يصف هذا البروتوكول ويقارن طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (MSCs). تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل وتشغيل أبسط وتمايز عظمي أسهل. تتميز طريقة الأجسام الجنينية (EBs) باستهلاك أقل للوقت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات تستخدم على نطاق واسع في الطب التجديدي. نظرا لأن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية مقيدة بالتبرع المحدود واختلافات الجودة والسلامة البيولوجية ، فقد شهدت السنوات ال 10 الماضية ارتفاعا كبيرا في الجهود المبذولة لتوليد MSCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تركزت الجهود السابقة والحديثة في تمايز hiPSCs إلى MSCs حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافة أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول هاتين الطريقتين التمثيليتين في اشتقاق MSC من hiPSCs. تقدم كل طريقة مزاياها وعيوبها ، بما في ذلك الوقت والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا والتعبير عن علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر. يوضح هذا البروتوكول أن كلتا الطريقتين يمكن أن تشتق MSCs ناضجة ووظيفية من hiPSCs. تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل ، وتشغيل أبسط ، وتمايز عظمي أسهل ، بينما تتميز طريقة EB باستهلاك أقل للوقت.
المقدمة
الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات مشتقة من الأديم المتوسط1. MSCs موجودة في جميع الأنسجة الضامة تقريبا2. منذ اكتشاف MSCs لأول مرة في سبعينيات القرن العشرين وعزلها بنجاح من نخاع العظام في عام 1987 من قبل Friedenstein et al.3،4،5 ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة الجسدية البشرية (بما في ذلك الجنين والبالغين) لعزل MSCs مثل العظام والغضاريف والأوتار والعضلات والأنسجة الدهنية ، والسدى الداعم للدم1،2،6
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. صيانة hiPSCs
- ذوبان الجليد من hiPSC
- أخرج الخلايا من النيتروجين السائل وقم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل خلايا الذوبان إلى أنبوب سعة 15 مل محضر ب 3 مل من وسط صيانة iPSC (جدول المواد). مزيج بلطف المتوسطة.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من وسط صيانة iPSC باستخدام 10 ميكرومتر Y-27632 (ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل 2-3 مرات).
- انقل معلق الخلايا إلى صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار والمغلفة بهلام مصفوفة خارج الخلية مخفض عامل النمو (GFR) (1: 100) و 2 مل من وسط صيانة iPSC مع إضافة 10 مي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باتباع البروتوكول (الشكل 1 أ) ، تم تمييز hiPSCs إلى MSCs عبر تكوين EB وطرق الاستزراع أحادي الطبقة. أثناء التمايز ، أظهرت الخلايا مورفولوجيات تمثيلية مختلفة (الشكل 1B ، C).
كما هو موضح في الشكل 1B ، تعرض مستعمرات hiPSCs مورفولوجيا مضغوطة نموذجية قبل التمايز بحدود واضحة تتكون من خلايا معبأة بإحكام. تشكلت EBs كروية موحدة بعد انفصال hiPSCs واستزراعها لمدة 24 ساعة على شاكر. خلال اليوم 1 إلى ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، تم فحص طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs20،21،22،23،24،25،26،27،28،30. كانت كلتا الطريقتين قادرتين على اشتقاق MSCs من hiPSCs. تم تأكيد MSCs المشتقة من hiPS.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، على المناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نحن ممتنون للمركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى ليدان هو).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم تلطيخ أحمر أليزارين | Beyotime التكنولوجيا الحيوية | C0148S | |
| المضاد للإنسان CD105 (PE) Biolegend | 323206 | ||
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) Biolegend | 304011 | ||
| Anti-human-CD73 (APC) Biolegend | 344006 | ||
| Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend | 328108 | ||
| حمض الأسكوربيك | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| شاكر مستوى ثاني أكسيد الكربون | كريستال | CO-06UC6 | |
| تعويض الخرز | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| ديكساميثازون | Beyotime التكنولوجيا الحيوية | ST1254 | |
| DMEM/F12 متوسطة | Servicebio | G4610 | |
| مصل الأبقار الجنيني | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| الجيلاتين | سيجما-ألدريتش | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| التحكم في النمط المتساوي البشري IgG1 APC | BioLegend | 403505 | |
| التحكم في النمط المتشاوي البشري IgG1 FITC | BioLegend | 403507 | |
| التحكم في النمط المتنظير البشري IgG1 PE | BioLegend | 403503 | |
| الإنسان TGF- & بيتا ؛ 1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX & nbsp ؛ | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime التكنولوجيا الحيوية | ST1398 | |
| الإندوميتاسين | Solarbio | SI9020 | |
| الأنسولين | Beyotime التكنولوجيا الحيوية | P3376 | |
| iPSC الصيانة المتوسطة | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime التكنولوجيا الحيوية | C0341-10mL | |
| Matrigel ، عامل النمو المخفض | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O تلطيخ طقم | Beyotime ؛ التكنولوجيا الحيوية | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| بيروفات الصوديوم | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGF & beta ؛ 3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine Blue Plasticing Kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) ؛ | جيبكو | 12604013 | |
| ملحق منخفض للغاية 6 ألواح آبار | كوستار | 3471 | |
| فيرسن | جيبكو | 15040-66 | |
| Y-27632 | خلية جذعية | 72304 | |
| & ألفا ؛ -MEM | هيكلون | SH30265 | |
| & بيتا ؛ -جليسيروفوسفات | سولاربيو | G8100 |
المراجع
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
