مقالة منهجية

الحقن المجهري للفيروس القهقري RCAS (A) المؤتلف في عدسة الدجاج الجنينية

2.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65727

⸱

سبتمبر 1, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

في هذه المقالة

ملخص

تصف ورقة البروتوكول هذه منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية لفيروس RCAS (A) كأداة لدراسة الوظيفة في الموقع والتعبير عن البروتينات أثناء نمو العدسة.

الملخص

الدجاج الجنيني (Gallus domesticus) هو نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء ، نظرا لدرجة تشابهها العالية مع العدسة البشرية. RCAS (A) هو فيروس ارتجاعي دجاج مؤهل للتكاثر يصيب الخلايا المنقسمة ، والذي يعمل كأداة قوية لدراسة التعبير في الموقع ووظيفة البروتينات البرية والطافرة أثناء تطوير العدسة عن طريق الحقن المجهري في التجويف الفارغ لحويصلة العدسة في مراحل النمو المبكرة ، مما يقصر عمله على خلايا العدسة المتكاثرة المحيطة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، مثل النماذج المعدلة وراثيا والثقافات خارج الجسم الحي ، فإن استخدام الفيروس القهقري للطيور RCAS (A) المختص بالتكرار يوفر نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الصيصان. على وجه التحديد ، يمكن أن يقتصر نقل الجينات المستهدف على خلايا ألياف العدسة التكاثرية دون الحاجة إلى محفزات خاصة بالأنسجة. في هذه المقالة ، سنلقي نظرة عامة موجزة على الخطوات اللازمة لإعداد RCAS (A) للفيروس القهقري المؤتلف ، ونقدم نظرة عامة مفصلة وشاملة على إجراء الحقن المجهري ، ونقدم نتائج عينة من التقنية.

المقدمة

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية ل RCAS (A) (ساركوما الطيور / الفيروس القهقري A المختص بالتكرار). لقد ثبت أن التوصيل الفعال للفيروسات القهقرية في عدسة الدجاج الجنينية أداة واعدة للدراسة في الجسم الحي للآلية الجزيئية ووظيفة بنية بروتينات العدسة في فسيولوجيا العدسة الطبيعية والحالات المرضية والتطور. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج التجريبي لتحديد الأهداف العلاجية وفحص الأدوية لحالات مثل إعتام عدسة العين الخلقي البشري. إجمالا ، يهدف هذا البروتوكول إلى وضع الخطوات اللازمة لتطوير منصة قابلة للتخصيص لدراسة بروتينات العدسة.

الكتاكيت الجنينية (Gallus domesticus) ، بسبب تشابهها في بنية العدسة ووظيفتها مع العدسة البشرية ، هي نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء1،2،3،4. يعتبر استخدام الفيروس القهقري للطيور RCAS (A) المختص بالتكرار نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الصيصان. والجدير بالذكر أن لديها قدرة فريدة على حصر نقل الجينات المستهدفة في خلايا ألياف العدسة التكاثرية دون الحاجة إلى محفزات خاصة بالأنسجة ، باستخدام الإطار الزمني الفريد للتطور الجنيني الذي يسمح فيه وجود تجويف العدسة الفارغ بالحقن المجهري RCAS (A) في الموقع المقيد للتعبير عن البروتينات الخارجية داخل خلايا ألياف العدسة التكاثرية5 ، 6,7,8.

يعتمد إجراء الحقن المجهري لجنين الفرخ ، الموصوف بعمق هنا ، جزئيا في الأصل على عمل Fekete et. al.6 وتطويرها كذلك من قبل جيانغ وآخرون. AL.8 وقد تم استخدامه كوسيلة لإدخال كل من البلازميدات الفيروسية وغير الفيروسية في عدسة الكتاكيت الجنينية1،9،10،11،12،13. بشكل عام ، يوضح العمل السابق إمكانية استخدام هذه المنهجية لدراسة تطور العدسة ، والتمايز ، والاتصال الخلوي ، وتطور المرض ، واكتشاف واختبار الأهداف العلاجية للحالات المرضية للعدسة مثل إعتام عدسة العين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان واللوائح التنفيذية لرعاية الحيوان وفقا لمبادئ دليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو. للحصول على نظرة عامة على البروتوكول ، انظر الشكل 1 ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

