يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد عضويات الكلى في تعليق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

3.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65698

⸱

سبتمبر 1, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Zhejiang University School of Medicine, 3Hubei Normal University, 4National Clinical Research Center of Kidney Diseases, Jinling Hospital, Nanjing University School of Medicine, 5Clinical Laboratory, The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, National Clinical Research Center for Child Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول طريقة شاملة وفعالة لإنتاج عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام ظروف ثقافة التعليق. يكمن التركيز الأساسي لهذه الدراسة في تحديد كثافة الخلايا الأولية وتركيز ناهض WNT ، مما يفيد الباحثين المهتمين بأبحاث الكلى العضوية.

الملخص

يمكن توليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من خلال طرق مختلفة. هذه المواد العضوية تحمل وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والتطبيقات العلاجية المحتملة. تقدم هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإنشاء عضويات الكلى من iPSCs ، بدءا من الخط البدائي الخلفي (PS) إلى الأديم المتوسط المتوسط المتوسط (IM). يعتمد النهج على وسيط APEL 2 ، وهو وسيط محدد خال من المكونات الحيوانية. يتم استكماله بتركيز عال من ناهض WNT (CHIR99021) لمدة 4 أيام ، يليه عامل نمو الخلايا الليفية 9 (FGF9) / الهيبارين وتركيز منخفض من CHIR99021 لمدة 3 أيام إضافية. خلال هذه العملية ، يتم التركيز على اختيار كثافة الخلايا المثلى وتركيز CHIR99021 في بداية iPSCs ، حيث أن هذه العوامل ضرورية لتوليد عضوي الكلى بنجاح. أحد الجوانب المهمة لهذا البروتوكول هو ثقافة التعليق في لوحة منخفضة الالتصاق ، مما يسمح لل IM بالتطور تدريجيا إلى هياكل نيفرون ، تشمل الهياكل الكبيبية والأنبوبية القريبة والأنبوبية البعيدة ، وكلها مقدمة بتنسيق مفهوم بصريا. بشكل عام ، يقدم هذا البروتوكول التفصيلي تقنية فعالة ومحددة لإنتاج عضويات الكلى من iPSCs المتنوعة ، مما يضمن نتائج ناجحة ومتسقة.

المقدمة

تلعب الكلية دورا مهما في الحفاظ على التوازن الفسيولوجي ، اعتمادا على وحدتها الوظيفية. يمكن للنيفرون ، الذي يفرز الفضلات ، تنظيم تكوين سوائل الجسم. مرض الكلى المزمن (CKD) ، الناجم عن طفرات وراثية أو عوامل أخرى عالية الخطورة ، سيتقدم في النهاية إلى المرحلة النهائية من مرض الكلى (ESKD) 1,2. يبدو أن ESKD يرجع إلى قدرة التجديد المحدودة للنيفرون. وبالتالي ، مطلوب العلاج ببدائل الكلى. يتيح التمايز الموجه ل iPSCs البشرية الجيل في المختبر من عضويات الكلى ثلاثية الأبعاد الخاصة بالمريض ، والتي يمكن استخدامها لدراسة نمو الكلى ، ونمذجة الأمراض الخاصة بالمريض ، وإجراء فحص الأدوية السامة للكلية 3,4.

أثناء التطور الجنيني ، تنشأ الكلى من الأديم المتوسط المتوسط (IM) ، والذي يختلف عن الخط البدائي (PS). قد يؤدي مسار إشارات WNT الكلاسيكي إلى تمايز إضافي للمراسلة الفورية بمشاركة منسقة من FGF (FGF9 ، FGF20) و BMP (إشارات Bmp7 من خلال JNK) 5،6،7. أنها تنتج مجموعتين مهمتين من الخلايا السلفية الكلوية (NPC): برعم الحالب (UB) ، واللحمة المتوسطة metanephric (MM) ، وتشكيل القنوات الجامعة والنيفرون ،على التوالي 8,9. يتكون كل نفرون من شرائح كبيبية وأنبوبية ، مثل الأنابيب القريبة والبعيدة ، وحلقة Henle10,11. وفقا للنظرية المذكورة أعلاه ، تحاكي البروتوكولات المنشورة حاليا شلالات الإشارة وتحفيز عامل النمو للحث على عضويات الكلى 5,12.

