يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد نوع الألياف للعضلات الهيكلية البشرية

3.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65750

⸱

سبتمبر 22, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول عزل الألياف المفردة من العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد وتصنيف نوع الألياف وفقا لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) باستخدام تقنية النشاف النقطية. يمكن بعد ذلك تحليل عينات الألياف MHC I و II المحددة بشكل أكبر بحثا عن الاختلافات الخاصة بنوع الألياف في تعبير البروتين باستخدام النشاف الغربي.

الملخص

يمكن استخدام التقنية الموصوفة هنا لتحديد أشكال متماثلة محددة من سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) في أجزاء من ألياف العضلات الفردية باستخدام النشاف النقطي ، ويشار إليها فيما يلي باسم اكتشاف سلسلة الأوسينالثقيلة الخاصة بي بواسطة Dot Blotting لتحديد معرفنوع الألياف العضلية (MyDoBID). يصف هذا البروتوكول عملية تجفيف العضلات الهيكلية البشرية بالتجميد وعزل أجزاء من ألياف العضلات المفردة. باستخدام MyDoBID ، يتم تصنيف الألياف من النوع الأول والثاني مع الأجسام المضادة الخاصة ب MHCI و IIa ، على التوالي. ثم يتم دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف لكل خزعة.

يتم تحديد البروتين الكلي في كل عينة بواسطة الرحلان الكهربائي لثنائي الصوديوم - كبريتات بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وتقنية الجل المنشط بالأشعة فوق البنفسجية. يتم التحقق من صحة نوع الألياف من العينات باستخدام النشاف الغربي. كما تم وصف أهمية إجراء تطبيع تحميل البروتين لتعزيز اكتشاف البروتين المستهدف عبر البقع الغربية المتعددة. تشمل فوائد دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف مقارنة بالبقع الغربية أحادية الألياف ، تعدد استخدامات العينات ، وزيادة إنتاجية العينة ، واستثمار وقت أقصر ، وتدابير توفير التكاليف ، كل ذلك مع الاحتفاظ بمعلومات قيمة خاصة بنوع الألياف والتي غالبا ما يتم تجاهلها باستخدام عينات العضلات المتجانسة. الغرض من البروتوكول هو تحقيق تحديد دقيق وفعال للألياف من النوع الأول والنوع الثاني المعزولة من عينات العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد.

يتم دمج هذه الألياف الفردية لاحقا لإنشاء عينات خاصة بنوع الألياف من النوع الأول والنوع الثاني. علاوة على ذلك ، تم توسيع البروتوكول ليشمل تحديد ألياف النوع IIx ، باستخدام الأكتين كعلامة للألياف التي كانت سلبية ل MHCI و MHCIIa ، والتي تم تأكيدها على أنها ألياف IIx بواسطة النشاف الغربي. ثم يتم استخدام كل عينة خاصة بنوع الألياف لتحديد التعبير عن البروتينات المستهدفة المختلفة باستخدام تقنيات النشاف الغربية.

المقدمة

العضلات الهيكلية هي نسيج غير متجانس ، مع خصائص التمثيل الغذائي وانقباض الخلوية المتميزة التي تعتمد على ما إذا كانت الخلية (الألياف) هي نشل بطيء (النوع الأول) أو نشل سريع (النوع الثاني). يمكن التعرف على نوع الألياف من خلال فحص الأشكال المتساوية لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) ، والتي تختلف عن بعضها البعض بعدة طرق ، بما في ذلك وقت الانكماش وسرعة التقصير ومقاومة التعب1. تشمل الأشكال المتساوية الرئيسية MHC النوع الأول والنوع IIa والنوع IIb والنوع IIx وتكون ملامحها الأيضية إما مؤكسدة (النوع الأول و IIa) أو تحلل السكر (IIx ، IIb) 1. تختلف نسبة أنواع الألياف هذه في نوع العضلات وبين الأنواع. تم العثور على النوع IIb على نطاق واسع في عضلات القوارض. لا تحتوي عضلات الإنسان على أي ألياف من النوع IIb وتتكون في الغالب من ألياف MHC من النوع الأول و IIa ، مع نسبة صغيرة من ألياف IIx2. تختلف ملامح تعبير البروتين بين أنواع الألياف المختلفة ويمكن تغييرها مع الشيخوخة3 ، وممارسة4،5 ، والمرض6.