figure-protocol-1
الشكل 1: مخطط تجريبي. 1 . تتمثل الخطوة الأولى للبروتوكول في تحديد بروتين (بروتينات) مستهدف محدد ، وتحديد تسلسل (تسلسلات) الجينات المرتبطة ، وتوليد شظايا الحمض النووي. 2 . استنساخ تسلسل (تسلسلات) الجينات في ناقل فيروسي رجعي عن طريق الاستنساخ الأولي إلى ناقل محول ، 3. يليه ناقل فيروسي . 4 . تحضير جزيئات فيروسية عالية العيار باستخدام خلايا التعبئة والتغليف للحصاد والتركيز. 5 . الخطوة الأخيرة ، ومحور هذا البروتوكول ، هي الحقن المجهري لعدسة الدجاج للجزيئات الفيروسية RCAS (A) في تجويف العدسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تحضير الفيروسات القهقرية المؤتلفة عالية العيار

  1. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لصنع شظايا الحمض النووي للبروتين المستهدف
    ملاحظة: يهدف هذا القسم إلى تضخيم تسلسل الحمض النووي المقابل لبروتين العدسة المستهدف. لمزيد من التفاصيل، انظر 7,8.
    1. تصميم الاشعال ل PCR ، المقابلة للبروتين محل الاهتمام ، لجعل شظايا الحمض النووي مع كربوكسيل تيرميني في الإطار مع أو بدون تسلسل FLAG epitope (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3') ، وكودون توقف ، وموقع إنزيم تقييد (أي EcoRI) موجود داخل منطقة polylinker من CLa12NCO)) وفقا للمواصفات المذكورة في البروتوكولات المنشورة سابقا ، مع تسلسل لإنزيمات التقييد الكافية1 ، 7،8،10،11.
    2. أداء تفاعل PCR10. اجمع بين 100 pmol من الحس ومضاد الإحساس للبادئات المصممة مع 0.5 ميكروغرام من connexin cDNA (مثل Cx50 أو Cx43 أو مجموعات Cx50 * 43L الوهمية) ، إلى المخزن المؤقت لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المفضل. قم بإجراء 30 دورة تتكون كل منها من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 58 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، متبوعة بتمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    3. عزل وتنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية الهلام.
    4. هضم منتجات PCR المنقاة باستخدام إنزيمات التقييد المفضلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. استنساخ إدراج الحمض النووي في محول البلازميد
    ملاحظة: إدخال شظايا الحمض النووي في ناقل محول يلغي الحاجة إلى الخلايا / الفيروسات المساعدة لزيادة استقرار ناقل RCAS (A)14. لمزيد من التفاصيل، انظر 7,8.
    1. شظايا الحمض النووي المستنسخة في محول البلازميد ، Cla12NCO باستخدام تفاعل ربط النهاية اللزجة. امزج شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل مع إنزيمات القطع و Cla12NCO بنسبة 2-5: 1. إجراء الربط وتحويل الحمض النووي باستخدام الخلايا المختصة.
    2. عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي.
    3. تسلسل الحمض النووي لضمان الدقة.
  3. الاستنساخ في الناقل الفيروسي RCAS (A)
    ملاحظة: يتم إدخال شظايا الحمض النووي في مركبة (RCAS (A) retrovirus) من أجل النقل المستقر للجين إلى الخلايا في جنين الفرخالنامي 14,15. لمزيد من التفاصيل ، انظر7،8،15.
    1. هضم جزء Cla12NCO-DNA من المتجه المحتوي على الفائدة باستخدام ClaI (وحدة واحدة لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي) وعزل الأجزاء الهلامية.
    2. قم باستنساخ شظايا الحمض النووي إلى بلازميد RCAS (A) خطي ClaI. استخدم إنزيم القطع SalI لتمييز موقع ClaI على بلازميد RCAS (A).
    3. تأكيد الاتجاه الصحيح للشظايا المدرجة على التركيبات عن طريق الهضم باستخدام إنزيمات تقييد ClaI و SalI.
    4. عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي.
    5. تحديد تركيز الحمض النووي (DNA).
  4. نقل خلايا الخلايا الليفية الجنينية للكتاكيت (CEF) وحصاد RCAS (A)
    ملاحظة: تستخدم خلايا تغليف الفيروسات ، CEFs ، للحصول على / حصاد وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على جزيئات فيروسية15,16. لمزيد من التفاصيل ، انظر7،8،15.
    1. نقل خلايا CEF مع تركيبات الحمض النووي الفيروسي القهقري المؤتلف باستخدام عامل النقل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. أداء النشاف الغربي للخلايا المنقولة لفحص تعبيرها عن البروتين محل الاهتمام.
    3. عندما تصل الخلايا المنقولة إلى نقطة التقاء ، ابدأ في جمع الوسط الطافي ، ومعالجته / ترشيحه بشكل مناسب (لإزالة أي حطام خلوي باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر) ، وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتركيز.
  5. تركيز ومعايرة المخزونات الفيروسية
    ملاحظة: يجب تصفية الحبيبات والكميات الكبيرة من الوسائط المشتقة من الخلايا التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء فحص عيار فيروسي لتحديد قوة الفيروس ضد الخلايا المضيفة. لمزيد من التفاصيل ، انظر6،7،8،15.
    1. قم بإذابة وسائط الثقافة التي تحتوي على الفيروسات.
    2. قم بتدوير وسائط الاستزراع عند 72000 × جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات الفيروسية بالوسط المتبقي (~ 50 ميكرولتر) وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام ، في ~ 10 ميكرولتر من المخزون الفيروسي.
    4. للمعايرة ، باستخدام خلايا QT-6 أو CEF ، قم بنقل الخلايا بتخفيف تسلسلي للمخزون الفيروسي.
    5. بعد التقاء ، إصلاح الخلايا باستخدام 4 ٪ الفورمالديهايد.
    6. Immunostain لبروتينات هفوة الفيروسية أو عملية الفوسفاتيز القلوي نسيجيكيميائيا للحصول على عيار ، يعرف بأنه (وحدات تشكيل مستعمرة) CFU لكل مليلتر (CFU / mL).