على مدى السنوات العديدة الماضية ، تم تطوير العديد من البروتوكولات للتمييز بين iPSCs البشرية إلى عضويات الكلى5،6،7،12. قام Takasato et al.7 بتحسين مدة علاج CHIR (ناهض WNT) قبل استبداله ب FGF9. وفقا لبروتوكولهم ، فإن التعرض ل CHIR لمدة 4 أيام ، متبوعا ب FGF9 لمدة 3 أيام ، هو الطريقة الأكثر فعالية للحث على المراسلة الفورية من iPSCs. تم استخدام مرشحات Transwell كشكل للثقافة في إجراءاتهم. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة صعبة للمبتدئين. لذلك ، حاول Kumar et al.13 تغيير تنسيق الثقافة واختار تعليق الثقافة. قاموا بفصل الخلايا الملتصقة في اليوم 7 للبذر في صفائح منخفضة الالتصاق لمساعدتها على التجمع في أجسام جنينية (EBs) تحتوي على هياكل تشبه النيفرون. ومع ذلك ، كان تأثير الدفعة لهذه الطرق واضحا ، خاصة في iPSCs المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، ذكرت الأدبيات المختلفة أن تركيز CHIR يتراوح من 7 ميكرومتر إلى 12 ميكرومتر5،13،14.

لقد تكهننا بأن تركيز كثافة الخلايا و CHIR قد يؤثران على توليد المواد العضوية في iPSCs المختلفة ، وقد تم التحقق من ذلك عدة مرات في تجاربنا. وقد عدل البروتوكول الحالي قليلا طريقة دراسة كومار وآخرون.13 وزود المستخدمين بإجراء تدريجي. يظهر الجدول الزمني والتخطيطي للنهج في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري. تم الحفاظ على الخلايا بوسط mTeSR على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). يحتوي الجدول 1 على جميع التراكيب المتوسطة المستخدمة في الدراسة.

1. طلاء iPSCs للتمايز وإحداث خط بدائي خلفي (PS)

  1. اغسل iPSCs على لوحة 6 آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء مع 2 مل DPBS. نضح DPBS باستخدام ماصة.
  2. أضف 1 مل من محلول فصل الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) لفصل iPSCs واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. أضف 1 مل من mTeSR إلى iPSCs ، وتأكد من رفع الخلايا عن السطح البلاستيكي.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أعد تعليق حبيبات الخلية واحسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
  5. قم بزرع مجموعة من كثافات الخلايا على صفيحة 24 بئرا أو 6 آبار مطلية بمصفوفة غشائية وثقافة مع mTeSR مكمل بمثبط كيناز Rho 10 μM (Y-27632) (انظر جدول المواد). استزرعهم طوال الليل في حاضنة CO2 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحث على PS ، يختلف التركيز الأمثل ل CHIR99021 وكثافات الخلايا المناسبة من خطوط iPSC المختلفة. قم بزرع مجموعة من الكثافات (على سبيل المثال ، 0.6 ، 0.9 ، 1.2 ، 1.5 ، 1.8 ، 2.4 * 103 خلايا مفردة لكل سنتيمتر مربع) ومجموعة من تركيز CHIR99021 من 7 ميكرومتر إلى 12 ميكرومتر. ابدأ في تمايز كل كثافة وكل CHIR في نفس اليوم. أوجد التركيز الأمثل CHIR99021 وكثافات الخلايا المناسبة في صفيحة 24 بئرا ثم قم بتوسيع الثقافة في ألواح 6 آبار. هنا نقدم بروتوكولا يعتمد على لوحة 6 آبار.
  6. في اليوم التالي ، استنشاق mTeSR وغسل الخلايا مع 2 مل من DPBS.
  7. أضف 2 مل من وسط المرحلة الأولى (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 8-12 ميكرومتر CHIR99021) (الجدول 1) ، يشار إليه باليوم 0.
  8. قم بزراعتها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام ، وقم بتحديث المرحلة الأولى المتوسطة كل يومين.

2. تحفيز الأديم المتوسط المتوسط كلوي المنشأ (IM)

  1. في اليوم 4 ، قم بإزالة المرحلة المتوسطة واغسلها ب 2 مل من DPBS.
  2. أضف 2 مل من وسط المرحلة الثانية إلى الخلايا (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 200 نانوغرام / مل FGF9 ، 1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر CHIR99021) (الجدول 1).
  3. قم بزراعتها في حاضنة 37 درجة مئوية ، وقم بتحديث الوسيط كل يومين حتى اليوم 7.

3. توليد عضويات الكلى في ثقافة التعليق

ملاحظة: خلال فترة المراقبة من اليوم 0 إلى اليوم 7 ، تكون حالة الخلايا حرجة. إذا أظهرت الخلايا توسعا ناجحا وتراكمت دون حطام خلوي كبير ، فهذا يدل على الاشتقاق الناجح للأديم المتوسط الوسيط (IM) ، مما يشير إلى الاستعداد للمضي قدما إلى المرحلة التالية. ومع ذلك ، إذا أظهرت الخلايا علامات موت الخلايا المبرمج الأولي ، متبوعا بالنخر أو الكسر ، فقد يكون ذلك مؤشرا على تركيزات غير مناسبة من CHIR99021 أو كثافات الخلايا.

  1. في اليوم 7 ، قم بإزالة وسط المرحلة الثانية واغسل الخلايا ب 2 مل من DPBS.
  2. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى تنكسر الخلايا تحت تباين الطور.
  3. ماصة 1 مل من المرحلة الثانية المتوسطة إلى الخلايا ، اخلطها وتأكد من رفع الخلايا عن السطح.
  4. اجمع تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط المرحلة الثالثة (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 200 نانوغرام / مل FGF9 ، 1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 1 ميكرومتر CHIR99021 في 0.1٪ ميثيل سلولوز (MC) ، 0.1٪ كحول بولي فينيل (PVA)) مكمل بمثبط كيناز Rho 10 ميكرومتر (Y-27632) (انظر جدول المواد). امزجه بلطف.
  6. امزج معلق الخلية والبذور في صفيحة منخفضة الالتصاق ذات 6 آبار بنسبة 1: 3. ضع اللوحة على شاكر مداري (مقاومة CO 2 ، تدور عند 60 دورة في الدقيقة) في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة مثبط Rho kinase (Y-27632) وإضافة وسائط المرحلة الثالثة (مكمل متوسط تمايز الخلايا الجذعية مع 200 نانوغرام / مل FGF9 ، 1 ميكروغرام / مل هيبارين ، 1 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.1٪ MC ، 0.1٪ PVA). ثقافة لمدة 2 أيام. قم بتغيير الوسيط في ثقافة التعليق باتباع الخطوات التالية:
    1. قطع طرف ماصة 1 مل مع مقص معقمة.
    2. هز برفق لوحة 6 آبار لترتيب المواد العضوية في منتصف اللوحة.
    3. نضح المواد العضوية مع الماصات المعدة في أنبوب 15 مل واتركها تقف لمدة 5 دقائق.
    4. نضح الطافد واترك المواد العضوية في أسفل الأنبوب.
    5. أضف الوسط الطازج لإعادة تعليق المواد العضوية وإعادة الطلاء مرة أخرى إلى لوحة منخفضة الالتصاق ذات 6 آبار.
  8. استمر في هز لوحة الالتصاق المنخفضة عند 60 دورة في الدقيقة في الحاضنة. قم بتغيير المرحلة الثالثة المتوسطة كل يومين حتى اليوم 12.
  9. في اليوم 12 ، قم بتغيير الوسيط إلى وسط المرحلة الرابعة (وسط تمايز الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 0.1٪ MC و 0.1٪ PVA).
  10. قم بتغيير الوسيط كل يومين حتى اليوم 25. يمكن أن تتطور الكائنات العضوية تدريجيا إلى هياكل نيفرون ناضجة من اليوم 12-25.

4. تلطيخ المناعي لعضويات الكلى

  1. اجمع عضويات الكلى في أنبوب سعة 15 مل واغسلها ب 2 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. بعد السماح لها بالتثبيت لمدة 5-10 دقائق ، ثبت عضويات الكلى في 2٪ PFA طازجة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإزالة PFA واغسل المواد العضوية ب 1 مل PBS تحتوي على 0.3٪ Triton X-100 (0.3٪ PBST) ، رجها بالتساوي على شاكر (بسرعة دوران لا تتجاوز 60 دورة في الدقيقة) لمدة 8 دقائق ، واتركها تقف لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. كرر ثلاث مرات.
    ملاحظة: يمكن تخزين المواد العضوية في 0.3٪ PBST عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أسابيع.
  4. احتضان المواد العضوية الثابتة مع مصل الحمير 10٪ في PBST (حاجز الحظر) (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية (المدرجة في جدول المواد) في مخزن مؤقت مانع بنسبة 1: 300.
  6. احتضان الكائنات العضوية بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الإثارة.
    ملاحظة: تأكد من أن الكبيبات والأنابيب يمكن تلطيخها في وقت واحد على عضوي واحد.
  7. اغسل المواد العضوية ب 1 مل 0.3٪ PBST ، وقم برجها بالتساوي على شاكر (بسرعة دوران لا تتجاوز 60 دورة في الدقيقة) لمدة 8 دقائق ، واتركها لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. كرر ثلاث مرات.
  8. احتضان الكائنات العضوية بالأجسام المضادة الثانوية (المدرجة في جدول المواد) و DAPI طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الإثارة. ثم كرر الخطوة 4.7.
    ملاحظة: يتم تخفيف كل من الجسم المضاد الثانوي و DAPI في محلول مانع ، والجسم المضاد الثانوي (1: 400) و DAPI (1: 1000).
  9. بعد التلوين ، قم بتجفيف المواد العضوية بالميثانول (25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما) ، ثم تخللها كحول البنزيل وبنزوات البنزيل (BABB ، نسبة 1: 2) (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق.
  10. قم بتحريك المواد العضوية التي تم تطهيرها على طبق ذو قاع زجاجي (انظر جدول المواد) وافحصها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
    ملاحظة: عند التصوير ، اختر طبق بتري في أسفل الطبق الزجاجي ، وعند التخلل ، ضع BABB مباشرة في طبق بتري للحفاظ على رطوبة قاع الطبق.