غالبا ما يتم تجاهل قياس الاستجابات الخلوية في أنواع مختلفة من الألياف العضلية الهيكلية أو غير ممكن بسبب فحص تجانس العضلات (مزيج من جميع أنواع الألياف). تسمح اللطخة الغربية أحادية الألياف بفحص البروتينات المتعددة في ألياف العضلات الفردية7. تم استخدام هذه المنهجية سابقا لإنتاج خصائص ألياف مفردة جديدة وغنية بالمعلومات لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام مستحضرات متجانسة. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على منهجية اللطخة الغربية الأصلية أحادية الألياف ، بما في ذلك الطبيعة التي تستغرق وقتا طويلا ، وعدم القدرة على توليد نسخ متماثلة للعينات ، واستخدام كواشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) باهظة الثمن والحساسة. إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة ، فإن هذه الطريقة محدودة بشكل أكبر بسبب القيود الزمنية للحاجة إلى عزل الألياف الفردية في إطار زمني محدود (أي 1-2 ساعة). لحسن الحظ ، يتم تخفيف هذا التقييد عن طريق عزل شرائح الألياف المفردة من الأنسجة المجففةبالتجميد 8. ومع ذلك ، فإن جمع الألياف من العينات المجففة بالتجميد محدود بحجم وجودة الأنسجة المأخوذة.

تم توضيح تحديد نوع الألياف باستخدام طريقة النشافالنقطي 9 بشكل كبير وتوسيعه في هذا البروتوكول الشامل. في السابق ، ثبت أن أقل من ~ 2-10 ملغ من الأنسجة العضلية ذات الوزن الرطب كافية للتجفيف بالتجميد وتحليل البروتين أحادي الألياف MHC9. استخدم Christensen et al.9 30٪ من قطعة ألياف ~ 1 مم للكشف عن شكل MHC الموجود عن طريق النشاف النقطي ، وهو ما أكده النشاف الغربي. أظهر هذا العمل أنه من خلال استبدال النشاف الغربي بالنشاف النقطي ، تم تخفيض التكاليف الإجمالية بمقدار ~ 40 ضعفا (ل 50 قطعة ألياف). ثم تم "تجميع" الألياف في عينات من النوع الأول والنوع الثاني ، مما سمح بالتكرار التجريبي9. ومع ذلك ، كان هناك قيد هو أنه تم الحصول على عينتين فقط من نوع الألياف: النوع الأول (MHCI إيجابي) والنوع الثاني (الألياف الإيجابية MHCII) ، مع عينات من النوع الثاني تحتوي على خليط من MHCIIa و MHCIIx 6,10. والجدير بالذكر أن البروتوكول الحالي يوضح كيف يمكن تحديد الألياف النقية من النوع IIx ويوفر سير عمل مفصل للغاية (ملخص في الشكل 1) ، بما في ذلك استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمشكلات البروتوكول الشائعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على عينات من العضلات البشرية من الأوعية الجانبية من n = 3 (2 ذكور ، 1 أنثى) ، تتراوح أعمارهم بين 70-74 سنة تحت ظروف معقمة باستخدام التخدير الموضعي (Xylocaine) وإبرة Bergstrom المعدلة للشفط اليدوي11،12. كانت العينات مجموعة فرعية من دراسة سابقة وافقت عليها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة فيكتوريا (HRETH11/221) وأجريت وفقا لإعلان هلسنكي13. قدم المشاركون موافقة خطية مستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة. التفاصيل الكاملة لجميع المواد المطلوبة لهذا البروتوكول موضحة في جدول المواد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير قائمة باستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها التي تعالج مشكلات البروتوكول الشائعة في الجدول 1.

1. تجميد التجفيف

  1. مع الاحتفاظ بعينات العضلات المأخوذة مجمدة على الثلج الجاف ، قم بوزن أنبوب مجمد فارغ على الميزان.
  2. تزن بسرعة ما لا يقل عن 10 ملغ من الأنسجة المجمدة الوزن الرطب. سجل الوزن لأقرب منزلة عشرية.
  3. قم بإيداع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد مسبقا والذي يحتوي على 3-4 ثقوب مثقوبة في الغطاء وضعه في دورق صغير به 2-3 كريات من الثلج الجاف.
  4. اتبع تعليمات تشغيل الشركة المصنعة للمجفف بالتجميد.
  5. تأكد من إغلاق جميع الصمامات الموجودة في مجفف التجميد وقم بتشغيل مجفف التجميد.
  6. استخدم لوحة التحكم للتحقق من أن نقطة ضبط الفراغ مبرمجة لظروف التجفيف بالتجميد المثلى للأنسجة البشرية ، 0.12 مليبار (ملي بار) (الشكل 2).
  7. اضغط يدويا على مجفف التجميد وانتظر حتى تبرد الحجرة إلى -40 درجة مئوية.
  8. بمجرد أن تصل الحجرة إلى درجة الحرارة هذه ، قم بإزالة الغطاء ، ثم الحجرة الزجاجية ، وضع الدورق (مع عينة العضلات) على المسرح المعدني.
  9. استبدل الحجرة الزجاجية والغطاء. أغلق صمام تحرير الفراغ الموجود على الغطاء وانتظر حتى يتحول ضوء مقياس الفراغ إلى اللون الأخضر للتأكد من أن المجفف مغلق بالفراغ.
  10. قم بتجميد وتجفيف عينات العضلات لمدة 48 ساعة. بمجرد اكتمال التجفيف بالتجميد ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ عن طريق الضغط على زر التفريغ وافتح صمام تحرير الفراغ على الغطاء.
  11. قم بإزالة غطاء الغرفة وجمع العينة المجففة بالتجميد. وزن الأنسجة وتسجيل الوزن لأقرب منزلة عشرية.
  12. حساب النسبة المئوية لفقدان الوزن ؛ ~ انخفاض الوزن بنسبة 75٪ يشير إلى أن الأنسجة قد تم تجفيفها بالتجميد بنجاح (في هذا العمل ، يعني ± SD ، 76 ± 9٪ ، n = 11 عينة عضلية).
  13. اضغط على AUTO لإيقاف تشغيل مضخة التفريغ والفريزر. اسمح للوحدة بالوصول إلى درجة الحرارة المحيطة.
  14. قم بتنظيف ملفات التبريد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة واستنزاف السائل المتراكم من المجمع.
    ملاحظة: يمكن أن يبدأ جمع الألياف على الفور. عندما لا يتم استخدام الأنسجة لعزل الألياف ، احتفظ بالعينة المجففة بالتجميد عند -80 درجة مئوية في حاوية محكمة الغلق مع حبات مجففة.  تنبيه: الثلج الجاف خطير (الفئة 9) ؛ ارجع إلى MSDS للحصول على المعالجة الآمنة الموصى بها.

