدورات الجزيئية في خيوط ثابتة Ψ حتى الوصول إلى أعلى معامل R2 ممكن بين شدة إشارة التألق المثارة ثنائية الفوتون التي تم جمعها أثناء القياس والشدة الطبيعية التي تمت محاكاتها وفقا ل الخطوة 4.1 من البروتوكول.
    1. أوجد نصف الزاوية Ψ .
      ملاحظة: بالنسبة لكرويات الأنسولين البقري ، يجب أن تكون مساوية ل Ψ = 29 ° 6.
    2. سير العمل المناسب:
      1. اختر قيمة Φ من 0 درجة إلى 180 درجة (في الشكل 8A و 8B Φ = 16 درجة و 127 درجة على التوالي).
      2. اختر قيمة ΔΨ من 0 درجة إلى 90 درجة (في الشكل 8 أ ، ب ، δψ = 24 درجة و 1 درجة ، على التوالي).
      3. احسب figure-protocol-40 (المعادلة 22) و figure-protocol-41(المعادلة 23) للنطاق المقاس الكامل لزوايا θ باستخدام القيم المختارة ل Φ و ΔΨ.
      4. قارن الشدة المحسوبة أثناء عمليات المحاكاة (كلاهما طبيعي إلى القيمة القصوى ل
      5. احسب figure-protocol-42) مع شدة طبيعية من
      6. احسب figure-protocol-43 و figure-protocol-44 (كلاهما طبيعي إلى الحد الأقصى لقيمة figure-protocol-45) المقاسة أثناء قياس ps-2PFM.
        ملاحظة: في التجارب المقدمة ، تم حساب معاملات ارتباط عزم منتج بيرسون باستخدام دالة "corrcoef" من مكتبة NumPy Python.
    3. في النهاية ، اختر قيم Φ و ΔΨ مما يؤدي إلى أعلى معاملات الارتباط والتقارب بين الشدة المحاكاة والإشارة المقاسة المشابهة لما هو موضح في الشكل 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول المقدم إرشادات خطوة بخطوة من خلال إعداد الهياكل الفوقية للأميلويد للاختبار باستخدام ps-2PFM ، وبناء النظام المجهري ، وقياسات العينة المناسبة. ومع ذلك ، قبل المجموعة النهائية من القياسات ، من الضروري محاذاة APDs بشكل صحيح مع مرجع الخواص ، مما يؤدي إلى جمع إشارة متناظرة ذات شكل وشدة متشابهين على كلا الكاشفين (الشكل 4C). حتى الحد الأدنى من الاختلافات بين الشدة المقاسة على أجهزة الكشف في المحورين X و Y يجب أن تؤخذ في الاعتبار في القياسات الإضافية وخاصة أثناء التحليل كعامل تصحيح م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون الحساس للاستقطاب أداة قيمة لدراسة الترتيب المحلي للألياف داخل الهياكل الفوقية الأميلويد ، والتي تتطلب تعديلات صغيرة فقط على الإعداد القياسي متعدد الفوتونات. نظرا لأنه يعمل على الظواهر البصرية غير الخطية ، يمكن تحقيق تقليل اختيار الصورة الزاوية والدقة المحورية المحسنة مقارنة بطرق الفحص المجهري الفلوري المثار بفوتون واحد. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يؤدي إلى انخفاض تشتت الضوء ، وانخفاض السمية الضوئية ، واختراق أعمق للعينة عند مقارنته بتقنيات الفحص المجهري الفلوري للإثارة ذات الفوتون

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع Sonata Bis 9 (2019/34 / E / ST5 / 00276) بتمويل من المركز الوطني للعلوم في بولندا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > تحضير العينة < / قوي >
Coverslips ، 24 × 24 ممChemland04-298.202.04
DPX mountant للأنسجةSigma-Aldrich6522Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock أنابيب ، 1.5 مل ، بولي بروبيلينChemland02-63102
Eppendorf ThermoMixer   ؛ CEppendorfيستخدم في حضانة الكروليت
HLP 5UV نظام تنقية المياهHydrolabمصدر المياه الأيونية المستخدمة في تحضير
العينة حمض الهيدروكلوريك (& ge ؛ 37٪ ، APHA & le. 10) ،الأنسولين Sigma-Aldrich30721-M
من البنكرياس البقري (& ge ؛ 25 وحدة / مجم (HPLC))Sigma-AldrichI5500
Methanol (درجة HPLC)270474Sigma-Aldrich
مع مقعر ، 76 × 26 × 1 ممChemland04-296.202.09
Olympus BX60OlympusPolarized Optical Microscope المستخدم في الشكل 2
شريط ختم الخيط PTFE ، 12 مم × 12 مم × 0.1 مم ، 60 جم 2< / sup>ChemlandVIT131097
<قوي> المجهر ps-2PFM setup
Chameleon Ultra IICoherent
FELH0800 - & Oslash; 25.0 مم مرشح LongpassThorlabs
FESH0700 - & Oslash ؛ 25.0 مم مرشح ممرقصير Thorlabs
IDQ100 الثنائيات الضوئية للانهيار الجليدي عد الفوتون ID Quantique
Multiphoton مرشح انبعاث التمرير القصير 720 نانومتر  على سيمروك
، 690-1200 نانومترThorlabs
نيكون خطة Apo غمر الزيت 100x / 1.4 NAنيكون
بيزو المرحلة ثلاثية الأبعادنظام بيزوsystem جينا
مستقطب شعاع مقسمThorlabs
S130C - مستشعر طاقة الثنائي الضوئي النحيف ، Si ، 400 - 1100 نانومتر ، 500 ميجاواتThorlabs
Software
LabView 2018National Instrumentsالإصدار 18.0.1f2
مكتبةالإصدار 3.3.2
مكتبةالإصدار 1.19.2
مكتبةالإصدار 1.5.2
Spyder Python 3 IDEالإصدار 4.1.5
مسحوق شرائح مجهر لوحة نصف موجة لونية مثبتة Matplotlib NumPy SciPy

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611(2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829(2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة