Method Article

تجارب علم البصريات الوراثية عالية الإنتاجية في الخميرة باستخدام المنصة الآلية Lustro

DOI:

10.3791/65686

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول خطوات استخدام المنصة الآلية Lustro لإجراء توصيف عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية في الخميرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر علم البصريات الوراثي تحكما دقيقا في السلوك الخلوي من خلال استخدام البروتينات الحساسة للضوء المشفرة وراثيا. ومع ذلك ، فإن تحسين هذه الأنظمة لتحقيق الوظيفة المطلوبة غالبا ما يتطلب دورات متعددة لاختبار التصميم والبناء ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. ولمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير منصة لوسترو، وهي منصة تجمع بين التحفيز الضوئي وأتمتة المختبرات، مما يتيح الفحص الفعال عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية.

تستخدم Lustro محطة عمل أتمتة مزودة بجهاز إضاءة وجهاز اهتزاز وقارئ ألواح. من خلال استخدام ذراع روبوتية ، يقوم Lustro بأتمتة حركة لوحة microwell بين هذه الأجهزة ، مما يسمح بتحفيز سلالات البصريات الجينية وقياس استجابتها. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا حول استخدام Lustro لتوصيف أنظمة البصريات الوراثية للتحكم في التعبير الجيني في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae. يغطي البروتوكول إعداد مكونات Lustro ، بما في ذلك دمج جهاز الإضاءة مع محطة عمل الأتمتة. كما يوفر تعليمات مفصلة لبرمجة جهاز الإضاءة وقارئ اللوحات والروبوت ، مما يضمن التشغيل السلس والحصول على البيانات طوال العملية التجريبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علم البصريات الوراثي هو تقنية قوية تستخدم البروتينات الحساسة للضوء للتحكم في سلوك الخلايا بدقةعالية 1،2،3. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولية للتركيبات الوراثية البصرية وتحديد ظروف الإضاءة المثلى يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تحسين أنظمة البصرياتالوراثية 4,5. يمكن للطرق عالية الإنتاجية لفحص وتوصيف نشاط الأنظمة الوراثية البصرية بسرعة تسريع دورة اختبار التصميم والبناء لاختبار تركيبات النماذج الأولية واستكشاف وظيفتها.

تم تطوير منصة Lustro كتقنية أتمتة للمختبرات مصممة لفحص وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية عالية الإنتاجية. إنه يدمج قارئ الصفائح الدقيقة وجهاز الإضاءة وجهاز الاهتزاز مع محطة عمل الأتمتة6. يجمع Lustro بين الزراعة الآلية والتحفيز الضوئي للخلايا في ألواح microwell (الشكل 1 والشكل التكميلي 1) ، مما يتيح الفحص والمقارنة السريعة لأنظمة البصريات الوراثية المختلفة. منصة Lustro قابلة للتكيف بدرجة كبيرة ويمكن تعميمها للعمل مع روبوتات أتمتة المختبرات الأخرى ، وأجهزة الإضاءة ، وقارئات الألواح ، وأنواع الخلايا ، وأنظمة علم البصريات الوراثية ، بما في ذلك تلك التي تستجيب لأطوال موجية مختلفة من الضوء.

يوضح هذا البروتوكول إعداد واستخدام Lustro لتوصيف نظام البصريات الوراثي. يستخدم التحكم البصري الوراثي لعوامل النسخ المنقسمة في الخميرة كمثال على النظام لتوضيح وظيفة وفائدة المنصة من خلال التحقيق في العلاقة بين مدخلات الضوء والتعبير عن جين مراسل الفلورسنت ، mScarlet-I7. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين تبسيط تحسين أنظمة البصريات الوراثية وتسريع اكتشاف استراتيجيات جديدة للتحكم الديناميكي في الأنظمة البيولوجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توثيق سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. تظهر هذه السلالات نموا قويا في نطاق درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية ويمكن زراعتها في مختلف وسائط الخميرة القياسية.

1. إعداد محطة عمل الأتمتة

  1. جهز محطة العمل الآلية بذراع قابض روبوتي (RGA ، انظر جدول المواد) قادر على تحريك ألواح microwell (الشكل 1).
  2. قم بتركيب شاكر سخان الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) في محطة العمل الآلية (الشكل 1 (1)) باستخدام آلية قفل اللوحة التلقائية التي توفر الوصول إلى RGA.
  3. ضع قارئ الألواح الدقيقة بجوار محطة العمل الآلية (الشكل 1 (2)) ، مما يضمن إمكانية الوصول إلى RGA.
  4. قم بدمج جهاز إضاءة microplate (الشكل 1 (3)) الذي يسمح بالوصول المريح إلى RGA. ومن الأمثلة على ذلك لوحة البصر8 (كما هي مستخدمة في هذه الدراسة) أو LITOS9 (انظر جدول المواد).

2. إعداد جهاز الإضاءة

  1. قم ببناء ومعايرة لوحة البصر (أو جهاز الإضاءة البديل) باتباع الطرق المعمول بها8،10،11.
  2. استخدم محولا على جهاز الإضاءة لتمكين الوصول إلى RGA.
  3. قم ببرمجة optoPlate باستخدام إدخال جدول بيانات10 أو واجهة رسومية12. اتبع الخطوة 3 لتنفيذ برامج تحفيز الضوء.

3. تصميم برنامج التحفيز الضوئي

  1. حدد ظروف الإضاءة المطلوبة للتجربة.
  2. أدخل ظروف الإضاءة المطلوبة، بما في ذلك شدة الضوء ووقت بدء الضوء وطول النبضة ورقم النبضة ومدة النبضة البينية في جدول بيانات.
    ملاحظة: قم بتحديث هذه المعلومات على لوحة البصر باستخدام الإرشادات المتوفرة في مستودع GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. تذكر أن لوحة العينة لن تضيء أثناء وجودها في قارئ الصفيحة الدقيقة أو على شاكر السخان. قد تتطلب مدة وتواتر هذه الأحداث التحسين بناء على متطلبات تجريبية محددة.
  3. قم بتضمين الظروف المظلمة لكل سلالة لتمكين قياسات الخلفية المناسبة.
  4. لتجارب التوصيف الأولية لتقييم وظائف التحويل ، استخدم شدة ضوء عالية.
    ملاحظة: يجب تحسين شدة الضوء لإجراء تجارب أكثر حساسية ، حيث يمكن أن يكون الضوء الزائد ساما للضوء للخميرة13.

4. إعداد قارئ الصفائح الدقيقة

  1. قم بتكوين قارئ الصفائح الدقيقة لقياس الكمية المطلوبة من الاهتمام قبل إجراء التجارب.
    ملاحظة: في هذا المثال ، تم تكوين قارئ الصفائح الدقيقة لقياس التألق من مراسل يعبر عنه إجهاد الاهتمام. يمكن استخدام مخرجات أخرى ، مثل التلألؤ أو الكثافة الضوئية ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية.
  2. قم بزراعة سلالة الاهتمام (جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم غير فلوري) في الوسائط الاصطناعية الكاملة (SC)14 (أو وسائط مضان منخفضة أخرى) (انظر جدول المواد) إلى أعلى كثافة خلية ليتم قياسها. انقل الثقافات إلى لوحة ميكروويل ذات قاع زجاجي أسود الجدران (انظر جدول المواد) وقم بقياسها لتحديد إعدادات قارئ الصفائح الدقيقة المثلى.
    ملاحظة: تأكد من قراءات دقيقة عن طريق إدخال أبعاد اللوحة بشكل صحيح وقياس اللوحة من الأسفل.
  3. الرجوع إلى قاعدة بيانات البروتين الفلوري (على سبيل المثال ، fpbase.org) للحصول على أطياف الامتصاص والانبعاث التقريبية للبروتين الفلوريالمستهدف 15.
  4. حدد قيمة z (المسافة بين اللوحة والقارئ) عن طريق إجراء مسح z على الآبار التي تحتوي على سلالات الفلورسنت وغير الفلورسنت. حدد قيمة z التي تنتج أعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء.
  5. تحسين أطياف الامتصاص والانبعاث عن طريق إجراء عمليات مسح الامتصاص والانبعاث على سلالات الفلورسنت وغير الفلورسنت لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى.
  6. قم بقياس إجهاد الفلورسنت مع ضبط الكسب على المستوى الأمثل ، وتحديد أعلى كسب بصري يمكن استخدامه دون التسبب في خطأ في قياس الفائض.
    ملاحظة: يجب ضبط هذا الكسب البصري يدويا بشكل متسق عبر التجارب التي تتضمن نفس الإجهاد لضمان اتساق النتائج.
  7. قم بإعداد برنامج نصي للقياس (راجع الشكل 2) في برنامج قارئ الألواح الدقيقة. يقوم هذا البرنامج النصي بتكوين الأداة لقياس الكثافة الضوئية للمزارع والأطياف الفلورية لأي بروتينات فلورية ليتم قياسها.
    ملاحظة: قم بقياس الكثافة البصرية للسلالات عند 600 نانومتر ما لم تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء. بالنسبة للسلالات التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 700 نانومتر لتجنب التحيز16.
  8. اضبط البرنامج النصي للقياس للحفاظ على درجة حرارة حضانة داخلية تبلغ 30 درجة مئوية أثناء القياسات.
  9. قم بتكوين البرنامج النصي للقياس لتصدير البيانات إلى جدول بيانات أو ملفات ASCII ، وفقا للتفضيل.

5. برمجة الروبوت

  1. قم بتكوين تعريف طاولة العمل في برنامج محطة العمل الآلي بناء على التخطيط المادي للناقلات (على سبيل المثال ، هزازات السخان ، ومنصات العش ، وأجهزة الإضاءة) وأدوات المختبر (أي لوحة 96 بئرا) (انظر جدول المواد). قم بإنشاء برنامج نصي في برنامج محطة عمل الأتمتة لتنفيذ تحريض الضوء والقياسات (الشكل 3) ، باتباع الخطوات التالية.
  2. قم بتعطيل أي مصادر إضاءة داخلية لمنع تنشيط الخلفية للأنظمة البصرية الوراثية.
  3. اضبط شاكر السخان للحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية. عندما لا تكون اللوحة على شاكر السخان ، ستكون في درجة الحرارة المحيطة (22 درجة مئوية).
  4. استخدم الحلقات والمؤقت ومتغير عد الحلقة لتكرار خطوات تحفيز الخلايا وقياسها على فترات منتظمة.
  5. قبل تسجيل القياسات ، هز لوحة العينة لضمان التعليق المناسب لجميع الخلايا. اهتزاز 60 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة مع مدار 2 مم يكفي بشكل عام لإعادة تعليق خلايا S288C S. cerevisiae وتجنب تحيز القياس.
  6. انقل لوحة العينة إلى قارئ الصفيحة الدقيقة باستخدام ذراع الروبوت وقم بإزالة الغطاء (إن أمكن) لمنع التحيز في قياس الكثافة البصرية. سيقوم برنامج التحكم تلقائيا بإزالة الغطاء واستبداله إلى الموضع المحدد إذا تم ضبط تعريف حامل قارئ الصفيحة الدقيقة على عدم السماح بالغطاء.
  7. قم بتنفيذ البرنامج النصي لقياس قارئ الصفائح الدقيقة كما هو موضح في الخطوة 4.
  8. استبدل الغطاء الموجود على لوحة العينة وانقل اللوحة إلى جهاز الإضاءة باستخدام ذراع الروبوت.
  9. اضبط البرنامج النصي على الانتظار حتى يصل المؤقت إلى الفاصل الزمني المحدد (على سبيل المثال ، 30 دقيقة مضروبة في متغير عد الحلقة) ثم كرر الحلقة بأكملها للعدد المطلوب من التكرارات (على سبيل المثال ، 48 مرة لتجربة 24 ساعة).
  10. استكشاف الأخطاء المحتملة وإصلاحها وضمان الأداء السليم لتعريفات الناقل والأدوات المعملية ، بالإضافة إلى قدرة RGA على التقاط اللوحة ووضعها بدقة عن طريق تشغيل لوحة فارغة عبر حلقة البرنامج النصي عدة مرات.
  11. قم بتكوين تنبيهات المستخدم لإعلام المستخدم بأي تغييرات أو أخطاء في حالة الأداة قد تحدث أثناء تنفيذ البروتوكول.

6. إعداد لوحة العينة

  1. تنمو سلالات الخميرة على ألواح الوسائط الغنية ، مثل YPD agar17 (انظر جدول المواد). قم بتضمين عنصر تحكم غير فلوري (سلبي).
  2. حدد المستعمرات من الألواح وقم بتلقيحها في 3 مل من وسائط SC14 (أو وسائط مضان منخفضة أخرى ، مثل LFM18) في أنابيب الثقافة الزجاجية. احتضان الثقافات طوال الليل عند 30 درجة مئوية على أسطوانة دوارة مع إبقائها في الظلام أو في ظل ظروف الإضاءة غير المستجيبة (على سبيل المثال ، الضوء الأحمر للأنظمة المستجيبة للضوء الأزرق).
  3. قم بقياس الكثافة البصرية للمزارع الليلية عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من كل مزرعة إلى 1 مل من وسائط SC وتسجيل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو قارئ الصفيحة الدقيقة.
  4. تمييع كل ثقافة بين عشية وضحاها إلىOD 600 من 0.1 في أنابيب الثقافة الزجاجية. لاختبار إجهاد الإنتاجية الأعلى ، قم بإجراء التخفيفات الآلية في ألواح microwell.
  5. ماصة الثقافات المخففة في لوحة 96 بئرا. قم بتضمين الآبار الثلاثية لكل حالة (أي ثلاثة آبار متطابقة بنفس السلالة وحالة الضوء) لمراعاة التباين الفني. قم بتضمين الآبار ذات الوسائط الفارغة والخلايا غير الفلورية كعناصر تحكم سلبية لقياس مضان الخلفية والكثافة البصرية.
  6. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 5 ساعات قبل البدء في تجربة الحث الضوئي. اضبط كميات التخفيف وأوقات الحضانة حسب الضرورة لتحسين سلالات وظروف تجريبية محددة.

7. إجراء التجربة

  1. ضع لوحة العينة على شاكر السخان وابدأ البرنامج النصي للأتمتة كما هو موضح في الخطوة 5.
  2. ابدأ برنامج تحفيز الضوء كما هو موضح في الخطوة 3 بمجرد تسجيل القياس الأولي على قارئ اللوحة.
  3. إذا لم تكن محطة عمل الأتمتة في غرفة مظلمة ، فقم بتغطيتها بستارة معتمة لتجنب إضاءة الخلفية.