figure-protocol-2
الشكل 2: الأدوات والإعداد للحقن المجهري لعدسة الفرخ . (أ) مجتذب ماصة ميكروماصة عمودية عمودية P-30. (1) ملحق داخلي يظهر ماصة زجاجية يتم سحبها. ب: (2) حاضنة البيض. احتضان بيضة الدجاج لمدة ~ 65-68 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية للوصول إلى المرحلة 18 (مع تجويف مركزي مغلق وفارغ) لحقن الفيروس القهقري. (ج) إعداد الحقن المجهري. (3) معدات الإضاءة ، (4) Pico-Injector ، (5) مجهر تشريح ، (6) Drummond micromanipulator ، (7) كمبيوتر / كاميرا للتصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الحقن المجهري لعدسة الفرخ

  1. إعداد اللوازم
    1. تحضير الماصات الزجاجية الدقيقة للحقن المجهري17
      ملاحظة: تستخدم الشعيرات الدموية الزجاجية لصنع ماصات زجاجية دقيقة بنقطة طرف وقطر خارجي (OD) ~ 11 ميكرومتر للحقن المجهري. يظهر الإعداد في الشكل 2 أ.
      1. قم بتوصيل الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات بالمشابك المبطنة بالمطاط في مجتذب الماصة العمودي اليدوي.
      2. اضبط درجة حرارة الحرارة (HEAT 1) على 950 درجة مئوية وقم بإجراء السحب المسبق للحصول على شعيرات زجاجية أرق وأكثر نعومة.
      3. اضبط درجة حرارة الحرارة (HEAT 2) على 790 درجة مئوية وقم بإجراء سحب ثانوي لإنتاج ماصات دقيقة نهائية.
      4. باستخدام مطحنة micropipette ، شحذ فتحة الطرف إلى OD ~ 11 ميكرومتر.
      5. للتجارب المستقبلية ، احتفظ بالماصات الزجاجية الدقيقة في وسادة تثبيت إسفنجية داخل وعاء زجاجي.
    2. حضانة البويضات المخصبة حتى مرحلة التطوير 18
      ملاحظة: أثناء تطوير العدسة ، عند ~ 65-68 ساعة من التطور الجنيني ، تنفصل العدسة عن الأديم الظاهر وتشكل حويصلة محكمة الغلق ذات تجويف مركزي ؛ الحقن في هذا التجويف العدسة الفارغ يستعد للتعبير المقيد لخلايا العدسة التكاثرية7،8،18.
      1. احتضان بيض الدجاج المخصب لمدة ~ 65-68 ساعة في حاضنة هزازة مرطبة 37 درجة مئوية (الشكل 2 ب).
  2. فتح بيضة الدجاج
    ملاحظة: تصف هذه الخطوة تحديد الجنين وتعرضه للحقن المجهري. لمزيد من التفاصيل، انظر 7,8.
    1. امسح منطقة العمل جيدا باستخدام 70٪ إيثانول.
    2. أخرج البيض من الحاضنة ، ورشه بشدة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واتركه يجف في الهواء.
    3. ضع البيضة ، بحيث يكون الطرف الأكبر من البيضة متجها لأعلى ، على حامل البيض.
    4. باستخدام زوج من الملقط ذو الأسنان الحادة ، قم بإنتاج ثقب قطره ~ 2 سم على الطرف الأكبر من البيضة عن طريق النقر بعناية على قشر البيض وإزالة شظايا قشر البيض (الشكل 3 أ).
    5. باستخدام مجهر تشريح ، حدد موقع الجنين.
    6. بمجرد تحديد موقع الجنين وعدسة الفرخ ، استخدم مجهر التشريح والملقط والمقص الدقيق لقطع الغشاء الأمنيوسي الذي يغطي الجزء العلوي من الجنين على الفور (الشكل 3 ب).
      ملاحظة: لا تقطع على نطاق واسع (يكفي فقط لفضح الجنين ~ 0.5 سم × 0.5 سم) ، وإلا فقد تغرق الأجنة في كتلة صفار البيض ؛ تجنب أيضا لمس الأوعية الدموية ، إن أمكن.