5. في المختبر مقايسة امتصاص ديكستران

  1. في اليوم 25 ، احتضان الكائنات العضوية ب 100 ميكروغرام / مل من ديكستران المسمى بالتألق (انظر جدول المواد) لمدة 4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. بعد 4 ساعات ، قم بالتبديل إلى وسيط جديد والتقط صورا لزراعة الخلايا الحية باستخدام مجهر مضان واسع المجال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تحقيق إنتاج IM عن طريق تنشيط إشارات WNT المتعارف عليها باستخدام مثبط GSK3 CHIR99021 ، يليه FGF9 / الهيبارين. من اليوم 0 إلى اليوم 4 ، تتوسع iPSCs بسرعة وتتخذ أشكالا معينية أو مثلثة. يصل التقاء 90٪ -100٪ ويتراكم بالتساوي حتى اليوم 7. عند ثقافة التعليق ، تشكل الركام تلقائيا هياكل النيفرون بعد الانفصال في اليوم 7. تعرض عضويات الكلى التي تم إنشاؤها من خلال ثقافة التعليق هياكل تشبه الأنبوب ويمكن ملاحظتها بسهولة في صور المجال الساطع بعد 18 يوما من التجميع (الشكل 2 والشكل 3...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم وصف بروتوكول مفصل لتوليد عضويات الكلى من iPSCs ، بما في ذلك تعديلات طفيفة على الوسط القاعدي ، وكثافة الخلية الأولية ، وتركيز CHIR99021. في تجارب مختلفة ، تم العثور على العوامل الحاسمة لتوليد عضوي ناجح في الكلى لتكون التمايز الأولي للأديم المتوسط المتوسط (IM) وحالة الخلية في اليوم 7. علاوة على ذلك ، أظهرت خطوط iPSC المختلفة اختلافات في تكاثر الخلايا وإمكانية التمايز ، مما أدى إلى اختلاف كثافة الخلايا المثلى وتركيزات CHIR990215،13،14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، للمناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نشكر المركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى Lidan Hu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (المنح رقم. BK20210150 إلى جانج وانغ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 لوحة ثقافة خلية الآبار ، مسطحةNESTCat # 701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat # 07920
الأجسام
كحول البنزيلسيجما ألدريتشكات # 100-51-6
بنزوات البنزيلسيجما-ألدريتشالقط # 120-51-4
خزانة السلامة البيولوجيةهايركات #HR40  figure-materials-1  A2
البيوتين المضاد للإنسان LTL (1: 300)مختبرات النواقلاتCat #B-1325
خلايا الدم أحادية النواة hiPS-B1 (iPSC ، أنثى)N / Aشاكر
مستوى ثاني أكسيد الكربونHAMANYCat #C0-06UC6
المواد الكيميائية والببتيدات والبروتينات
CHIR99021 (منشط مسار Wnt)STEMCELL تقنياتCat # 72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture PlateCorningCat # 3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCorningCat # 3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat # 07930
DAPI Stain SolutionCoolaberCat #SL7102
Dextran ، Alexa Fluor 647Thermo SCIENTIFICCat #D22914
DMEM / F-12 الخالي من الهبثاتالبكتيرية #G4610
الحمار المضاد للأغنام IgG H& L (Alexa Fluor 647)AbcamCat #ab150179
Donkey Serum stosteMeilunbioCat #MB4516-1
D-PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر)Solarbio Life ScienceCat #D1040
حاضنة الحمام الجافشنغهاي JingxinCat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032620
النماذج التجريبية: خطوطالخلايا
Forma Steri-Cycle CO2< / sub> حاضنةThermo SCIENTIFICCat # 370
Geltre LDEV-FreeGibcoCat #A1413202
Glass Bottom Culture DishesNESTCat # 801002
Goat anti-human CUBN (1: 300)Santa Cruz BiotechnologyCat #sc-20607
Heparin Solution (مكمل لزراعة الخلايا)STEMCELL TechnologiesCat # 07980
FGF-9 STEMCELL Technologies البشرية المؤتلفةCat # 78161
المجهر المقلوبأوليمبوسالقط #CKX53
مجهر متحد البؤر بالمسح الضوئي بالليزرأوليمبوسالقط #FV3000
ميثيل السليلوزسيجما ألدريتشالقط #M7027
الطردالمركزي الصغيرHENGNUOCat # 2-4B
ماوس مضاد للإنسان CD31 (1:300)BD BiosciencesCat # 555444
ماوس مضاد للإنسان ECAD (1:300)BD BiosciencesCat # 610182
ماوس مضاد للإنسان Integrin beta 1 (1:300)AbcamCat #ab30394
Mouse Anti-Human MEIS 1/2/3 (1:300)Thermo SCIENTIFICCat # 39795
Mowiol 4-88 ( بولي فينيل كحول 4-88)Sigma-AldrichCat # 81381
mTeSR1 5X مكملSTEMCELL TechnologiesCat # 85852
mTeSR1 Basal MediumSTEMCELL TechnologiesCat # 85851
Nunc CryoTube VialsThermo SCIENTIFICCat # 377267
أخرى
أرنب مضاد للإنسان GATA3 (1:300)تقنية إشارات الخليةCat #5852S
Rabbit مضاد للإنسان LRP2 (1:300)Sapphire BioscienceCat #NBP2-39033
Rabbit Anti-Human Synaptopodin (1:300)AbcamCat #ab224491
Rabbit Anti-Human WT1 (1:300)AbcamCat #ab89901
Rabbit Anti-Mouse PDGFR (1:300)AbcamCat #ab32570
ألبومين مصل بشري مؤتلف (rHSA)YEASENCat #20901ES03
Sheep مضاد للإنسان NPHS1 (1: 300)R & D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL TechnologiesCat # 05275
Streptavidin Cy3 (1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene (1X)GibcoCat # 15040066
Y-27632 (ثنائي هيدروكلوريد) STEMCELLTechnologiesCat # 72304
القاع المضادةالمؤتلفة

المراجع

  1. Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
  2. Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).
  3. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  4. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
  5. Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  6. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).
  7. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  8. Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
  9. SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
  10. Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
  11. Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
  12. Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
  13. Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361(2019).
  14. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

WNT CHIR99021 9
توليد عضويات الكلى في تعليق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.