تحديد وتشخيص وتصنيف أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا

Summary

لقد طورنا منهجية لتقييم ما إذا كانت أورام الجهاز العصبي في الفئران المعدلة وراثيا تلخص بدقة أمراض نظرائهم من البشر. هنا ، نطبق هذه التقنيات النسيجية ، والمعايير المرضية المحددة ، ومنهجيات الثقافة على الأورام الليفية العصبية وأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة الناشئة في نموذج الماوس P 0-GGFβ3.

Abstract

عادة ما يصاب المرضى الذين يعانون من متلازمة حساسية الورم الوراثي السائد من النوع 1 (NF1) بأورام ليفية عصبية ضفيرية الشكل (PNs) تتحول لاحقا إلى أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة شديدة العدوانية (MPNSTs). سيتم تسهيل فهم العملية التي يتحول بها PN إلى MPNST من خلال توفر نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) التي تكرر بدقة تقدم PN-MPNST الذي شوهد في البشر مع NF1. لسوء الحظ ، فإن نماذج GEM مع الاجتثاث Nf1 لا تلخص هذه العملية بالكامل. قادنا هذا إلى تطوير فئران P 0-GGFβ3 ، وهو نموذج GEM يؤدي فيه الإفراط في التعبير عن ميتوجين خلية شوان neuregulin-1 (NRG1) في خلايا Schwann إلى تطوير PNs التي تتطور لتصبح MPNSTs ذات تردد عال. ومع ذلك ، لتحديد ما إذا كان تكوين الورم وتطور الأورام في الفئران P 0-GGFβ3 نمذجة بدقة العمليات التي شوهدت في مرضى NF1 ، كان علينا أولا إثبات أن أمراض أورام غمد الأعصاب المحيطية P_0-GGFβ3 تلخص أمراض نظرائهم من البشر.

هنا ، نصف المنهجيات المتخصصة المستخدمة لتشخيص أورام الجهاز العصبي المحيطي وتصنيفها بدقة في نماذج GEM ، باستخدام P 0-GGFβ3 و P_0-GGFβ3 ؛ Trp53 ^+/- الفئران كمثال. نصف الطرق النسيجية والكيميائية المناعية والكيميائية النسيجية المستخدمة لتشخيص PNs و MPNSTs ، وكيفية التمييز بين هذه الأورام وأنواع الأورام الأخرى التي تحاكي أمراضها ، وكيفية تصنيف هذه الأورام. نناقش إنشاء ثقافات المرور المبكر من GEM MPNSTs ، وكيفية توصيف هذه الثقافات باستخدام الكيمياء الخلوية المناعية ، وكيفية التحقق من ورمها من خلال إنشاء الطعم الخيفي. بشكل جماعي ، تميز هذه التقنيات أمراض PNs و MPNSTs التي تنشأ في نماذج GEM وتقارن بشكل نقدي أمراض أورام الفئران هذه بنظيراتها البشرية.

Introduction

على مدى العقود الثلاثة الماضية ، حاولت العديد من المختبرات إنشاء نماذج فئران للسرطانات البشرية عن طريق إدخال طفرات مرتبطة بالسرطان البشري في جينوم الفئران أو عن طريق الإفراط في التعبير عن منتج جيني يتم التعبير عنه بشكل مفرط في السرطانات البشرية. يمكن استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) الناتجة لمجموعة متنوعة من الأغراض مثل إثبات أن التعديل الجينومي الذي تم إدخاله حديثا يبدأ تكوين الورم ، وتحديد التغيرات الجينية أو اللاجينية الأخرى التي تحدث لاحقا والتي تساهم في تطور الورم ، وتحديد مسارات الإشارات الرئيسية التي تدفع بدء الورم وتطوره. على عكس نماذج xenograft التقويمية ، التي تعتمد على استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فإن نماذج السرطان GEM لديها نظام مناعي يعمل بكامل طاقته وبالتالي أكثر دقة نموذج الاستجابات للعوامل العلاجية المرشحة. ومع ذلك ، عند استخدام نماذج السرطان GEM لأغراض مثل هذه ، من الضروري أن يؤكد الباحثون أن الملاحظات التي تم إجراؤها باستخدام أورام GEM ذات صلة بنظرائهم من البشر. يجب أن يتضمن هذا التحقق تقييما شاملا لأمراض أورام GEM وتحديد ما إذا كانت السمات المرضية لأورام GEM تلخص علم الأمراض لنوع الورم البشري المقابل.

متلازمة حساسية الورم الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) هو المرض الوراثي الأكثر شيوعا الذي يؤثر على الجهاز العصبي البشري ، ويحدث في حوالي 1 من كل 3000-3500 ولادة حية^1،2،3. يصاب الأفراد المصابون ب NF1 بأورام غمد عصبية محيطية حميدة متعددة تعرف باسم الأورام الليفية العصبية في جلدهم (الأورام الليفية العصبية الجلدية) وفي الأعصاب الكبيرة والضفائر العصبية (الأورام الليفية العصبية الضفيرية). في حين أن كل من الأورام الليفية العصبية الجلدية والضفيرية الشكل تزيد من سوء نوعية حياة المريض من خلال إنتاج ضعف جسدي وسلوكي و / أو اجتماعي ، فإن الأورام الليفية العصبية الضفيرية (PNs) خطيرة بشكل خاص ^4,5. وذلك لأن PNs تتحول في كثير من الأحيان إلى أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) ، وهي أورام خلايا المغزل العدوانية مع معدل بقاء منخفض بشكل استثنائي ^1,2. ويرجع هذا المعدل المنخفض للبقاء على قيد الحياة إلى حد كبير إلى أن أنظمة العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي المستخدمة حاليا لعلاج MPNSTs غير فعالة. ومع ذلك ، فإن تطوير علاجات جديدة أكثر فعالية كان يمثل تحديا. هذا لأنه ، على الرغم من مدى شيوع حدوث MPNSTs في مرضى NF1 ، إلا أنها لا تزال أوراما نادرة. نتيجة لذلك ، من الصعب جدا الحصول على أعداد كبيرة من الأورام البشرية للدراسة. من الصعب أيضا تجنيد عدد كاف من المرضى الذين يعانون من MPNSTs للتجارب السريرية. للتغلب على هذه القيود ، تم إنشاء العديد من نماذج GEM بهدف اكتساب مزيد من الأفكار حول التشوهات التي تؤدي إلى التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور PN-MPNST وتسهيل التجارب قبل السريرية مع العوامل العلاجية المرشحة.

مرضى NF1 لديهم طفرات معطلة في نسخة واحدة من جين NF1. يحدث التسبب في الورم العصبي الليفي عندما تحدث طفرة معطلة في جين NF1 الوظيفي المتبقي في خلية في سلالة خلية شوان. ومع ذلك ، من المثير للدهشة أنه عندما تم إنشاء الفئران مع طفرات Nf1 المعطلة للخط الجرثومي ، فإنها لم تصاب بأورام ليفية عصبية ^6,7. العرض اللاحق أن الفئران التي تحتوي على خلايا Nf1-null Schwann و Nf1 haploinsufficiency في جميع أنواع الخلايا الأخرى (Krox20-Cre;Nf1^{flox / -} الفئران) وضعت الأورام الليفية العصبية الضفيرية الشكل اقترح أن انخفاض جرعة الجين Nf1 في أنواع الخلايا الإضافية كان مطلوبا لتسبب الورم العصبي^{الليفي 8}. حتى ذلك الحين ، الأورام الليفية العصبية الضفيرية في Krox20-Cre ؛ لم تتقدم الفئران Nf1^{flox / -} لتصبح MPNSTs وبالتالي قلدت جزئيا فقط بيولوجيا نظيراتها البشرية. حدث التسبب في MPNST عندما تم مشاركة طفرات Nf1 مع طفرات في جينات مثبطة للورم إضافية مثل Trp53⁹ أو Cdkn2a¹⁰ ، ولكن MPNSTs في نماذج GEM هذه طورت من جديد أو من الأورام الليفية العصبية غير النمطية ذات الإمكانات البيولوجية غير المؤكدة (ANNUBPs) ^11،12 ، بدلا من الأورام الليفية العصبية الضفيرية الحميدة الموجودة مسبقا (انظر^13،14 للحصول على مراجعات ممتازة لهذه النماذج بالإضافة إلى نماذج أخرى تقدم طفرات إضافية مرتبطة بفقدان الوظيفة MPNST في الجينات مثل Suz12 و Pten¹⁵).

كانت نماذج الفئران هذه لا تقدر بثمن لتأسيس الدور الذي تلعبه الجينات مثل NF1 و TP53 و CDKN2A في التسبب في أورام الجهاز العصبي المحيطي المرتبطة ب NF1 وللتجارب قبل السريرية التي تختبر العوامل العلاجية المرشحة. ومع ذلك ، لا يزال لدينا فهم غير مكتمل للعملية التي تتطور بها الأورام الليفية العصبية الضفيرية لتصبح أوراما ليفية عصبية غير نمطية ذات إمكانات بيولوجية غير مؤكدة (ANNUBPs¹⁶) ثم MPNSTs. تم إحراز بعض التقدم مؤخرا في فهم هذه العملية مع التقرير الأخير الذي يفيد بأن الفئران التي تم حذفها في Nf1 و Arf تطور ANNUBPs التي تتقدم لتصبح MPNSTs¹¹. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران القائمة على طفرة Nf1 التي تلخص تماما عملية تطور الورم العصبي الليفي الضفيري-MPNST الذي شوهد في البشر غير موجودة بعد. بالإضافة إلى ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت هناك مسارات متميزة متعددة تؤدي إلى تطوير MPNSTs. بالنظر إلى ذلك ، من الممكن أن تكون GEMs الموصوفة أعلاه نموذجا فقط لمجموعة فرعية من عدة مسارات مختلفة تؤدي إلى تطور الورم العصبي الليفي-MPNST والتسبب في MPNST. يتم التأكيد على هذه النقطة من خلال حقيقة أن MPNSTs تحدث أيضا بشكل متقطع وأن بعض MPNSTs المتفرقة على ما يبدو لا تحتوي على طفرات NF1 ^17,18.

على الرغم من أن هذه النقطة الأخيرة قد تم تحديها من خلال اقتراح Magollon-Lorenz et al. الأخير بأن بعض MPNSTs المتفرقة التي تفتقر إلى طفرات NF1 على الأقل هي أورام ميلانينية أو نوع مختلف من الساركوما¹⁹ ، فقد أبلغنا مؤخرا عن MPNST متقطع وخط خلية مشتق من هذا الورم (خلايا 2XSB) التي كانت NF1 من النوع^{البري 20}. أثناء توصيف الورم الأم وخط الخلايا 2XSB ، استبعدنا بشكل منهجي إمكانيات التشخيص البديلة ، بما في ذلك سرطان الجلد وأنواع الساركوما المتعددة الأخرى التي يتم أخذها في الاعتبار بشكل روتيني في التشخيص التفريقي لورم غمد العصب المحيطي الخبيث^{المتقطع 20}. بالإضافة إلى ذلك ، نلاحظ أن Magollon-Lorenz et al. أقروا بأن النتائج التي توصلوا إليها في خطوط خلايا MPNST الثلاثة المتفرقة التي درسوها لا يمكن تعميمها للإشارة إلى أن جميع الأورام التي تم تحديدها على أنها MPNSTs متفرقة ليست MPNSTs.