    7. غطي فتحة البيضة بطبق بتري 60 مم استعدادا للخطوات التالية.
  3. الحقن المجهري للمخزون الفيروسي المركز
    ملاحظة: يتم إدخال الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على شظايا الحمض النووي للبروتين المستهدف للتنبيغ في الخلايا داخل تجويف العدسة. يظهر الإعداد في الشكل 2C. لمزيد من التفاصيل ، انظر6،7،8.
    1. ذوبان مخزون الأسهم الفيروسية على الجليد.
    2. لتصور المخزون الفيروسي أثناء الحقن ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 10x أخضر سريع في قنينة واحدة من المخزون الفيروسي تحتوي على 10 ميكرولتر.
    3. لضمان عدم وجود قطع كبيرة من المواد غير المذابة التي يمكن أن تسد الماصة الزجاجية الدقيقة ، قم بطرد المحاليل لمدة 10 ثوان عند 10000 × جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات "قطع كبيرة" ونقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة ، كل ذلك مع الحفاظ على المحاليل على الجليد.
    4. على طبق استزراع 35 مم × 10 مم ، ضع بارافيلم مختبري ممتد وأضف 1 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم (PBS) أعلى الفيلم (غير معقم ، مع اعتبار الجانب المغطى "نظيفا").
    5. قم بتوصيل ماصة زجاجية معدة بحاقن بيكو أوتوماتيكي.
    6. اضغط على وضع التعبئة لملء المحلول الملحي المعقم (PBS) في ماصة زجاجية دقيقة ، ثم استخدم وضع الحقن لاختبار 1 ميكرولتر المخصصة من السائل.
    7. ضع بارافيلم مختبري ممتد ثان على سطح طبق زراعة خلايا جديد مقاس 35 مم × 10 مم وأضف 1 ميكرولتر من المخزون الفيروسي سريع اللون باللون الأخضر فوق الفيلم.
    8. اخفض طرف الماصة الدقيقة في المخزون الفيروسي واضغط على نموذج التعبئة لملء الماصة الزجاجية الدقيقة ب ~ 1 ميكرولتر من المخزون الفيروسي.
      ملاحظة: لتجنب الجفاف ، ضع طرف الماصة المملوءة في محلول ملحي معقم (PBS) كلما كان هناك توقف مؤقت في الإجراء.
    9. قم بخفض الماصة الزجاجية المملوءة ، المتصلة بحاقن أوتوماتيكي ، في المنطقة المستهدفة من تجويف عدسة الجنين بمساعدة مجهر تشريح.
    10. اضبط مصدر الضوء لضمان رؤية واضحة لمخطط حويصلة العدسة.
      ملاحظة: عادة ما يستخدم تجويف العدسة اليمنى (متجها لأعلى) للحقن ويتم الحفاظ على اليسار (متجها لأسفل) سليما كعنصر تحكم مقابل.
    11. بمجرد التأكد من أن موضع الماصة الدقيقة يقع في الموقع الصحيح داخل تجويف العدسة ، قم بحقن 5-40 nL من المخزون الفيروسي (الشكل 3C).
      ملاحظة: الممارسة ضرورية جدا لوضع الحقن الأمثل.
    12. انتظر ~ 45 ثانية ثم قم بإزالة الماصة الزجاجية برفق.
    13. تحقق من نجاح الحقن المجهري في تجويف العدسة باستخدام مجهر التشريح من خلال فحص صبغة Fast Green التي يجب أن تبقى في التجويف الفارغ للعدسة دون أي تسرب.
    14. بعد إجراء الحقن ، أغلق فتحة قشر البيض بشريط سكوتش.
    15. أعد الجنين إلى الحاضنة المرطبة 37 درجة مئوية ، دون أي حركة دوارة ، حتى يتم الوصول إلى العمر الجنيني المطلوب لتشريح العدسة.

