Method Article

مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول ويقارن طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (MSCs). تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل وتشغيل أبسط وتمايز عظمي أسهل. تتميز طريقة الأجسام الجنينية (EBs) باستهلاك أقل للوقت.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات تستخدم على نطاق واسع في الطب التجديدي. نظرا لأن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية مقيدة بالتبرع المحدود واختلافات الجودة والسلامة البيولوجية ، فقد شهدت السنوات ال 10 الماضية ارتفاعا كبيرا في الجهود المبذولة لتوليد MSCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تركزت الجهود السابقة والحديثة في تمايز hiPSCs إلى MSCs حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافة أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول هاتين الطريقتين التمثيليتين في اشتقاق MSC من hiPSCs. تقدم كل طريقة مزاياها وعيوبها ، بما في ذلك الوقت والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا والتعبير عن علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر. يوضح هذا البروتوكول أن كلتا الطريقتين يمكن أن تشتق MSCs ناضجة ووظيفية من hiPSCs. تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل ، وتشغيل أبسط ، وتمايز عظمي أسهل ، بينما تتميز طريقة EB باستهلاك أقل للوقت.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات مشتقة من الأديم المتوسط1. MSCs موجودة في جميع الأنسجة الضامة تقريبا2. منذ اكتشاف MSCs لأول مرة في سبعينيات القرن العشرين وعزلها بنجاح من نخاع العظام في عام 1987 من قبل Friedenstein et al.3،4،5 ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة الجسدية البشرية (بما في ذلك الجنين والبالغين) لعزل MSCs مثل العظام والغضاريف والأوتار والعضلات والأنسجة الدهنية ، والسدى الداعم للدم1،2،6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صيانة hiPSCs

  1. ذوبان الجليد من hiPSC
    1. أخرج الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل خلايا الذوبان إلى أنبوب سعة 15 مل محضر ب 3 مل من وسط صيانة iPSC (جدول المواد). مزيج بلطف المتوسطة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من وسط صيانة iPSC باستخدام 10 ميكرومتر Y-27632 (ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 2-3 مرات).
    3. انقل معلق الخلايا إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والمغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) و 2 مل من وسط صيانة iPSC مع إضافة 10 مي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باتباع البروتوكول (الشكل 1 أ) ، تم تمييز hiPSCs إلى MSCs عبر تكوين EB وطرق الاستزراع أحادي الطبقة. أثناء التمايز ، أظهرت الخلايا مورفولوجيات تمثيلية مختلفة (الشكل 1B ، C).

كما هو موضح في الشكل 1B ، تعرض مستعمرات hiPSCs مورفولوجيا مضغوطة نموذجية قبل التمايز بحدود واضحة تتكون من خلايا معبأة بإحكام. تشكلت EBs كروية موحدة بعد انفصال hiPSCs واستزراعها لمدة 24 ساعة على شاكر. خلال اليوم 1 إلى ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، تم فحص طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs20،21،22،23،24،25،26،27،28،30. كانت كلتا الطريقتين قادرتين على اشتقاق MSCs من hiPSCs. تم تأكيد MSCs المشتقة من hiPS.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، على المناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نحن ممتنون للمركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى ليدان هو).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طقم تلطيخ أحمر أليزارينBeyotime  التكنولوجيا الحيويةC0148S
المضاد للإنسان CD105 (PE) Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend304011
Anti-human-CD73 (APC) Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend328108
حمض الأسكوربيكSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
شاكر مستوى ثاني أكسيد الكربونكريستالCO-06UC6
تعويض الخرزBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
ديكساميثازونBeyotime  التكنولوجيا الحيويةST1254
DMEM/F12  متوسطةServicebioG4610
مصل الأبقار الجنينيHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
الجيلاتينسيجما-ألدريتشG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
التحكم في النمط المتساوي البشري IgG1 APCBioLegend403505
التحكم في النمط المتشاوي البشري IgG1 FITCBioLegend403507
التحكم في النمط المتنظير البشري IgG1 PEBioLegend403503
الإنسان TGF- & بيتا ؛ 1Stemcell78067
Human TruStain FcX & nbsp ؛BioLegend422301
IBMXBeyotime  التكنولوجيا الحيويةST1398
الإندوميتاسينSolarbioSI9020
الأنسولينBeyotime  التكنولوجيا الحيويةP3376
iPSC الصيانة المتوسطةSTEMCELL Technology85850
ITS Media SupplementBeyotime  التكنولوجيا الحيويةC0341-10mL
Matrigel ، عامل النمو المخفضBD Corning354230
Oli Red O تلطيخ طقمBeyotime   ؛ التكنولوجيا الحيويةC0158S
ProlineSolarbioP0011
بيروفات الصوديومThermoFisher11360-070
TGF & beta ؛ 3NovoproteinCJ44
Toluidine Blue Plasticing KitSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme (1x)   ؛جيبكو12604013
ملحق منخفض للغاية 6 ألواح آباركوستار3471
فيرسنجيبكو15040-66
Y-27632خلية جذعية72304
& ألفا ؛ -MEMهيكلونSH30265
& بيتا ؛ -جليسيروفوسفاتسولاربيوG8100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

Related Articles