8. تحليل البيانات

  1. قم بإنشاء خريطة جدول بيانات للتجربة ، تعكس تخطيط 8 × 12 للوحة 96 بئرا. تأكد من أن الخريطة تتضمن أسماء السلالات التي يتم قياسها في شبكة واحدة وأوصاف ظروف الإضاءة المستخدمة في شبكة أخرى.
  2. استخدم برنامج Python النصي أو لغة برمجة مفضلة أخرى لتحليل البيانات المصدرة. قم باستيراد جدول بيانات الخريطة إلى صفيف ، مع ربط أسماء السلالات وأسماء الشروط بكل بئر من اللوحة.
    ملاحظة: يمكن العثور على نموذج التعليمات البرمجية للتحليل على: https://github.com/mccleanlab/Lustro. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تطبيق لتحليل البيانات من قارئات اللوحات المختلفة19.
  3. اقرأ البيانات من جدول بيانات التجربة المصدر إلى صفيف آخر.
  4. قم بإنشاء مخططات لقيم الكثافة الضوئية وقيم التألق لكل سلالة وحالة بمرور الوقت ، كما هو موضح في الشكل 4.
  5. فحص مخططات الكثافة الضوئية لتحديد مراحل النمو الأسي أو التشبع في الثقافات. ستساعد هذه المعلومات في اختيار النقاط الزمنية المناسبة لمقارنة قياسات التألق بين السلالات أو الظروف ، كما هو موضح في الشكل 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 4 أ قيم التألق بمرور الوقت لسلالة بصرية وراثية تعبر عن مراسل فلوري يتحكم فيه عامل نسخ انقسام مستحث للضوء. تنعكس ظروف الإضاءة المختلفة المستخدمة في التجربة من خلال الاختلافات في دورة العمل ، والتي تمثل النسبة المئوية للوقت الذي يكون فيه الضوء مضاء. لوحظ أن مستوى التألق الكلي يتناسب مع دورة عمل التحفيز الضوئي. يعرض الشكل 4B قيم OD700 المقابلة لنفس التجربة. يشير اتساق قراءات الكثافة الضوئية عبر ظروف الإضاءة المختلفة إلى أن التقنية التجريبية لا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل بروتوكول Lustro المعروض هنا على أتمتة عمليات الزراعة والإضاءة والقياس ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصرياتالوراثية 6. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج جهاز الإضاءة وقارئ الألواح الدقيقة وجهاز الاهتزاز في محطة عمل الأتمتة. يوضح هذا البروتوكول على وجه التحديد فائدة Lustro لفحص تركيبات البصريات الجينية المختلفة المدمجة في الخميرة S. cerevisiae ومقارنة برامج الحث الضوئي.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تم التأكيد عليها في هذا البروتوكول ضرورية لل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM128873 ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية 2045493 (منحت ل M.N.M.). ميغان نيكول ماكلين ، دكتوراه حاصلة على جائزة مهنية في الواجهة العلمية من صندوق بوروز ويلكوم. تم دعم ZPH من خلال منحة تدريب NHGRI لبرنامج التدريب على علوم الجينوم 5T32HG002760. نحن نقدر المناقشات المثمرة مع أعضاء مختبر ماكلين ، وعلى وجه الخصوص ، نحن ممتنون لكيران سويني لتقديم تعليقات على المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
لوحة سفلية زجاجية 96 جيدا مع  # 1.5 غطاء زجاجيCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (شاكر سخان) محطةعمل QINSTRUMENTS
Fluent AutomationTecan
LITOS (جهاز إضاءة بديل)Hohener, et al. التقارير العلمية. 2022
optoPlate-96 (جهاز إضاءة)Bugaj، et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper ArmTecan
Spark (قارئ لوحة)Tecan
Synthetic Complete mediaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (تطبيق تنبيه المستخدم)Tecan
yMM1734 (BY4741 Mat & alpha ؛ ura3 & Delta ؛ 0::5 'تماثل Ura3 ، pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1 ، pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1 ، pGAL1-mScarlet-I-tENO1 ، Ura3 ، Ura 3 'homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5 'تماثل Ura3 ، pRPL18B-Gal4DBD-CRY2 (535) -tENO1 ، pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1 ، pGAL1-mScarlet-I-tENO1 ، Ura3 ، Ura 3 'homology  ؛ his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5 'تماثل Ura3 ، pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1 ، pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1 ، pGAL1-mScarlet-I-tENO1 ، Ura3 ، Ura 3 'تماثل   ؛ his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80 :: KANMX gal4 :: spHIS5)Harmer ، et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  3. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
  4. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  5. Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
  6. Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
  7. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  8. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  9. Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139(2022).
  10. Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  11. Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
  12. Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
  13. Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
  14. Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
  17. YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
  18. Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
  19. Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
  20. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363(2016).
  21. Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808(2022).
  22. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  23. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  24. Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363(2022).
  25. Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
  26. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
  27. Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
  28. Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268(2023).
  29. Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic SystemsHigh Throughput ScreeningLaboratory AutomationLight StimulationYeast OptogeneticsSaccharomyces CerevisiaePlate ReaderRobotic AutomationGene Expression ControlFluorescence Measurement

Related Articles