هنا ، نصف العزلة والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر ، مما يسمح بدراسة وظيفة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية وعلاقتها بالخلايا الوعائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والثقافة والحث الأديبوجيني للخلايا Preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) هي مستودع للأنسجة الدهنية يحيط بالأوعية الدموية ويعرض الأنماط الظاهرية للخلايا الشحمية البيضاء والبيج والبني. ألقت الاكتشافات الحديثة الضوء على الدور المركزي ل PVAT في تنظيم التوازن الوعائي والمشاركة في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. إن الفهم الشامل لخصائص PVAT وتنظيمها له أهمية كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية. تعتبر الثقافات الأولية للخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر ذات قيمة لدراسة وظيفة PVAT والحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية المحيطة بالأبهر والخلايا الوعائية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا اقتصاديا ومجديا للعزل والثقافة والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من جزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية حول الأبهر للفأر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لنمذجة تكوين الدهون أو تكوين الدهون في المختبر. يحدد البروتوكول معالجة الأنسجة وتمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية حول الأبهر من الفئران الصغيرة. سيوفر هذا البروتوكول حجر الزاوية التكنولوجي في جانب مقاعد البدلاء للتحقيق في وظيفة PVAT.
المقدمة
يعتقد أن الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية (PVAT) ، وهي بنية حول الأوعية تتكون من خليط من الخلايا الشحمية الناضجة وجزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، تتفاعل مع جدار الوعاء المجاور عبر إفرازهابشكل شبه مكراني 1. كمنظم حاسم للتوازن الوعائي ، فإن خلل PVAT متورط في التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية2،3،4. يتكون SVF لأنسجة الخلايا الشحمية من العديد من مجموعات الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا البطانية والخلايا المناعية وخلايا الظهارة المتوسطة والخلايا العصبية والخلايا الجذعية الدهنية والخلايا السلفية (ASPCs)5,6
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مستشفى شنغهاي للصدر التابع لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم الموافقة: KS23010) وكانت متوافقة مع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. يفضل ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 4-8 أسابيع لهذه التجربة.
1. إعداد الأدوات الجراحية ، والمخازن المؤقتة ، ووسائط الثقافة
- أدوات الأوتوكلاف الجراحية (مثل المقص الجراحي والملقط القياسي) عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تطهير الأدوات المجهرية مع الكحول 75 ٪.
- تحضير محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل ب 1٪ v / v بنسلين-ستربتومايسين و 10 مل أخرى من PBS مكملة ب 10٪....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول الموصوف أعلاه ، قمنا بعزل PVATs بعناية حول الأبهر الصدري للفأر (الشكل 1A-D). بعد غسل وفرم PVATs إلى قطع صغيرة باستخدام مقص معقم (الشكل 1E ، F) ، تم هضم شظايا الأنسجة في محلول هضم يحتوي على كولاجيناز من النوع الأول (1 مجم / مل) و dispase II (4 مجم / مل) وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية على شاكر لمدة 30-45 دقيقة (الشكل 1G). تم تصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقترح نهجا عمليا وممكنا للعزل والحث الشحمي للخلايا preadipocytes المشتقة من SVF من الأنسجة الدهنية حول الأبهر الفأر. مزايا هذا البروتوكول هي أنه بسيط واقتصادي. تعد الأعداد الكافية من الفئران ضرورية للعزل الناجح ، حيث يمكن أن تؤدي الأنسجة غير الكافية إلى انخفاض كثافة SVF وضعف حالة النمو ، مما يؤثر في النهاية على كفاءة الليبوجين. بالإضافة إلى ذلك ، يعد عمر الفأر عاملا مهما يجب مراعاته حيث تتناقص إمكانات SVF الشحمية مع تقدم العمر. يعد الفصل السريع والدقيق ل PVAT مع تقليل تلوث الأوعية الدموية أمرا بالغ الأهمية. يعد محلول اله.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح ، مالية أو غير ذلك ، للإعلان عنها.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82130012 و 81830010) ومشاريع التنشئة للبحوث الأساسية لمستشفى شنغهاي للصدر (رقم المنحة: 2022YNJCQ03).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.2 & مرشحات المحقنة م | PALL | 4612 | |
| لوحة 12 بئر | Labselect | 11210 | |
| أنبوب طرد مركزي 15 مل | Labserv | 310109003 | |
| 3،3 '، 5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 نانومتر |
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي | Labselect | CT-002-50A | |
| المضاد للأديبونكتين | Abcam | ab22554 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| المضاد ل COX IV | CST | 4850 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| المضاد ل FABP4 | CST | 2120 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| المضاد ل PGC1 & alpha ؛ | Abcam | ab191838 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| المضاد ل PPAR & gamma ؛ | Invitrogen | MA5-14889 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| المضاد ل UCP1 | Abcam | ab10983 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| المضاد لألفا ؛ الأكتينين | CST | 6487 | 1: 1،000 تركيز العمل |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1٪ |
| C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارها بين 4-8 أسابيع من كلا الجنسين مركز | شنغهاي النموذجي للكائنات الحية ، Inc. | ||
| مصفاة الخلية 70 & م ، نايلون | فالكون | 352350 | |
| كولاجين من جلد العجل | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| كولاجيناز ، النوع 1 | ورثينجتون | LS004196 | 1 مجم / مل |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D1756 | 1 & مو ؛ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 مجم / مل |
| مصل بقري الجنين | Gibco | 16000-044 | 10٪ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| ارتفاع الجلوكوز DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX & nbsp ؛ | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| حاضنة مع شاكر مداري | شنغهاي longyue Instrument Eruipment Co.، Ltd. | LYZ-103B | |
| الأنسولين (الماشية) | سيجما ألدريتش | 11070-73-8 | 1 & M |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| حل Krebs-Ringer | Pricella | PB180347 | الحماية من الضوء |
| ملقط الجراحة المجهرية | Beyotime | FS233 | |
| مقص الجراحة المجهرية | Beyotime | FS217 | |
| زيت أحمر O & nbsp ؛ | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) | Sangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L) Jackson | ImmunoResearch ؛ | 115-035-146 | 1: 5,000 تركيز العمل |
| بيروكسيداز أفينيالماعز النقي المضاد للأرانب IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch ؛ | 111-035-144 | 1: 5,000 تركيز العمل |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 & mu ؛ ملقط |
| M قياسي | Beyotime | FS225 | |
| مقص جراحي | Beyotime | FS001 |
المراجع
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