لبناء نموذج GEM الذي لم يكن فيه الورم العصبي الليفي والتسبب في MPNST يعتمدان بالضرورة على طفرات جينية معينة مثبطة للورم ، قمنا بتوليد فئران معدلة وراثيا كان فيها التعبير المفرط عن ميتوجين خلية شوان القوي neuregulin-1 (NRG1) مدفوعا بمحفز بروتين المايلين الخاص بخلية شوان صفر (P₀) (الفئران_{P 0-GGFβ3})²¹. لقد أظهرنا سابقا أن الأورام الليفية العصبية البشرية ، MPNSTs ، وخطوط خلايا MPNST تعبر عن العديد من الأشكال المتماثلة NRG1 جنبا إلى جنب مع كينازات التيروزين مستقبلات erbB (erbB2 و erbB3 و erbB4) التي تتوسط إشارات NRG1 وأن مستقبلات erbB هذه يتم تنشيطها بشكل أساسي²². لقد أثبتنا أيضا أن المثبطات الدوائية لكينازات erbB تمنع بقوة انتشار MPNST²² والبقاء على قيد الحياة²³ والهجرة²⁴. تمشيا مع ملاحظاتنا في البشر ، P 0-GGFβ3 الفئران تطوير الأورام الليفية العصبية الضفيرية²⁵ التي تتقدم لتصبح MPNSTs في تردد عال ^21,25. لقد أظهرنا أن P 0-GGFβ3 MPNSTs ، مثل نظرائهم من البشر ، يطورون عادة طفرات في Trp53 و Cdkn2a ، بالإضافة إلى العديد من التشوهات الجينومية الأخرى التي من المحتمل أن تساهم في تكوين الورم²⁵. MPNSTs الناشئة في الفئران P 0-GGFβ3 ليس لديها طفرات Nf1 معطلة. ومع ذلك ، باستخدام المكمل الجيني ، أظهرنا أن NRG1 يعزز تكوين الورم في الفئران P 0-GGFβ3 في الغالب من خلال نفس شلالات الإشارات التي يتم تغييرها بواسطة فقدان Nf1 ²⁶ ؛ يستند هذا الاستنتاج إلى النتيجة التي توصلنا إليها بأن استبدال التعبير المفرط NRG1 بفقدان Nf1 في وجود عدم كفاية Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- الفئران) تنتج التي تتطور فيها MPNSTs من جديد ، كما هو موضح في cis-Nf1 ^+/-؛ Trp53 ^+/- الفئران²⁷.

للحصول على هذه المعلومات وغيرها من المعلومات التي تثبت أن الفئران P 0-GGFβ3 نمذجة دقيقة لعمليات التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور الورم العصبي الليفي-MPNST الذي شوهد في البشر المصابين ب NF1 ، قمنا بتطوير منهجيات متخصصة لمعالجة الأنسجة من هذه ، وتشخيص أورامها بدقة ، وتصنيف MPNSTs الناشئة في هذه الفئران ، وإنشاء وتوصيف المرور المبكر P_0-GGFβ3 و P_0-GGFβ3 ؛ Trp53 ^+/- مزارع MPNST ومقارنة نقدية لأمراض P 0-GGFβ3 PNs و MPNSTs و P_0-GGFβ3 ؛ Trp53 ^{+ / -} MPNSTs إلى نظرائهم من البشر. العديد من هذه المنهجيات قابلة للتعميم على نماذج GEM الأخرى لأورام الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من هذه المنهجيات قابلة للتطبيق على نطاق أوسع على نماذج GEM التي تنشأ فيها الأورام في مواقع الأعضاء الأخرى. وبالتالي ، نقدم هنا وصفا مفصلا لهذه المنهجيات.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل IACUC التابع لجامعة ساوث كارولينا الطبية وتم تنفيذها من قبل موظفين مدربين بشكل صحيح وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية في MUSC.

1. تحديد اختراق الورم والبقاء على قيد الحياة في الفئران P 0-GGFβ3 وتحديد الأورام في هذه لمزيد من التوصيف

1. توليد مجموعة من الفئران التي سيتم تقييمها لتكوين الأورام. يعتمد عدد الفئران المطلوبة على اختراق النمط الظاهري للورم. للتعويض عن مثل هذه الخسائر ، ابدأ بمجموعة أعلى بنسبة 10-15٪ من العدد النهائي المطلوب للحيوانات.
   ملاحظة: حددنا اختراق الورم في الفئران P 0-GGFβ3 تجريبيا في مجموعة أولية من 50 فأرا (ستة منها فقدت لأسباب لا علاقة لها بالأورام (مثل القتال))²⁵.
2. تقييم صحة ثلاث مرات أسبوعيا وتسجيل درجات حالة الجسم ، بما في ذلك الوزن والتغيرات السلوكية في كل فحص. إنهاء الفئران الحاملة للورم أو المحتضرة (انظر الملاحظة أدناه) باستخدام القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم. سجل العمر عند الوفاة بالأيام. إذا كانت الأورام مرئية خارجيا ، فقم بتسجيل أبعاد الورم (الطول والعرض والارتفاع).
   ملاحظة: من الضروري عدم السماح للحيوانات بالمضي قدما بعد الحد الأقصى المسموح به لحجم الورم و / أو نقطة النهاية الإنسانية المعتمدة من IACUC.
3. باستخدام العمر عند الوفاة ، قم بإنشاء منحنى بقاء كابلان ماير لتحديد متوسط العمر عند الوفاة ومدى البقاء على قيد الحياة.
   ملاحظة: كان متوسط عمر الفئران_P 0-GGFβ3 عند الوفاة 261.5 يوما ، مع نطاق يتراوح بين 74-533 يوما. كان 91٪ من مجموعتنا يعانون من أورام ليفية عصبية متعددة و 71٪ لديهم^{MPNSTs 21}.
4. حدد ما إذا كانت الأورام المرئية بشكل صارخ موجودة ، وإذا كانت موجودة ، فقم بتشريحها في ظل ظروف معقمة لتحديد ما إذا كان الورم مرتبطا بعصب محيطي ثم استئصال الورم. في P 0-GGFβ3 و P_0-GGFβ3 ؛ Trp53 ^+/- الفئران ، أورام غمد الأعصاب الطرفية هي الأكثر شيوعا في الأعصاب مثلث التوائم والوركي. حتى إذا لم يتم رؤية الأورام المرئية بشكل صارخ بالاقتران مع هذه الأعصاب ، فقم بإصلاح هذه الأعصاب وتضمينها كما هو موضح أدناه حتى يمكن فحصها بحثا عن وجود أورام دقيقة. تحدث الأورام الدقيقة عادة داخل العقد المرتبطة بهذه الأعصاب.
5. قطع الأورام المرئية بشكل صارخ إلى ثلاث قطع (الشكل 1 أ). استخدم القطعة 1 لعلم الأنسجة (أقسام البارافين والكيمياء الهيستولوجية المناعية والكيمياء النسيجية). استخدم القطعة 2 لإنشاء ثقافات المرور المبكر. قطعة التجميد المفاجئة 3 (باستخدام النيتروجين السائل) للتجارب المستقبلية المحتملة (على سبيل المثال ، البقع المناعية والحمض النووي الريبي وعزل الحمض النووي).
6. ثبت القطعة 1 في 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) طوال الليل عند 4 ^درجاتمئوية. ثبت ما تبقى من جسم عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

2. تضمين البارافين للأورام المرئية بشكل صارخ وإعداد أقسام ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين للتقييم التشخيصي الأولي

1. تضمين البارافين للأورام المرئية بشكل صارخ
   1. بعد تثبيت قطعة الورم 1 بين عشية وضحاها في 4 ٪ بارافورمالدهايد ، شطف الأنسجة عن طريق وضعها في حجم PBS الذي لا يقل عن 10x أكبر من حجم الأنسجة لمدة 15 دقيقة. استخدم نفس الحجم لجميع الشطف اللاحق. كرر شطفتين إضافيتين لمدة 15 دقيقة من برنامج تلفزيوني ، باستخدام حجم جديد من PBS لكل شطف.
   2. نقل قطعة الورم 1 إلى 70 ٪ من الإيثانول. امسك المنديل في 70٪ إيثانول لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. إذا رغبت في ذلك ، قم بتخزين الأنسجة على المدى الطويل في ظل هذه الظروف.
      ملاحظة: الخطوات من 2-1-1 إلى 2-1-7 مقدمة لفائدة المحققين الذين لا يستطيعون الوصول إلى آلة تجارية لمعالجة الأنسجة. إذا كان لدى الباحث إمكانية الوصول إلى معالج الأنسجة ، فستتم معالجة الأنسجة من خلال الإيثانول المتدرج والزيلين وفقا لبروتوكول الأداة المبرمجة.
   3. نقل قطعة الورم 1 إلى 80 ٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة لمدة 30 دقيقة إضافية في حجم جديد من الإيثانول بنسبة 80٪.
   4. نقل قطعة الورم 1 إلى 95 ٪ من الإيثانول لمدة 75 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة مرتين أخريين ، في كل مرة لمدة 75 دقيقة إضافية في حجم جديد من الإيثانول بنسبة 95٪.
   5. نقل قطعة الورم 1 إلى 100 ٪ من الإيثانول واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة لمدة 60 دقيقة مرتين أخريين ، في كل مرة باستخدام حجم جديد من الإيثانول بنسبة 100٪.
   6. نقل قطعة الورم 1 إلى مذيب قائم على الليمونين واحتضانها لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل قطعة الورم 1 إلى حجم جديد من المذيب القائم على الليمونين واحتضانها لمدة 30-60 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
   7. انقل قطعة الورم 1 إلى 1: 1 مذيب قائم على البارافين / د-الليمونين لمدة ساعة واحدة عند 60 ^درجةمئوية. تخلص من المذيب القائم على البارافين 1: 1 / د-الليمونين وانقل قطعة الورم من 1 إلى 60 ^درجةمئوية واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 60 ^درجةمئوية. كرر الحضانة في حجم جديد من 60 ^درجةمئوية من البارافين مرة أخرى لمدة 20 دقيقة. احتضان قطعة الورم 1 في البارافين بين عشية وضحاها في 60 ^{درجة مئوية}.
   8. صب طبقة أساسية من البارافين في قالب الأنسجة الصلب واتركها تصلب. انقل قطعة الورم 1 إلى سطح البارافين الأساسي وبعد وضعه مباشرة ، قم بتغطية الأنسجة ببارافين 60 ^درجةمئوية وضع كاسيت الأنسجة فوق البارافين المنصهر وملامسته له. انقل القالب إلى الجانب البارد من محطة التضمين واتركه يتجمد لمدة 10-15 دقيقة.
   9. قم بإزالة كتلة البارافين مع كاسيت الأنسجة المرفق من القالب. استخدم شريط الأنسجة المرفق لتثبيت الكتلة في الميكروتوم أثناء التقطيع.
      ملاحظة: يمكن الآن تخزين كتلة البارافين إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
2. تحضير أقسام الهيماتوكسيلين واليوزين الملطخة بالأورام المرئية بشكل صارخ.
   1. قطع 4-5 ميكرومتر أقسام من أنسجة الورم باستخدام ميكروتوم وتركيبها على شرائح زجاجية موجبة الشحنة.
   2. لأداء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E ، قم بإزالة البارافين من أقسام الأنسجة عن طريق احتضان الشرائح في مذيب قائم على د-ليمونين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة في حجم جديد من المذيب القائم على د-ليمونين لمدة 10 دقائق.
   3. انقل الشرائح إلى إيثانول 100٪ واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل الشرائح إلى حجم جديد من الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانها لمدة 5 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.
   4. انقل الشرائح إلى 95٪ إيثانول واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل الشرائح إلى حجم جديد من الإيثانول بنسبة 95٪ واحتضانها لمدة 5 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.
   5. انقل الشرائح إلى 70٪ إيثانول واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، نقل إلى 50 ٪ من الإيثانول واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. انقل الشرائح إلى الماء المقطر واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. تلطيخ الشرائح عن طريق غمرها في الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف بماء الصنبور الجاري لمدة 1-2 دقيقة. التفريق عن طريق غمس الشرائح 2-5x في 0.5 ٪ حمض الهيدروكلوريك في 70 ٪ من الإيثانول. شطف في حمام ماء الصنبور الجاري لمدة 1-2 دقيقة. ضع الشرائح في 95٪ إيثانول مع 0.5٪ حمض الخليك لمدة 10 ثوان.
   8. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام eosin-Y لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ثم انقل الشرائح إلى إيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق. امسح العينات في مذيب قائم على الليمونين لمدة 5 دقائق.
   9. قم بتركيب أغطية باستخدام وسيط تثبيت قائم على الزيلين بينما لا تزال الشريحة مبللة بالمذيب القائم على d-limonene. اسمح لوسيط التثبيت بالضبط طوال الليل.
      ملاحظة: لا تستخدم وسيط تركيب مائي.
3. تحضير الأنسجة دون أورام مرئية بشكل صارخ لتحديد الأورام الليفية العصبية الضفيرية و MPNSTs الدقيقة. قم بتضمين الأنسجة في البارافين ، وقم بإعداد الأقسام النسيجية ، وصمة عار هذه الأقسام بالهيماتوكسيلين ويوزين.
   1. قم بإزالة الأعضاء الداخلية وتضمين أجزاء تمثيلية من كل عضو في البارافين لإعداد أقسام ملطخة ب H&E سيتم فحصها بحثا عن أدلة مجهرية على وجود أورام (الشكل 1 ب). قم بإزالة الرأس والأطراف الأمامية والأطراف الخلفية والذيل (الشكل 1C). لفحص الحبل الشوكي وجذور الأعصاب في الموقع بحثا عن دليل على أورام جذر العصب ، قم بإزالة الكلس من العمود الفقري والأضلاع والأنسجة الرخوة المرتبطة به عن طريق الغمر في 0.3 M EDTA / 4٪ paraformaldehye (درجة الحموضة 8.0) لمدة 48-72 ساعة عند 4 ^درجةمئوية ؛ ثم ، شطف العينات مع 1x PBS. في نهاية إزالة الكلس ، تأكد من اكتمال إزالة الكلس عن طريق محاولة اختراق العمود الفقري بإبرة. تنجح إزالة الكلس إذا اخترقت الإبرة العظم بسهولة دون طحن.
   2. قطع العمود الفقري منزوع الكلس والهياكل المرتبطة به إلى كتل تتناسب مع كاسيت الأنسجة. قم بالجفاف من خلال الإيثانول المتدرج متبوعا بمذيب قائم على d-limonene كما هو موضح في الخطوات 2.1.2-2.1.7. قم بتضمين البارافين وإعداد أقسام 4-5 ميكرومتر كما هو موضح في الخطوات 2.1.7-2.2.1. إجراء بقع H&E كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.9 ؛ اسمح لوسيط التثبيت بالضبط طوال الليل.