figure-protocol-3
الشكل 3: إعداد كتكوت الحقن الدقيق والتخطيطي. أ: فتح بيضة دجاج. ب: قطع الغشاء السلوي. (ج) الحقن المجهري لعدسة الدجاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد تحديد بروتين (بروتينات) مستهدف محدد وتحديد تسلسل (تسلسلات) الجينات المرتبطة به ، يتضمن النهج التجريبي الشامل استنساخ تسلسل (تسلسلات) الجينات في ناقل RCAS (A) للفيروسات القهقرية عن طريق الاستنساخ الأولي إلى ناقل محول ، يليه ناقل فيروسي. ثانيا ، يتم تحضير الجسيمات الفيروسية عالية العيار باستخدام خلايا التعبئة لحصاد وتركيز الفيروسات. تم وصف هاتين الخطوتين الرئيسيتين الأوليين إلى حد كبير وعرض النتائج التمثيلية في مكان آخر6،7،8،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا النموذج التجريبي الفرصة للتعبير عن البروتين (البروتينات) ذات الأهمية في العدسة السليمة مما يؤدي إلى دراسة الأهمية الوظيفية لهذه البروتينات في بنية العدسة ووظيفتها. يعتمد نموذج الحقن المجهري للفرخ الجنيني جزئيا على عمل Fekete et. al.6 وتم تطويره بواسطة Jiang et. al.8 وقد تم استخدامه كوسيلة لإدخال كل من البلازميدات الفيروسية والعوامل مثل المنبهات والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) والببتيدات في عدسة الكتاكيت1،9

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH): RO1 EY012085 (إلى JXJ) و F32DK134051 (إلى F.M.A) ، ومنحة مؤسسة ويلش: AQ-1507 (إلى JXJ). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الأرقام جزئيا باستخدام Biorender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ م مرشحCorning431118لإزالة الحطام الخلوي من الوسائط
35 مم × 10 مم طبق ثقافةFisherScientific50-202-030للاستخدام أثناء الحقن
الدقيق جهاز الطرد المركزيFisherbrand13-100-676محلول الغزل
يconstructsGENEWIZ-لتوليد التركيبات تشريح
المجهرAmScopeSM-4TZ-144Aتصور العدسة
لبادئات الحمض النووي PCRالدقيق تقنيات الحمض النووي المتكاملة-توليد الاشعال:

حلقة داخل الخلايا (IL) - Cx50 المحذوف (المخلفات 1 & ndash; 97 و 149 & - - 400) بالإضافة إلى متجه Cla12NCO تم الحصول عليه باستخدام الزوج التالي من البادئات: الإحساس ، CTCCTGAGAACCTACATCCT. antisense ، CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs من Cx43 (المخلفات 98 & ndash ؛ 150) و Cx46 (المخلفات 98 &ndash ؛ 166) كانت  تم الحصول عليها بأزواج البادئات التالية: الإحساس ، TACGTGATGAGGAAAGAAGAGG ؛ antisense ، TCCTCCACGCATCTTTACCTTG. الإحساس ، CACATTGTACGCATGGAAGAG. ANTISENSE ، AGCACCTCCC في ACGGATTC ، على التوالي

تم الحصول على قالب بناء Cla12NCO-Cx43 باستخدام الزوج التالي من البادئات: SENSE ، CTGCTTCGTACTTACATCATC. antisense ، GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs من Cx50 (المخلفات 98 &ndash ؛ 148) أو Cx46 (المخلفات 98 – 166) باستخدام تركيبات Cla12NCO-Cx50 و Cla12NCO-Cx46 كقوالب مع زوج من الاشعال التالية: Sense ، CACCATGTCCGCATGGAGGAGA ؛ أنتيسنس ، GGTCCCC TC CAGGCGAAAC. الإحساس ، CACATTGTACGCATGGAAGAG. antisense ، AGCACCTCCCCATACGGATTC ، على التوالي
Drummond Nanoject II حاقن نانولترأوتوماتيكي Drummond Scientific3-000-204الحقن الدقيق ماصة
مزدوجة معقوفة أضواء مجهر مضيئةAmScopeLED-50WYللتصور
Dulbecco ' s النسر المتوسط المعدل (DMEM)Invitrogenلثقافة الخلايا
حاملالبيض -حلقات الستايروفوم محلية الصنع بقطر 2 بوصة وارتفاع نصف بوصة
حاضنة البيضGQF Manufacturing Company Inc.1502لحضانة البيض المخصب
Fast GreenFisher ScientificF99-10لتصور حقن المخزون الفيروسي
بيض الدجاج الأبيض المخصبTexas A & amp M UniversityN / Aنموذج المفضل للحقن المجهري (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) مصل
الأبقار الجنينية (FBS)مختبراتلزراعة الخلايا
مضاد للفأر المترافق بالفلورسين IgGJackson ImmunoResearch115-095-003لمكافحة FLAG   1: 500
ملقطFisherScientific22-327379لتحريك الأشياء و العزل
الشعيرات الدموية الزجاجيةSutter InstrumentsB100-75-10ماصة زجاجية دقيقة للحقن المجهري (OD 1.0 مم ، معرف 0.75 مم ، طول 10 سم)
LipofectamineInvitrogenL3000001للتعداء
مجتذب الماصات الدقيقة العمودي اليدويSutter InstrumentsP-30للحصول على ماصة زجاجية بالحجم الصحيح
أنابيبالطرد المركزي الدقيقFisherScientific02-682-004الذوبان
المجهرKeyenceBZ-X710لتصوير تلطيخ
ParafilmFisherScientific03-448-254وضع محلول
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogenلزراعة الخلايا
Pico-Injectorجهاز هارفاردPLI-100لتوصيل كميات سائلة صغيرة بدقة من خلال الماصات الدقيقة عن طريق تطبيق ضغط منظم لفترة زمنية محددة رقميا
للأرانب المضادة للكتكوت AQP0ذاتية الإنشاء-Jiang JX و White TW و Goodenough DA و Paul DL. الاستنساخ الجزيئي والتوصيف الوظيفي لألياف عدسة الكتاكيت connexin 45.6. خلية مول بيول. 1994 مارس. 5(3):363-73. دوي: 10.1091 / mbc.5.3.363.
الأرانب المضادة للجسم المضاد FLAGRockland Immunichemicals600-401-383لتلوين FLAG
الرودامين المترافق المضاد للأرانب IgG & nbsp ؛Jackson ImmunoResearch111-295-003لمكافحة AQP0   1: 500
وسادة تثبيت إسفنجيةأدوات SutterBX10لتخزين الماصة الدقيقة الزجاجية
للحقن Hyclone حل

المراجع

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325(2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501(2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RCAS

مقالات ذات صلة