3. تحديد الأورام الليفية العصبية الضفيرية المحتملة وإجراء بقع خاصة لتأكيد التشخيص

ملاحظة: نوصي بشدة بتضمين أخصائي علم الأمراض البشري أو البيطري ذي الخبرة في تقييم H& E والبقع الخاصة لأقسام ورم GEM.

1. افحص الشرائح الملطخة ب H&E المحضرة كما هو موضح أعلاه باستخدام الفحص المجهري برايت فيلد لتحديد أورام غمد الأعصاب المحيطية المحتملة. نظرا لأن الأورام الليفية العصبية و MPNSTs تنشأ داخل الأعصاب الطرفية ، فمن المهم تحديد ما إذا كانت الأورام المجهرية مرتبطة بالعصب المحيطي. حدد الكتل التي تحتوي على أورام غمد الأعصاب المحيطية المحتملة بحيث يمكن إجراء البقع المناعية والبقع الخاصة الأخرى لتأكيد التشخيصات أو دحضها.
2. تمييز PNs المحتملة من MPNSTs / الأورام الأخرى عالية الجودة بناء على السمات النسيجية التي شوهدت أثناء فحص برايت فيلد للأقسام الملطخة ب H&E. PNs البشرية هي أورام مفرطة الخلية تتكون في الغالب من خلايا ذات نوى ممدودة ومموجة في كثير من الأحيان. في العديد من المناطق ، تكون الخلايا معبأة بشكل فضفاض ويمكن فصلها بواسطة مادة مخاطية خارج الخلية. PNs في الفئران P 0-GGFβ3 لها مظهر مماثل. الميتوسيس عادة غير موجودة. إذا كان الأمر كذلك وكان الورم معتدلا إلى مفرط الخلايا ، فإن الورم هو MPNST أو نوع آخر من الأورام عالية الدرجة (انظر أدناه).
3. تتكون PNs من خليط من خلايا Schwann الورمية وأنواع الخلايا غير الورمية الأخرى مثل الخلايا البدينة. لتأكيد هوية PN ، قم بإجراء بقع مناعية لعلامات خلايا Schwann S100β و Sox10 وعلامة الخلايا البدينة CD117 (c-Kit) على أقسام من الكتل التي تحتوي على PNs المحتملة المحددة في فحص H&E (انظر القسم 3.4 للحصول على خيارات تلطيخ بديلة لعلامة الخلايا البدينة). قم بإجراء Ki67 immunostains لتأكيد معدلات الانتشار المنخفضة.
   ملاحظة: يسرد الجدول 1 علامات المستضد المستخدمة للتحديد الروتيني للأورام الليفية العصبية الضفيرية GEM (S100β ، Sox10 ، CD117 ، Ki67) ، وتشخيص MPNSTs ، ولإجراء تقييم كامل لأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الأورام الليفية العصبية ؛ نحن نلطخ هذه المستضدات الأخيرة فقط عند وصف نموذج GEM الجديد لأول مرة. راجع ورقة بيانات الشركة المصنعة للأجسام المضادة لمعرفة الحالات الموصى بها. لاحظ ما إذا كان إدخال الشركة المصنعة للأجسام المضادة يوصي باسترجاع المستضد ؛ لا تتطلب جميع المستضدات الاسترجاع لتكون قابلة للاكتشاف.
   1. قم بإعداد أقسام 4-5 ميكرومتر من كتل البارافين المحددة وقم بتركيبها على شرائح موجبة الشحنة. إزالة البارافين من الأقسام كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.6.
   2. شطف المقاطع مع 1x PBS لمدة 3-5 دقائق.
   3. إذا أوصت الشركة المصنعة للأجسام المضادة باسترجاع المستضد ، فقم بإعداد المخزن المؤقت للسيترات. الجمع بين 9 مل من محلول حامض الستريك (10.5 غرام من حامض الستريك في 500 مل من الماء المقطر) و 41 مل من محلول سترات الصوديوم (14.7 غرام من سترات الصوديوم في 500 مل من الماء المقطر).
   4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق وضع الشرائح في مخزن سترات مؤقت لمدة 20 دقيقة في قدر أرز ساخن.
   5. نقل الشرائح إلى 3٪ بيروكسيد الهيدروجين / 1x PBS لمدة 10 دقائق للقضاء على نشاط البيروكسيديز في الأنسجة.
      ملاحظة: اجعل هذا المحلول طازجا في كل مرة ولا تستخدم محلول مخزون بيروكسيد الهيدروجين إذا كان عمره أكثر من 3-4 أشهر.
   6. شطف المقاطع في 1x PBS.
   7. حظر المقاطع باستخدام المخزن المؤقت للحظر (2٪ BSA ، 0.1٪ Triton X-100 في 1x PBS) لمدة 1 ساعة. شطف الشرائح لفترة وجيزة في 1x PBS.
   8. أضف الأجسام المضادة الأولية إلى أقسام الأنسجة. تحضير الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت المخفف. احتضان الشرائح لمدة 2 ساعة عند 37 ^درجةمئوية أو بين عشية وضحاها في 4 ^درجةمئوية.
   9. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 5 دقائق. كرر 3x.
   10. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل لمدة 1-2 ساعة.
   11. تحضير محلول ديامينوبنزيدين (DAB) بناء على بروتوكول الشركة المصنعة واغمر الشرائح في المحلول لمدة 2-10 دقائق. اغسل الشرائح في الماء لمدة 5 دقائق.
   12. أقسام مضادة عن طريق غمرها في الهيماتوكسيلين لمدة 10-15 دقيقة. تعرض للمياه الجارية حتى تصبح صافية. تراجع بسرعة الشرائح في الكحول وشطف الشرائح في الماء.
   13. قم بتجفيف الشرائح في الإيثانول المتدرج عن طريق غمس الشرائح بسرعة ، 4-5x لكل محلول ، في 70٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، ثم 100٪ إيثانول. احتضان الشرائح في مذيب قائم على الليمونين لمدة 2 دقيقة. احتضان الشرائح في دفعة ثانية من المذيبات القائمة على الليمونين لمدة 2 دقيقة.
   14. قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط تركيب قائم على الزيلين.
   15. فحص الشرائح بواسطة المجهر برايتفيلد.
   16. بالنسبة للتألق المناعي ، احذف الخطوات 3.3.10-3.3.15. بدلا من ذلك ، احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع المخففة في منع العازلة لمدة 1-2 ساعة.
   17. شطف الشرائح في 1x PBS لمدة 5 دقائق. كرر 3x.
   18. قم بتركيب الشرائح باستخدام 1x PBS / glycerol.
   19. افحص الشرائح باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
4. طريقة بديلة لتلطيخ الخلايا البدينة: تلطيخ التولويدين الأزرق
   1. تحضير محلول مخزون التولويدين الأزرق عن طريق إذابة 1 غرام من التولويدين الأزرق O في 100 مل من الإيثانول بنسبة 70٪.
   2. تحضير محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) بنسبة 1٪ عن طريق إذابة 0.5 جم من كلوريد الصوديوم في 50 مل من الماء المقطر. تخلط لتذوب. اضبط الأس الهيدروجيني على حوالي 2.0-2.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
      ملاحظة: يجب أن يكون محلول كلوريد الصوديوم هذا طازجا في كل مرة يتم فيها إجراء البقع.
   3. تحضير محلول عمل التولويدين الأزرق بإضافة 5 مل من محلول مخزون التولويدين الأزرق إلى 45 مل من محلول كلوريد الصوديوم 1٪. تخلط جيدا وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي 2.3.
      ملاحظة: الرقم الهيدروجيني الأعلى من 2.5 سيؤدي إلى تلطيخ مع أقل metachromasia. اجعل هذا الحل طازجا في كل مرة يتم فيها تلطيخها.
   4. إزالة البارافين من 4-5 ميكرومتر من المقاطع المركبة على شرائح موجبة الشحنة كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.6. اغسل المقاطع منزوعة البارافين بالماء الجاري لمدة 2 دقيقة.
   5. أقسام وصمة عار في حل العمل الأزرق تولويدين لمدة 2-3 دقائق. يغسل بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
   6. قم بتجفيف المقاطع عن طريق غمس 10 أضعاف في 95٪ إيثانول. تراجع الشرائح في 100 ٪ الإيثانول 10x. تراجع الشرائح في الإيثانول الطازج 100 ٪ 10 مرات أكثر.
   7. احتضان الشرائح في مذيب قائم على الليمونين لمدة 2 دقيقة. احتضان الشرائح في دفعة ثانية من المذيبات القائمة على الليمونين لمدة 2 دقيقة.
   8. قم بتركيب أغطية باستخدام وسيط تثبيت قائم على الزيلين بينما لا تزال الشريحة مبللة بمذيب قائم على d-limonene.
      ملاحظة: لا تستخدم وسيط تركيب مائي.
   9. فحص الشرائح بواسطة المجهر برايتفيلد. تحديد الخلايا البدينة من خلال وجود حبيبات أرجوانية داكنة في السيتوبلازم. أنواع الخلايا الأخرى ملطخة باللون الأزرق الفاتح.

4. بقع خاصة لتشخيص MPNSTs واستبعاد التشخيصات البديلة

1. المظهر النسيجي ل MPNSTs البشرية متغير للغاية والعديد من أنواع الأورام المختلفة لها مظهر مشابه لمظهر^{MPNSTs 28}. نظرا لأن MPNSTs مشتقة من سلالة خلايا Schwann ، حدد ما إذا كان الورم ينشأ من عصب محيطي أو داخل PN حميد موجود عن طريق الفحص الإجمالي أو الفحص المجهري برايتفيلد للأقسام الملطخة ب H&E. على الرغم من أن MPNSTs لا توجد أحيانا مرتبطة بالعصب المحيطي أو PN (عادة بسبب الانفصال غير المقصود عن العصب أثناء التسلخ ، أو تدمير PN الموجود مسبقا عبر فرط نمو MPNST ، أو لأن الآفة نقيلية) ، ابحث عن ارتباط الورم بعصب أو PN لأن التشخيص أقل احتمالا إذا لم يكن الورم مرتبطا بعصب أو PN.
2. قم بإعداد أقسام 4-5 ميكرومتر من كتل البارافين التي تحتوي على MPNSTs المحتملة وقم بتركيبها على شرائح موجبة الشحنة كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. إزالة البارافين من الأقسام كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.6.
3. إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع لوحة الأجسام المضادة المشار إليها في الجدول 2 كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.15.
4. فحص البقع المناعية بواسطة مجهر برايتفيلد. نظرا لأن MPNSTs تظهر تمايز شواني ، فابحث عن تفاعل مناعي موحد أو غير مكتمل ل S100β و nestin و Sox10. إذا لم تكن الأورام إيجابية لهذه العلامات الثلاثة ، فارجع إلى الجدول 2 لتحديد التشخيص.
   ملاحظة: يمكن أن تظهر MPNSTs البشرية والماوس تمايز متباين. على سبيل المثال ، تظهر بعض MPNSTs البشرية تمايز الأرومات العضلية المخططة البؤرية (تعرف هذه المتغيرات باسم أورام Triton الخبيثة) ؛ على الرغم من أن هذه الأورام سوف تلطخ علامات Schwannian ، إلا أنها تعبر أيضا عن علامات العضلات مثل desmin و MyoD1 و myogenin. لا ينبغي أن يثني النشاط المناعي لهذه العلامات الأخيرة الباحثين عن تشخيص الورم على أنه MPNST. على الرغم من إنشاء نماذج متعددة للفئران تعبر بشكل مشروط عن جين الاندماج SS18-SSX لنمذجة التسبب في الساركوما الزليلية²⁹ ، على حد علمنا ، فإن نماذج الساركوما الزليلية التي تولد تلقائيا نسخة الاندماج المكافئة غير معروفة. وبالتالي ، فإننا لا نبحث عن نصوص اندماج SS18-SSX في أورام GEM ونعتمد بدلا من ذلك على الملامح المناعية الكيميائية.

5. تصنيف MPNSTs

1. تحديد ما إذا كان نخر الورم ، وهو السمة المميزة ل WHO من الدرجة الرابعة MPNSTs ، موجودا. بالنسبة إلى MPNSTs من الدرجة الرابعة ، ابحث عن فرط الخلية البارز ، والنشاط الانقسامي السريع (≥4 انقسامات لكل 10 حقول عالية الطاقة (40x)) ، واللانمطية الخلوية.
   1. إذا لم يكن النخر موجودا ، فقم بتقييم الورم لتحديد ما إذا كانت فرط الخلية والنشاط الانقسامي السريع واللانمطية الخلوية موجودة. إذا كانت جميع هذه الميزات موجودة في حالة عدم وجود نخر ، فقم بتصنيف الورم على أنه MPNST من الدرجة الثالثة لمنظمة الصحة العالمية.
   2. تتميز أورام منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثانية بالخلوية التي تزداد ، ولكن بدرجة أقل من منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثالثة والرابعة MPNSTs. تظهر نوى الخلايا السرطانية في MPNST من الدرجة الثانية لمنظمة الصحة العالمية زيادة في الحجم (أكثر من 3 أضعاف حجم نوى الخلايا السرطانية في الأورام الليفية العصبية) وفرط اللون. ترتبط زيادة النشاط الانقسامي (<4 انقسامات لكل 10 مجالات عالية الطاقة) بأورام منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثانية ، ولكنها ليست شرطا لها.
      ملاحظة: نظرا لأن الأورام ذات الدرجة الأعلى تتطور عادة من الدرجات الدنيا ، فقد توجد مناطق منخفضة الدرجة وعالية الدرجة في نفس MPNST. في هذه الحالة ، يتم تحديد درجة الورم من خلال المنطقة الأعلى درجة الموجودة.
      ملاحظة: هناك جدل بين أخصائيي علم الأمراض البشرية حول ما إذا كان نظام تصنيف منظمة الصحة العالمية الموصوف أعلاه يتنبأ بنتائج المرضى ويفضل بعض أخصائيي علم الأمراض هؤلاء بدلا من ذلك تصنيف MPNSTs على أنها درجة منخفضة أو درجة عالية. بموجب هذا المخطط ، تحتوي MPNSTs عالية الجودة على لانمطية خلوية بارزة ، ونشاط انقسامي سريع (>5 انقسامات لكل 10 حقول طاقة عالية) ، وفرط خلوي ملحوظ مع أو بدون نخر. تفتقر MPNSTs منخفضة الدرجة إلى النخر ولكنها تظهر نشاطا انقساميا ، ونمطية خلوية ، وخلوية وسيطة بين MPNST عالي الجودة وورم ليفي عصبي غير نمطي مع إمكانات بيولوجية غير معروفة (ANNUBP). نحن نفضل النظام الموصوف أعلاه لأن التمييز بين ANNUBP و MPNST منخفض الدرجة يمكن أن يمثل تحديا للمحققين الذين ليس لديهم خبرة طويلة مع هذه الكيانات.

6. إعداد ثقافات المرور المبكر P 0-GGFβ3 MPNST الخلايا

1. مزرعة المرور المبكر P 0-GGFβ3 الخلايا السرطانية من قطعة الورم الطازجة 2 (الخطوة 1.5 ، الشكل 1A). الحفاظ على ظروف معقمة من هذه النقطة فصاعدا.
   1. فصل الورم عن طريق تقطيعه إلى قطع صغيرة (2-4 مم) وفرمه في DMEM10 (الحد الأدنى من الوسط الأساسي ل Dulbecco) الذي يحتوي على مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ ، و 2 ميكرومول / لتر فورسكولين ، و 10 نانومول / لتر نيوريجولين 1β (NRG1β) في أطباق زراعة الأنسجة 100 مم.
   2. اسمح للخلايا بالنمو من شظايا الأنسجة المفرومة عند 37 ^درجةمئوية في 5٪ CO₂ حتى تتلاقى الألواح. تغيير الوسائط كل 3-4 أيام.
   3. تقسيم ثقافة الخلية. قم بإزالة الوسائط من طبق 100 مم واغسل الخلايا باستخدام PBS ؛ إزالة وتجاهل الأنسجة المفرومة. إزالة PBS وإضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لتعزيز انفصال الخلايا ، اضغط برفق على اللوحة وتحقق من الانفصال باستخدام مجهر ضوئي ؛ تمديد حضانة التربسين حسب الحاجة.
   4. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM10. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي وخلايا بيليه عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الوسائط وإضافة 5 مل من DMEM10 الطازج إلى الحبيبات.
   5. قم بتوزيع تعليق الخلية في طبقين إلى أربعة أطباق 100 مم تحتوي على DMEM10. لا تقم بتقسيم الخلايا لأكثر من خمسة مقاطع (الخطوتان 6.1.3 و 6.1.4) واحتفظ بها في DMEM بدون فورسكولين و NRG1β. تذكر تجميد الخلايا عند المقطع 2 لاستخدامها في المستقبل.

7. التحقق من هوية خلايا MPNST ذات المرور المبكر عن طريق الكيمياء الخلوية المناعية

1. ضع أغطية زجاجية مستديرة معقمة مقاس 18 مم # 1.5 في آبار أطباق زراعة الأنسجة المعقمة المكونة من 6 آبار.
   1. ضع محلول بولي-L-ليسين / لامينين في الآبار بحجم كاف لتغطية غطاء الغطاء. أغلق اللوحة بغلاف بلاستيكي لتقليل التبخر. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، اغسل أغطية الغطاء 3x باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
      ملاحظة: لقد حاولنا وضع خلايا MPNST ذات المرور المبكر على أغطية غير مطلية ووجدنا أن الخلايا لا تلتصق جيدا في حالة عدم وجود طلاء poly-L-lysine / laminin.
   2. ضع 10000 خلية على غطاء الغطاء عن طريق إضافة 2 مل من معلق الخلية برفق في وسائط النمو إلى كل بئر تحتوي على قسيمة الغطاء. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ في حاضنة زراعة الأنسجة.
   3. في صباح اليوم التالي ، اشطف أغطية الغطاء لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.
   4. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 18 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   5. شطف أغطية 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. إذا رغبت في ذلك ، أغلق اللوحة باستخدام فيلم بلاستيكي وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في هذه المرحلة.
   6. اصنع 50 مللي متر NH₄Cl طازجة في برنامج تلفزيوني. إخماد الألدهيدات عن طريق احتضان أغطية في 50 mM NH₄Cl في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. تتخلل الخلايا عن طريق احتضان أغطية في 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أغطية الملابس لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
   8. منع الربط غير المحدد عن طريق احتضان أغطية في المخزن المؤقت المانع (1x PBS يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري ، و 0.2٪ حليب جاف منزوع الدسم ، و 0.3٪ Triton X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   9. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر وأضف أجساما مضادة أولية تتعرف على علامات MPNST الموجودة في الورم الأصلي (عادة S100β و Nestin و Sox10) المخففة إلى التخفيف الأمثل المحدد مسبقا في المخزن المؤقت للحظر. لف الطبق بغشاء بلاستيكي واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل في غرفة مرطبة.
   10. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة. أضف جسما مضادا ثانويا يحمل علامة الفلورسنت المخفف في المخزن المؤقت المانع واحتضانه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يحفظ بعيدا عن الضوء.
   11. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. احتضان أغطية في 1-5 ميكروغرام من صبغة Hoechst لمدة 10 دقائق. استمر في الحماية من الضوء.
   12. اغسل أغطية الغطاء باستخدام PBS لمدة 5 دقائق. قم بتركيب الشرائح باستخدام 1: 1 1x PBS / glycerol. صورة بمجهر الفلورسنت.

8. الطعم الخيفي للخلايا السرطانية المبكرة لإثبات الورم

1. تنمو خلايا المرور المبكر P 0-GGFβ3 MPNST في التقاء DMEM10 إلى 80٪. اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانكس بدرجة حرارة الغرفة. عالج الخلايا لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة بمحلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي لإزالتها من الركيزة. أضف 5 مل من DMEM10 لكل 1 مل من كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية.
   ملاحظة: قد يستغرق التفكك الخلوي وقتا أطول بكثير ، حتى 10-20 دقيقة. يرجى الرجوع إلى بروتوكول الشركة المصنعة.
   ملاحظة: لا تنمو الخلايا إلى التقاء لأن هذا سيقلل من فعالية الكسب غير المشروع.
   1. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 5 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها بتركيز 1-2 × 10⁶ خلايا لكل 100 ميكرولتر من DMEM10. احتفظ بالخلايا على الثلج حتى تصبح جاهزة للحقن.
   2. تخدير الفئران NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl / SzJ) في غرفة الحث لمبخر الأيزوفلوران. ضع على بطنه وعقم موقع الحقن بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الموقع يجف في الهواء قبل الحقن. قبل الحقن ، اسمح للخلايا بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
   3. حقن 1-2 × 10⁶ خلايا تحت الجلد في الجناح الأيمن. ضع الماوس بمفرده في قفص خال من الفراش واتركه يتعافى. تأكد من وجود جزء فقط من القفص على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. يوفر هذا منطقة يمكن للماوس الانتقال إليها إذا ارتفعت درجة حرارته.
      ملاحظة: نقوم بتطعيم ما لا يقل عن ثلاثة فئران مع كل مزرعة مرور مبكر لأن بعض الطعوم قد لا تأخذها.
   4. السماح للكسب غير المشروع بالنمو لمدة 15-60 يوما ؛ تقييم صحة 3 مرات أسبوعيا وتسجيل درجات حالة الجسم ، بما في ذلك الوزن والتغيرات السلوكية في كل فحص. قم بإنهاء الفئران التي وصلت إلى الحد الأقصى المسموح به لحجم الكسب غير المشروع أو الفئران المحتضرة باستخدام القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم. سجل العمر عند الوفاة بالأيام. عندما تصبح الأورام مرئية خارجيا ، سجل أبعاد الورم (الطول والعرض والارتفاع).
      ملاحظة: في تجربتنا ، فإن ثقافات MPNST المختلفة للمرور المبكر تطعم بكفاءة متفاوتة وتختلف في الوقت اللازم لنمو الكسب غير المشروع. يجب عدم السماح للحيوانات بتجاوز الحد الأقصى المسموح به لحجم الورم و / أو نقطة النهاية الإنسانية المعتمدة من IACUC.
2. حصاد الورم ، وإصلاحه في 4٪ بارافورمالدهيد ، وتضمينه في البارافين ، وإجراء بقع H& E كما هو موضح في الأقسام 2.1-2.2.9 للتحقق من أن الطعم الخيفي هو ورم وليس نسيجا تفاعليا. إذا لزم الأمر ، مناعة الكسب غير المشروع للعلامات التي كانت موجودة في الورم الأم.

Results

يوضح الشكل 2 أمثلة على الأورام الواضحة بشكل صارخ التي تنشأ في الفئران P 0-GGFβ3. يمكن رؤية الأورام التي يمكن التعرف عليها بسهولة بالعين المجردة على أنها كتل تنتشر في مناطق الجسم كما هو موضح في الشكل 2 أ (السهم). عند تحديد ما إذا كان الورم يحتمل أن يكون ورما في غمد الأعصاب المحيطية ، من الضروري إثبات أن الورم مرتبط بالعصب المحيطي. في هذه الحالة ، يوضح فحص التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 2 ب) أن الورم مرتبط بالعصب الوركي (رأس السهم). تم تأكيد هذا الارتباط بعد القتل الرحيم للفأر وتشريح الورم. تجدر الإشارة إلى أن الحجم الكبير لا يشير بالضرورة إلى أن الورم خبيث. في هذه الحالة ، أظهر الفحص النسيجي للورم (الشكل 2C) أنه كان ورما ليفيا عصبيا. ومع ذلك ، الأكثر شيوعا ، لا يتم تحديد الأورام الواضحة بشكل صارخ حتى إجراء تشريح الفأر. يوضح الشكل 2D MPNST كبيرا وسمينا نشأ داخل الضفيرة العضدية لهذا.

يوضح الشكل 3 أمثلة تمثيلية ل MPNSTs والأورام الليفية العصبية من الفئران P 0-GGFβ3 المحضرة وفقا للإجراءات الموضحة في قسم البروتوكول 1. يوضح الشكل 3A-J عشرة أمثلة على MPNSTs الناشئة بشكل مستقل من مستعمرة الفئران P_0-GGFβ3. لاحظ أن المظهر النسيجي ل MPNSTs يمكن أن يكون متغيرا للغاية ، حتى بين MPNSTs الناشئة بشكل مستقل في نفس. يوضح هذا التباين النسيجي سبب تأكيدنا بشكل روتيني لتشخيص P 0-GGFβ3 MPNSTs مع بقع كيميائية مناعية. نود أن نشير أيضا إلى أن أنواع الأورام الأخرى التي تبدو غير ذات صلة تحدث بشكل متقطع بتردد منخفض في بعض سلالات الفئران الفطرية (على سبيل المثال ، واجهنا عدة مرات الأورام اللمفاوية في الفئران P 0-GGFβ3 التي تحمل جين التحوير على خلفية C57BL / 6J) ، مما يؤكد بشكل أكبر على أهمية استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتأكيد تشخيص الورم. على الرغم من تباين مظهرها النسيجي ، كانت جميع الأورام العشرة الموضحة في الشكل 3A-J مناعية ل S100β و nestin وسلبية لعلامات أنواع الأورام الأخرى. يوضح الشكل 3K صورة تمثيلية للعمود الفقري منزوع الكلس بشكل صحيح والأنسجة المرتبطة به. لاحظ أن الحبل الشوكي وجذور الأعصاب والجسم الفقري والعضلات الهيكلية تحافظ جميعها على علاقتها التشريحية الصحيحة مع بعضها البعض. الشكل 3L هو صورة ذات قدرة أعلى للجسم الفقري والحبل الشوكي المغطي. نظرا لأن هذا النسيج يتم إزالة الكلس بشكل صحيح ، فقد تم قطع العظم بسهولة دون تمزيق أو طي ، ويمكن التعرف على نخاع العظم بسهولة في فراغات النخاع. إذا لم يتم إزالة الكلس من الأنسجة بشكل صحيح ، لكانت قد اشتعلت على شفرة الميكروتوم وتمزقت من القسم ، مما تسبب في أضرار جسيمة للأنسجة المجاورة (الحبل الشوكي وجذور الأعصاب الشوكية والعضلات الهيكلية. يقدم الشكل 3M صورة تمثيلية لورم ليفي عصبي ينشأ داخل جذر العصب الظهري في فأر P 0-GGFβ3. لاحظ أن هذا الورم أقل خلوية من MPNSTs الموضحة في الشكل 3A-J. التشخيص الرئيسي للأورام الليفية العصبية هو أنها تتكون من خليط معقد من خلايا شوان الورمية والخلايا البدينة غير الورمية ، والبلاعم ، والخلايا الليفية ، والعناصر الشبيهة بالعجان التي تتسلل إلى العصب وتنشر المحاور العصبية.

يوضح الشكل 4 أمثلة على البقع الأكثر فائدة في التعرف الأولي على الورم العصبي الليفي الضفيري والتمييز بين الورم العصبي الليفي الضفيري والورم الليفي الضفيري. يوضح الشكل 4A النشاط المناعي S100β في الورم العصبي الليفي الضفيري P 0-GGFβ3. لاحظ أن النشاط المناعي S100β واضح فقط في مجموعة فرعية من الخلايا ، وهو ما يتماشى مع حقيقة أن الأورام الليفية العصبية تتكون من مزيج من خلايا شوان الورمية وغيرها من العناصر غير الورمية (الخلايا الليفية ، الخلايا البدينة ، الضامة ، الخلايا الشبيهة بالعجان ، مجموعة خلوية CD34 غير محددة بشكل جيد ، والأوعية الدموية). لسوء الحظ ، لا يميز تلطيخ S100β غير المكتمل بين الأورام الليفية العصبية الضفيرية و MPNSTs حيث يمكن أن يكون تلطيخ S100β غير مكتمل في MPNSTs (تلطيخ H&E مفيد لهذا الغرض ؛ ومع ذلك ، نظرا لأن MPNSTs عادة ما تكون خلوية أكثر من الأورام الليفية العصبية الضفيرية [انظر الشكل 3]). خلايا شوان الورمية هي أيضا مناعية لعش الخيوط الوسيطة كما هو موضح في P 0-GGFβ3 MPNST الموضح في الشكل 4B. غالبا ما تظهر خلايا شوان الورمية أيضا نشاطا مناعيا نوويا لعامل النسخ Sox10 ، كما هو موضح في MPNST في الشكل 4C. الميزات المفيدة للتمييز بين الأورام الليفية العصبية الضفيرية و MPNSTs هي وجود الخلايا البدينة والنشاط المناعي البارز لعلامة انتشار Ki67. يوضح الشكل 4D صبغة Unna التي يتم إجراؤها على الورم العصبي الليفي الضفيري P 0-GGFβ3 لتسليط الضوء على وجود الخلايا البدينة ، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال تلطيخ البنفسج المتبدل اللون البارز لحبيباتها السيتوبلازمية. الخلايا البدينة غير موجودة في MPNSTs. في المقابل ، فإن النشاط المناعي Ki67 غير موجود تقريبا في الأورام الليفية العصبية الضفيرية كما هو موضح في الورم P 0-GGFβ3 الموضح في الشكل 4E. عادة ما يكون وضع العلامات النووية Ki67 موجودا في جزء عال جدا من الخلايا السرطانية كما هو موضح في MPNST المجهري الناشئ في العقدة الثلاثية التوائم للفأر P 0-GGFβ3 (الشكل 4F).

يوضح الشكل 5 أمثلة على البقع التي نقوم بها لتوصيف التركيب الخلوي للأورام الليفية العصبية بشكل كامل في نموذج GEM المطور حديثا. على الرغم من أن البقع الموضحة في هذا الشكل تم الحصول عليها في الأورام الليفية العصبية الجلدية البشرية ، إلا أنها متطابقة في المظهر مع ما رأيناه في أورام GEM. النشاط المناعي ل CD117 (c-Kit) موجود في الخلايا البدينة داخل الأورام الليفية العصبية ، وبالتالي ، له توزيع مشابه للغاية لما يظهر مع بقع Unna (انظر الشكل 3A). توجد البلاعم أيضا منتشرة في جميع أنحاء الأورام الليفية العصبية ، كما هو موضح مع علامة البلاعم الشاملة Iba1 (انظر الشكل 5D) ؛ وهذا يشمل فئات فرعية من البلاعم التي تكون مناعية ل CD163 و CD86 (انظر الشكل 5B والشكل 5C ، على التوالي). يوضح جزء صغير من عنصر Schwannian في الأورام الليفية العصبية أيضا النشاط المناعي النووي ل Sox10. يمكن تسليط الضوء على الخلايا الليفية من خلال نشاطها المناعي ل TCF4. في الشكل 5G ، يسمي CD31 العناصر الوعائية داخل الورم العصبي الليفي ، بينما يسمي CD34 ، الموضح في الشكل 5H ، مجموعة تغصنية غامضة من الخلايا التي اقترح أنها إما مجموعة فرعية من بلاعم الأنسجة^{المقيمة 30} أو مجموعة جديدة من خلايا الغلاف العصبي التي ليست خلايا شوان ولا الخلايا الليفية³¹.

يتم تضمين الشكل 6 لتمكين مقارنة الأورام الليفية العصبية الضفيرية البشرية و MPNSTs بالأورام التي تظهر في الفئران P 0-GGFβ3 ولتقديم أمثلة تمثيلية لبعض أنواع الأورام البشرية التي يمكن الخلط بينها وبين MPNSTs. يوضح الشكل 6 أ الورم العصبي الليفي الضفيري الذي نشأ في الضفيرة العضدية لمريض NF1 ، بينما يعرض الشكل 6B منظمة الصحة العالمية من الدرجة الرابعة MPNST التي نشأت داخل نفس الورم العصبي الليفي الضفيري. يوضح الشكل 6B بعض السمات المميزة ل WHO من الدرجة الرابعة MPNST ، بما في ذلك فرط الخلية الملحوظ واللانمطية الخلوية ، والنشاط الانقسامي السريع ، ونخر الورم. للمقارنة ، يوضح الشكل 6C MPNST من الدرجة الثانية لمنظمة الصحة العالمية التي لديها لانمطية خلوية كبيرة ولكنها أقل فرط خلوية من الدرجة الرابعة MPNST ، وعلى الرغم من وجود الميتوز ، إلا أنها تظهر نشاطا انقساميا أقل. يوضح الشكل 6 د الساركوما الليفية بنمطها المميز "متعرجة" من الأغماد المتشابكة للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، لا يميز هذا النمط بالضرورة بين الساركوما الليفية و MPNSTs ، لأن بعض MPNSTs سيكون لها نمط مماثل. علاوة على ذلك ، يظهر عرض الطاقة الأعلى المقدم في الشكل 6E مورفولوجيا خلوية مشابهة لتلك التي شوهدت في MPNST من الدرجة الرابعة لمنظمة الصحة العالمية المعروضة في الشكل 6B. يوضح الشكل 6F الساركوما العضلية الملساء. على عكس معظم MPNSTs ، فإن الساركوما العضلية الملساء متفاعلة مناعية لعلامات العضلات مثل أكتين العضلات الملساء وديسمين. يمكن أن يكون النشاط المناعي للأكتين العضلي الأملس متغيرا من ورم إلى آخر ، على الرغم من أن بعض الأورام تظهر نشاطا مناعيا موحدا مكثفا (الشكل 6G) والبعض الآخر يظهر نشاطا مناعيا يظهر التباين الخلوي داخل الورم (الشكل 6H). يمكن أن يكون النشاط المناعي لديسمين غير مكتمل أيضا في الساركوما العضلية الملساء (الشكل 6I). الأورام الميلانينية متغيرة للغاية في التشكل ، حيث تتكون بعض الأورام من خلايا متعددة الأضلاع (الشكل 6J) والبعض الآخر يتكون من خلايا مغزلة يمكنها تقليد مورفولوجيا خلايا MPNST. يمكن تمييز الأورام الميلانينية عن MPNSTs عن طريق النشاط المناعي لعلامات الميلانوزوم مثل MART1 (الشكل 6K). ومع ذلك ، فإن الأورام الميلانينية ، مثل MPNSTs ، غالبا ما تكون إيجابية ل S100β و Sox10 (الشكل 6L).

يوضح الشكل 7 السمات المرضية ل WHO من الدرجة الثانية والثالثة والرابعة MPNSTs المعزولة من الفئران P0-GGFβ3. يوضح الشكل 8 صورا تمثيلية لخلايا MPNST ذات المرور المبكر P 0-GGFβ3 عند طاقة منخفضة (الشكل 7A) وعالية (الشكل 7B). تظهر أورام هذه الخلايا من خلال قدرتها على تكوين مستعمرات عند تعليقها في أجار ناعم (الشكل 7 ج) وتشكيل الطعوم عند الطعم الخيفي تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة (الشكل 7 د).

الشكل 1: سير العمل المستخدم لمعالجة الورم والأنسجة الأخرى من الفئران P 0-GGFβ3. (أ) يتم حصاد الأورام المرئية بشكل كبير وتجزئتها إلى ثلاثة أجزاء من أجل 1) التثبيت في 4٪ بارافورمالدهيد متبوعا بالكيمياء الهيستولوجية المناعية والكيمياء النسيجية ، 2) إنشاء ثقافة الخلايا السرطانية المبكرة و / أو التحليلات الجينومية ، و 3) التجميد المفاجئ باستخدام النيتروجين السائل لعزل البروتين أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. (ب) بعد استئصال الورم ، يتم تثبيت جسم الفأر في 4٪ بارافورمالدهيد ويتم إزالة الأعضاء الداخلية. يتم أخذ عينات من هذه الأعضاء للفحص النسيجي الذي يتم إجراؤه لتحديد الأدلة المجهرية للأورام والعمليات المرضية الأخرى. (ج) بعد إزالة الأعضاء الداخلية، تتم إزالة الأطراف (الرأس والأطراف والذيل) والجلد من الذبيحة. يتم إزالة الكلس من العمود الفقري والأضلاع المجاورة والعضلات الهيكلية المجاورة باستخدام 0.3 M EDTA / 4٪ بارافورمالدهيد (درجة الحموضة 8.0). ثم يتم دمج الأنسجة منزوعة الكلس في البارافين ويتم تحضير أقسام من الأنسجة للفحص المناعي الكيميائي والنسيجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور تمثيلية للأورام الليفية العصبية الواضحة بشكل صارخ و MPNSTs في الفئران P 0-GGFβ3. (A) فأر P_0-GGFβ3 مع ورم كبير واضح بشكل صارخ على الجانب الأيمن (السهم). (ب) يظهر فحص التصوير بالرنين المغناطيسي لهذا الفأر أن الورم متصل بالعصب الوركي (رأس السهم) وأنه نما من خلال اللفافة العلوية ليتوسع داخل تحت الجلد (السهم ، كتلة الورم السائبة). (ج) يظهر الفحص المجهري لهذا الورم أنه على الرغم من حجمه الكبير ، فإن الورم هو ورم ليفي عصبي. (د) MPNST سمين كبير نشأ في الضفيرة العضدية للفأر P 0-GGFβ3. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (C). الاختصارات: MPNSTs = أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة. التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور تمثيلية ل MPNSTs والعمود الفقري منزوع الكلس والأورام الليفية العصبية المحضرة كما هو موضح في قسم البروتوكول 1. (أ-ي) تظهر المقطوعات المستقطعة و H& E الملطخة P 0-GGFβ3 MPNSTs التباين النسيجي. جميع الصور تنشأ بشكل مستقل MPNSTs. على الرغم من هذا التباين النسيجي ، أظهرت جميع هذه الأورام علامات مناسبة لعلامات MPNST المشار إليها في الجدول 1. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. (K) صورة تمثيلية لمقطع عرضي مصبوغ ب H& E للعمود الفقري منزوع الكلس. في هذه الصورة ، يمكن تصور الهياكل التالية بسهولة: الحبل الشوكي. عظم العمود الفقري. العقد الجذرية الظهرية على جذر العصب الشوكي الظهري. والعضلات الهيكلية شبه الفقرية. التكبير 4x. (L) توضح صورة ذات طاقة أعلى للحبل الشوكي والفقرة الموضحة في K المظهر المناسب للعظام بعد إزالة الكلس بهذه المنهجية. التكبير 10x. (M) صورة تمثيلية لورم ليفي عصبي جذر العصب الظهري في فأر P 0-GGFβ3. التكبير 40x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: MPNSTs = أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة. H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: البقعة التشخيصية المستخدمة في التعرف الأولي على الأورام الليفية العصبية الضفيرية الشكل وتمييزها عن الأورام الليفية الضفيرية. (أ) البقع المناعية ل S100β في الورم العصبي الليفي الضفيري P 0-GGFβ3. لاحظ أن التلوين البني المكثف لهذا المستضد موجود فقط في مجموعة فرعية من الخلايا في هذا الورم ، بما يتفق مع حقيقة أن الأورام الليفية العصبية تتكون من خلايا شوان الورمية وأنواع متعددة من الخلايا غير الورمية. (ب) صورة مضاءة مناعية ل P 0-GGFβ3 MPNST مصبوغة لعش الخيوط الوسيطة (أحمر) ومضبوطة بثنائي بنزيميد (صبغة زرقاء نووية). (C) MPNST ملطخة لعامل النسخ Sox10. يتضح النشاط المناعي الشديد (البني) في نوى مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية. (د) عرض عالي الطاقة للورم العصبي الليفي الضفيري P 0-GGFβ3 بعد بقعة Unna. تنتج هذه البقعة تلطيخا متساوي اللون (بنفسجي) للحبيبات في الخلايا البدينة. يمكن تمييز الأورام الليفية العصبية الضفيرية عن MPNSTs لأن الأخيرة تفتقر إلى الخلايا البدينة. (ه، و) Ki67 الكيمياء الهيستولوجية المناعية في (E) a P 0-GGFβ3 الورم العصبي الليفي الضفيري و (F) A P 0-GGFβ3 MPNST. تم تلطيخ كلا القسمين بالهيماتوكسيلين (تلطيخ نووي أزرق) ، مع تجلي التفاعل المناعي Ki67 على أنه تلطيخ نووي بني في بقع البيروكسيديز المناعية هذه. لاحظ أنه لا يوجد تلطيخ نووي بني واضح في الورم العصبي الليفي الضفيري ، في حين أن معظم نوى الخلايا السرطانية إيجابية في MPNST. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: MPNST = ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صور تمثيلية للبقع المناعية المستخدمة لتحديد المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المكونة للأورام الليفية العصبية. تم تلطيخ هذه الصور المناعية الفلورية من الورم العصبي الليفي الجلدي البشري من أجل (أ) CD117 (c-Kit ؛ علامة للخلايا البدينة) ، (B) CD163 (الضامة M2) ، (C) CD86 (الضامة M1) ، (D) Iba1 (علامة عموم البلاعم) ، (E) Sox10 (علامة خلية شوان) ، (F) TCF4 (علامة الخلايا الليفية) ، (G) CD31 (علامة الأوعية الدموية) ، و (H) CD34 (يشير إلى مجموعة فرعية متميزة وغير مفهومة بشكل جيد من الخلايا في الأورام الليفية العصبية). التكبير 60x ، قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: صور تمثيلية للأورام الليفية العصبية الضفيرية الشكل ، MPNSTs ، وبعض أنواع الأورام البشرية الأخرى التي يتم أخذها في الاعتبار في التشخيص التفريقي ل MPNST. (أ) الورم العصبي الليفي الضفيري الضفيري الذي ينشأ في الضفيرة العضدية لمريض NF1 ، مما يدل على الخلوية السفلية الكلية والمظهر الحميد لهذا الأورام. على الرغم من أنه لا يمكن تصوره بسهولة في الأقسام الملطخة ب H&E ، إلا أن هناك مزيجا معقدا من أنواع الخلايا. لا ينظر إلى الميتوسيس. التكبير: 40x. (B) A WHO من الدرجة الرابعة MPNST التي نشأت من الورم العصبي الليفي الضفيري الموضح في A. لاحظ درجة أعلى بكثير من الخلوية. يشير السهم إلى شكل انقسامي ، وتشير العلامة النجمية إلى منطقة نخر الورم في الجزء الأيمن العلوي من هذا الحقل المجهري. التكبير: 40x. (ج) منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثانية MPNST. هذا الورم لديه درجة خلوية أقل من منظمة الصحة العالمية من الدرجة الرابعة MPNST الموضحة في B. ومع ذلك ، هناك المزيد من اللانمطية النووية وفرط الكرومازيا مما هو واضح في الورم العصبي الليفي الضفيري الموضح في A. يشير السهم إلى أحد الأشكال الانقسامية العرضية التي تمت مواجهتها في هذا الأورام. التكبير: 63x. (د) منظر منخفض الطاقة للساركوما الليفية من نوع البالغين يوضح نمط "متعرجة" (الأغماد المتشابكة للخلايا السرطانية) التي تظهر عادة في هذا النوع من الورم. لسوء الحظ ، تصادف بنية عظم السمكة أيضا في بعض MPNSTs البشرية ، وبالتالي لا يمكن استخدامها للتمييز بين الساركوما الليفية و MPNSTs. التكبير: 20x. (ه) منظر أعلى قدرة للساركوما الليفية موضح في (د). لاحظ التشابه بين التشكل الخلوي في هذه الساركوما الليفية والتشكل الخلوي الواضح في MPNST من الدرجة الرابعة لمنظمة الصحة العالمية الموضحة في B. التكبير: 40x. (F) صورة عالية الطاقة للساركوما العضلية الملساء ، مما يدل على التشكل الخلوي الذي يقع ضمن نطاق الاختلاف الذي يظهر في MPNSTs. التكبير: 40x. (ز) البقع المناعية للأكتين العضلي الملساء في الساركوما العضلية الملساء الموضحة في F. لاحظ أن الخلايا السرطانية تظهر نشاطا مناعيا مكثفا موحدا لهذا المستضد. التكبير: 40x. (H) البقع المناعية للأكتين العضلي الملساء في ساركوما عضلية ملساء مختلفة. في هذا الورم ، هناك تباين أكبر في درجة النشاط المناعي ، مع تلطيخ بعض الخلايا بشكل مكثف أكثر من غيرها. ليس من غير المألوف أن يكون النشاط المناعي لنفس المستضد موجودا بشكل موحد في ورم واحد وأن يكون موجودا فقط في مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية في ورم مختلف. التكبير: 40x. (I) صبغة مناعية للديسمين في ساركوما عضلية ملساء ثالثة. في هذا الورم ، تكون مجموعة فرعية فقط من الخلايا السرطانية شديدة التفاعل المناعي لهذا المستضد. (ي) الورم الميلانيني النقيلي. تشتهر الأورام الميلانينية بوجود مورفولوجيا متغيرة للغاية يمكن أن تتراوح من متوازي المستطيلات إلى المغزل. من المرجح أن يتم الخلط بين الأورام ذات التشكل الأخير و MPNSTs ، خاصة بالنظر إلى أن كلا من الأورام الميلانينية و MPNSTs يمكن أن تظهر التفاعل المناعي S100β و Sox10. التكبير: 40x. (K) النشاط المناعي لعلامة سرطان الجلد MART1 في الورم الموضح في J. التكبير: 40x. (L) النشاط المناعي النووي لعامل النسخ Sox10 في الورم الميلانيني الموضح في J. التكبير: 40x ، قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: MPNST = ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: صور تمثيلية لمنظمة الصحة العالمية من الدرجة الثانية إلى الرابعة P 0-GGFβ3 MPNSTs. (أ) الصور المجهرية منخفضة و (ب) عالية الطاقة ل MPNST من الدرجة الثانية لمنظمة الصحة العالمية. لاحظ أن الخلوية أقل من MPNST من الدرجة الثالثة لمنظمة الصحة العالمية الموضحة في اللوحة C وأن نوى الخلايا السرطانية في D أكثر فرط اللون (أغمق) من تلك التي تظهر في اللوحة B. (ج) الصور المجهرية المنخفضة و (د) عالية الطاقة ل MPNST من الدرجة الثالثة لمنظمة الصحة العالمية. أظهر هذا الورم >4 أشكال انقسامية لكل 10 حقول عالية الطاقة ، مع خلايا كانت أكثر كثافة وأكثر كثافة في اللون ، نوى غير نمطية. (ه) وجهات نظر منخفضة و (F) عالية الطاقة لمنظمة الصحة العالمية من الدرجة الرابعة MPNST. لاحظ تركيز النخر في الجزء الأوسط السفلي من اللوحة F. طاقة منخفضة = 20x. طاقة عالية = 40x ، قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: صور تمثيلية لخلايا P 0-GGFβ3 MPNST ذات المرور المبكر وورمها كما يتضح من النمو في الآجار اللين وقدرتها على النمو كطعم خيفي. (أ) صور تباين الطور المنخفض و (B) عالية الطاقة لخلايا MPNST ذات المرور المبكر P_0-GGFβ3. (C) خلايا P 0-GGFβ3 MPNST المزروعة في أجار ناعم وملطخة بالسودان الأسود ؛ المستعمرات واضحة مثل puncta السوداء في أجار. (د) صورة ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين لورم تشكل بعد أن تم تطعيم خلايا P 0-GGFβ3 MPNST تحت الجلد في فأر يعاني من نقص المناعة كما هو موضح في البروتوكول. (ه) تكاثر خلايا P 0-GGFβ3 MPNST ذات المرور المبكر على مدى فترة 5 أيام على النحو الذي يحدده مقياس صورة Celigo الخلوي. طاقة منخفضة = 10x ، طاقة عالية = 40x ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر لجميع اللوحات يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم	استخدام	تفاعل الأنواع / الفئة
سي دي 117	مخفف مسبقا	أرنب وحيد النسيلة
سي دي 163	1:200	الفأر أحادي النسيلي
سي دي 31	1:50	أرنب متعدد النسيلة
سي دي 34	1:2000	أرنب وحيد النسيلة
سي دي 86	1:1000	أرنب وحيد النسيلة
سيتوكيراتين	1 ميكروغرام / مل	الفأر وحيد النسيلة
ديسمين	1:50	الفأر وحيد النسيلة
إبا1	1:500	أرنب متعدد النسيلة
كي-67	1:50	أرنب وحيد النسيلة
مارت 1	1 ميكروغرام / مل	الفأر وحيد النسيلة
نستين	1:1,000	الفأر وحيد النسيلة
بميل	1:100	رابوت وحيدة النسيلة
S100B	1:200	أرنب متعدد النسيلة
س.م.أ	1:100	الفأر وحيد النسيلة
سوكس 10	1:10	الفأر وحيد النسيلة
TCF4 / TCFL2	1:100	أرنب وحيد النسيلة

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة لتشخيص الورم العصبي الليفي الضفيري وأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة. الأجسام المضادة المستخدمة للتحديد الروتيني للأورام الليفية العصبية الضفيرية GEM (S100β ، Sox10 ، CD117 ، Ki67) ، وتشخيص MPNSTs ، وتقييم كامل لأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الأورام الليفية العصبية. اختصار: MPNST = ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة.

		S100β	نستين	سوكس 10	مارت 1	بميل	ديسمين	أكتين العضلات الملساء	سيتوكيراتين	SS18-SSX فيوجن
MPNST		50-90 ٪ ، وعادة ما تكون بؤرية	إيجابي1	~ 30٪	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب
الساركوما الليفية		سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب
الساركوما العضلية الملساء		نادر	سالب	سالب	سالب	سالب	50-100%	موجب	~ 40٪	سالب
ساركوما ظهارية		سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	موجب	سالب
الميلانوما		موجب	موجب	85%	موجب	موجب	سالب	سالب	سالب	سالب
ساركوما الزلالية أحادية الطور		~ 30٪	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	سالب	موجب	موجب

الجدول 2: العلامات المستخدمة لتحديد هوية الورم في البشر. تستخدم هذه العلامات المناعية والكيميائية النسيجية ، جنبا إلى جنب مع تقييم التشكل المجهري للورم ، لتمييز MPNSTs عن الأورام الأخرى التي تقلدها. يشمل التشخيص التفريقي الذي يتم اعتباره عادة ل MPNSTs البشرية الساركوما الليفية من نوع البالغين ، والساركوما الظهارية ، والساركوما العضلية الملساء ، والساركوما الزليلية أحادية الطور ، والورم الميلانيني. الساركوما الليفية من النوع البالغ لها نمط متعرج مجهريا وبقع للفيمنتين ، ولكن ليس S100β. الساركوما العضلية الملساء ، ولكن ليس MPNSTs ، هي مناعية لديسمين. تحتوي الساركوما العضلية الملساء أيضا على نوى ذات مورفولوجيا حادة بشكل ملحوظ. الساركوما الظهارية ، ولكن ليس MPNSTs ، هي مناعية للسيتوكيراتين. قد تكون الأورام الميلانينية ، مثل MPNSTs ، إيجابية S100β ، ولكنها أيضا مناعية ل MART-1 و PMEL. اختصار: MPNST = ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة. ¹مزيج من S100β و nestin تنبؤي للغاية من MPNST.

Discussion

توفر الطرق النسيجية والكيميائية الحيوية المعروضة هنا إطارا لتشخيص وتوصيف نماذج GEM للورم العصبي الليفي والتسبب في MPNST. على مر السنين ، وجدنا أن هذه المنهجيات مفيدة جدا لتقييم أمراض أورام غمد الأعصاب المحيطية الناشئة في نماذج GEM^21،25،26. ومع ذلك ، في حين أن البروتوكولات الموضحة هنا مفيدة لتحديد مدى دقة الأورام في نماذج GEM في تلخيص أمراض نظيراتها البشرية ، إلا أن هناك بعض القيود على هذه الاستراتيجيات التي يجب تقديرها. بادئ ذي بدء ، تظهر الفئران P 0-GGFβ3 اختراقا شبه كامل للنمط الظاهري للورم ، مما يجعل من السهل نسبيا الحصول على أعداد كبيرة من الفئران المصابة بالأورام الليفية العصبية و MPNSTs^21،25،26 التي يمكن استخدامها للدراسات الجينومية وشاشات shRNA على نطاق الجينوم. كما أن الاختراق العالي للنمط الظاهري في هذا النموذج يجعل الفئران P 0-GGFβ3 مفيدة جدا للتجارب قبل السريرية. ومع ذلك ، يجب الاعتراف بأن هذا لن يكون هو الحال بالنسبة لجميع نماذج السرطان GEM. هذا هو السبب في أننا أكدنا على أهمية تحديد جزء التي يمكن التنبؤ بها لتطوير الأورام. عند العمل مع نموذج حيواني أقل شيوعا لتطوير الأورام ، وجدنا أنه من المفيد استخدام طرق التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لتحديد التي تحمل الأورام بشكل قاطع والتي يمكن إدخالها في التجارب قبل السريرية أو غيرها من الدراسات. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا النهج باهظ التكلفة ، إذا كانت هناك حاجة إلى عمليات مسح متكررة. هذا هو السبب في أننا أكدنا أيضا على أهمية تحديد متوسط وقت البقاء على قيد الحياة لنموذج GEM محل الاهتمام²⁶ - فهم متى يمكن توقع إصابة بورم يقلل من عدد عمليات المسح المطلوبة لتحديد ذات النمط الظاهري المطلوب والتكاليف المرتبطة به.

من المهم أيضا إدراك أن الورم الكبير في الفأر لا يزال في الواقع كمية صغيرة من الأنسجة. في هذا البروتوكول ، نوصي بعملية يتم فيها تقسيم أنسجة الورم إلى أثلاث ، مع تخصيص أجزاء لعلم الأنسجة / الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وإنشاء مزارع خلايا المرور المبكر ، وعزل الجزيئات الحيوية (البروتينات ، الحمض النووي الريبي ، الحمض النووي) ذات الأهمية. ومع ذلك ، سيختلف حجم الورم ، وإذا كان الورم صغيرا جدا ، فقد يحول ذلك دون وجود أنسجة كافية للانقسام بهذه الطريقة. في هذه الحالة ، يجب على المحقق تحديد ما إذا كان تشخيص الورم أو أي استخدام آخر لأنسجة الورم له الأولوية³². في ظل هذه الظروف ، فإن تحيزنا هو أنه يجب أن يكون لدينا تشخيص مناسب لفهم ما نعمل به قبل الشروع في تجارب أخرى. لقد وجدنا أن تشخيص الورم يمكن عادة تحديده بسهولة باستخدام أقل من ثلث الأورام. عند التعامل مع الأورام الصغيرة ، سنقوم بدلا من ذلك بإزالة جزء صغير من أنسجة الورم ، ولفه في أنسجة الأنسجة ووضعه في شريط الأنسجة لضمان عدم فقد الأنسجة أثناء المعالجة. عيب هذا النهج هو أنه قد يتسبب في أن يقلل الباحث من رتبة الورم إذا كان تصنيف منظمة الصحة العالمية مرغوبا فيه ؛ وذلك لأن المناطق ذات الدرجة الأدنى والأعلى تتعايش بشكل شائع في السرطانات ، وإذا تم أخذ عينة صغيرة جدا ، فإن الدرجة التي تم الحصول عليها ستعتمد على المكان الذي تم أخذ عينة الورم منه.

تعتمد البروتوكولات التي نصفها لتحديد هوية ورم غمد الأعصاب المحيطية بشكل كبير على الكيمياء الهيستولوجية المناعية. في حين أن هناك طرقا بديلة عرضية يمكن استخدامها لبعض أنواع الخلايا (على سبيل المثال ، إجراء بقع Unna لتحديد الخلايا البدينة) ، فإن هذا لا ينطبق بشكل موحد على معظم أنواع الخلايا الموجودة في الأورام الليفية العصبية و MPNSTs. وبالتالي ، يجب توخي الحذر الشديد لإثبات أن الإجراءات الكيميائية المناعية التي سيتم استخدامها قد تم تحسينها بشكل صحيح. في تجربتنا ، يمكن للعديد من المشكلات أن تؤثر على الكيمياء المناعية التشخيصية. من المهم للغاية أن يقوم الباحث بإجراء سلسلة مخففة بجسم مضاد أولي لم يستخدمه من قبل ؛ بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء سلسلة مخففة عند استخدام دفعة جديدة من الجسم المضاد الذي تم تحسينه مسبقا³³. يجب توخي الحذر أيضا لضمان وجود دفعات جديدة من الكواشف في متناول اليد. في تجربتنا ، عندما يتقدمون في العمر ، يكون بيروكسيد الهيدروجين و DAB عرضة بشكل خاص لعدم الأداء بشكل صحيح ، مما قد يدفع المحقق إلى أن يقرر بشكل غير لائق أن بقعهم سلبية.

الملامح المناعية الكيميائية التي نصفها للأورام الليفية العصبية الضفيرية ، MPNSTs ، والأنواع المتنوعة من الأورام التي يتم أخذها في الاعتبار في التشخيص التفريقي ل MPNSTs هي تلك التي واجهناها بشكل شائع^{21،25،26،34}. ومع ذلك ، نظرا لأن التمايز المتباعد ليس من غير المألوف في MPNSTs وهذه الأورام الخبيثة الأخرى ، فقد يواجه المحقق ملفات تعريف تلطيخ تختلف إلى حد ما عما نصفه هنا. هذه الفروق الدقيقة هي السبب في أننا نوصي بشدة بأن يشمل الفريق الذي يميز نموذج GEM الجديد لتكوين الأورام أخصائي أمراض بشري أو بيطري ذي خبرة. في هذا البروتوكول ، قمنا بتطبيق تصنيف منظمة الصحة العالمية على GEM و MPNSTs البشرية. نحن نفضل نظام الدرجات هذا لأن معايير الدرجات محددة جيدا نسبيا ويسهل مقارنتها بين MPNSTs^{البشرية} والماوس ^2,28. ومع ذلك ، نود أن نلاحظ أن معايير تصنيف منظمة الصحة العالمية ليست مقبولة بشكل موحد من قبل علماء الأمراض. هذا لأنه ليس من الواضح أن درجات منظمة الصحة العالمية الثلاثة التي يتم تطبيقها على MPNSTs تنبئ بالنتائج السريرية في المرضى. لهذا السبب ، يفضل العديد من علماء الأمراض تصنيف MPNSTs ببساطة على أنها أورام خبيثة منخفضة الدرجة أو عالية الدرجة. باستخدام هذا النهج ، يعتبر ما يقرب من 85 ٪ من MPNSTs أورام خبيثة عالية الدرجة تتميز بالنشاط الانقسامي السريع ، واللانمطية الخلوية الملحوظة ، وفرط اللون الذي قد يكون مصحوبا بنخر الورم. تظهر MPNSTs منخفضة الجودة عددا أقل من الخلوية وفرط اللون والنشاط الانقسامي.

لقد وجدنا أن الطعم الخيفي لخلايا MPNST ذات المرور المبكر هو وسيلة مباشرة للتحقق من أورام هذه الثقافات. ومع ذلك ، ينبغي النظر في بعض القضايا عندما لا تنشئ الخلايا طعم خيفي³². في تجربتنا ، في حين أن الغالبية العظمى من خلايا MPNST ذات المرور المبكر ستنشئ طعم خيفي ، فقد واجهنا أحيانا ثقافات مرور مبكرة لا تفعل ذلك. على الرغم من هذا الفشل ، أظهر التهجين الجينومي المقارن للمصفوفة (aCGH) وتسلسل الإكسوم الكامل أن ثقافات المرور المبكر هذه بها تشوهات جينومية متعددة تتفق مع كونها خلايا سرطانية^25,26. لقد وجدنا أيضا ثقافات مرور مبكرة غير صحية ، عادة لأنه سمح للثقافات بأن تصبح متقاربة قبل حصادها للتطعيم. الخلايا التي تضررت من المعالجة الخشنة (على سبيل المثال ، المحتضنة لفترة طويلة جدا بمحلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي الذي تم سحبه لأعلى ولأسفل لعدد مفرط من المرات) تعمل أيضا بشكل سيئ عند تطعيمها. ونود أن نلاحظ أيضا أن الأوقات التي أشرنا فيها إلى إنشاء الكسب غير المشروع هي تقدير يستند إلى تجربتنا. في بعض الأحيان ، واجهنا ثقافات المرور المبكر التي ستنشئ بنجاح الطعم الخيفي ولكنها تستغرق وقتا أطول للقيام بذلك.

توفر الأساليب الموضحة أعلاه وسيلة شاملة لتوصيف الجوانب الرئيسية لنموذج GEM المطور حديثا لأورام الجهاز العصبي المحيطي والتشخيص الصحيح لأي أورام ليفية عصبية و MPNSTs تتطور هذه. توفر الطرق التي نحددها لإنشاء ثقافات MPNST المبكرة واستخدام هذه الثقافات للتطعيم الخيفي أيضا دليلا واضحا على أورام الأورام التي تم تحديدها في نماذج GEM. نود أن نؤكد أننا لا نقوم باختيار المستنسخة الفردية عند إنشاء ثقافات المرور المبكر. على الرغم من أننا ندرك أن بعض الانتقاء أمر لا مفر منه عند وضع الخلايا السرطانية في الثقافات ، إلا أن هذه النتائج الأولية تشير إلى أن الطفرات التي تم تحديدها في ثقافات GEM MPNST المبكرة لا تزال تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الورم الأم. ومع ذلك ، باستخدام aCGH ، وجدنا أيضا أن الاستمرار في حمل ثقافات المرور المبكر هذه لمزيد من الممرات الممتدة يؤدي إلى تغييرات جينومية تبدأ في التباعد عما يظهر في الممرات السابقة لهذه الخلايا السرطانية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 مم لوحات زراعة الأنسجة Corning	Falcon	353003
3 ، 3'- ديامينوبنسيدين (DAB)	مختبرات ناقلات	SK-400
6- ألواح الآبار	Corning Costar	3516
حمض الخليك	فيشر Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 الثانوية (الماعز المضادة للفأر)	Invitrogen	A11029
أليكسا فلور 568 الثانوي (مضاد للماعز المضاد للفأر)	Invitrogen	A21043 أو A11004
Alexa Fluor 568 الثانوي (مضاد للأرانب الماعز)	Invitrogen	A11036
كلوريد الأمونيوم (NH4< / sub>Cl) فيشر	Scientific	A661-500
BCA مجموعة فحص البروتين	Thermo Scientific	23225
ألبومين	مصل البقرفيشر العلمي	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89 ، ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM   ؛	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
مكشطة الخلية	Sarstedt	83.183
متجرد الخلايا	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (مذيب قائم على d-limonene)	مختبرات Decon	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
السيتوكيراتين	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	استنساخ D33 (M0760)
(DAB)	Solution Vector	Laboratories SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
الإيثانول (200 برهان)	مختبرات Decon	2716
مصل عجل الجنين	أوميغا Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)Corning		21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
مقياس الدم	Brightline-Hauser Scientific	1490
حمض الهيدروكلوريك	فيشر Scientific	A144-212
بيروكسيد الهيدروجين	فيشر Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (بيروكسيداز) بوليمر كيت ، فأر على فأر	مختبرات ناقلات	MP-2400
ImmPRESS HRP (بيروكسيداز) بوليمر ،	مختبرات ناقلات	MP-7401
حاضنة	حراري علمي	Heracell 240i حاضنة
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
النيتروجين
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	الإنسان: MAD5236 (10C2) ، الإنسان: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	في المنزل	صنع بواسطة S.L.C. (متوفر أيضا باسم 396-HB-050 / CF من R& amp D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	SC-67
إيماءة. Cg-Prkdcscid< / sup> Il2rgtm1Wjl / SzJ الفئران	جاكسون المختبر	5557
الحليب الجاف الخالي من الدسم	وول مارت	العلامة التجارية ذات القيمة العظيمة
P0-GGFβ 3 فئران	في المنزل
شمع البارافين	لايكا	بارابلاست 39601006
بارافيلم M	سيجما ألدريتش	PM-999
بارافورمالديهايد (4٪) Thermo	Scientific	J19943-K2
Permount (وسيط تركيب الزيلين)	فيشر Scientific	SP15-100
مقياس الأس الهيدروجيني	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863 (2) ، ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
آلة Isoflurance المحمولة	VetEquip أنظمة
PVA-DABCO (وسط تركيب مائي)	Millipore Sigma	10981100ML
طباخ الأرز	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako & nbsp؛	Z0311  (الآن GA504)
SMA	Ventana للأنظمة الطبية	استنساخ 1A4
كلوريد الصوديوم	فيشر Scientific	S640
سترات الصوديوم (ثنائي هيدرات) فيشر	Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM   ؛	ab212843
			الأنسجة الصلب
Superfrost Plus المجهر الشرائح	فيشر Scientific	12-550-15
TCF4 / TCFL2   ؛	إشارات الخلية	(CH48H11) # 2569
كاسيت
تولويدين أزرق	ACROS Organics	348600050
تريتون X-100	فيشر ساينتفيك	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
تريبسين	كورنينج	25-051-31