2. جمع الألياف

  1. إعداد جمع الألياف
    1. قم بتسمية ما لا يقل عن 50 أنبوبا ميكروفيا (الألياف من 1 إلى 50) وماصة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتغيير طبيعة كل أنبوب.
    2. قم بإعداد منطقة التجميع بزوجين من ملقط تشريح الأنسجة الدقيقة ، والأنسجة الخالية من النسالة ، ومصباح الطاولة ، والمجهر المجسم (مع المرحلة السوداء لأعلى) ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي الموضوعة على الطاولة.
    3. ضع عينة العضلات المجففة بالتجميد على غطاء طبق بتري. ضع الغطاء على مرحلة المجهر التشريحي.
    4. شاهد فيديو تشريح الألياف المفردة. مارس البروتوكول الكامل من جمع الألياف إلى تحديد نوع الألياف المفردة مرتين على الأقل قبل البدء في الدراسة.
    5. قبل جمع الألياف ، احسب الحجم الإجمالي المطلوب لعينة نوع الألياف من كل خزعة على النحو التالي. على سبيل المثال ، إذا كان حجم البداية لألياف واحدة = 10 ميكرولتر والحجم المتبقي بعد MyDoBID هو (1 ألياف × 10 ميكرولتر) - 1 ميكرولتر مستخدم في النشاف النقطي = 9 ميكرولتر (حجم العينة) ، احسب إجمالي حجم العينة المطلوب بضرب حجم العينة (ميكرولتر) في العدد الإجمالي للبقع الغربية التي سيتم تشغيلها ومضاعفة هذا المبلغ لحساب التكرار: (9 ميكرولتر × 4 بقع غربية) × 2 = 72 ميكرولتر. احسب عدد الألياف المطلوبة لكل عينة مكتوبة بقسمة حجم العينة النهائي المطلوب (ميكرولتر) على حجم العينة لكل عينة خاصة بنوع الألياف (على سبيل المثال ، 72 ميكرولتر ÷ 9 ميكرولتر = 8 ألياف لكل عينة خاصة بنوع الألياف). لتحقيق ذلك ، اجمع ما مجموعه 50 ألياف.
      ملاحظة: حجم العينة المطلوب هو الحد الأدنى لتركيز البروتين المطلوب لتشغيل كل من MyDoBID والنشاف الغربي إذا كانت كمية البروتين المحملة تعادل ~ 3 مم من الألياف (~ 12 ميكروغرام من الوزن الرطب) لكل عينة (انظر الملف التكميلي 1 للحصول على التفاصيل). ومع ذلك ، فإن هذا الحجم لا يأخذ في الاعتبار ما إذا كانت المواد الهلامية المتكررة مطلوبة لبروتين معين.  تنبيه: الملقط حاد. تعامل معها بعناية لتجنب خطر ثقب الجلد.
  2. عزل أحادي الألياف
    1. على قطعة صغيرة من الورق 5 سم × 1 سم ، استخدم مسطرة لرسم خط 1 سم. ضع علامة على كل 1 مم على هذا الخط.
    2. أدخل هذا تحت غطاء طبق بتري كدليل لتقدير طول الألياف التي تم جمعها.
    3. ضع عينة العضلات المجففة بالتجميد تحت المجهر المجسم عند تكبير منخفض (x 7.5). استخدم زوجا واحدا من ملقط تشريح الأنسجة الدقيقة لتثبيت العضلات المجففة بالتجميد في مكانها ومع البدء الآخر في فصل حزم صغيرة من الألياف (كما هو موضح في الفيديو).
    4. اعزل حزمة واحدة من الألياف واستمر في التباعد حتى يتم عزل أجزاء الألياف المفردة من الحزمة.
    5. اجمع ما لا يقل عن 50 أليافا لا يقل طولها عن ~ 1 مم.
    6. انقل الألياف إلى مساحة فارغة على طبق بتري. افحص الأجزاء أحادية الألياف تحت التكبير العالي (x 50). تأكد من أنها ألياف واحدة عن طريق فصل الألياف في النهاية. إذا انكسرت الألياف بدلا من الانفصال ، فهي ألياف واحدة.
  3. تمسخ الألياف
    1. باستخدام الملقط ، اجمع الألياف برفق وضعها مباشرة في المخزن المؤقت لتغيير طبيعة الملقط (لا تدع الملقط يواجه المخزن المؤقت).
    2. افحص الملقط تحت المجهر للتأكد من إزالة الألياف بنجاح. أغلق الأنبوب واضغط على الجزء السفلي من الأنبوب بإحكام على المقعد ثلاث مرات لضمان انتقال الألياف إلى المخزن المؤقت.
    3. امسح الملقط نظيفا باستخدام منديل خال من النسالة قبل الانتقال إلى الألياف التالية. كرر هذه العملية حتى يتم جمع جميع الألياف.
    4. دوامة عينات الألياف وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان عند 2500 × جم لسحب العينة إلى قاع الأنبوب.
      ملاحظة: يتم توقيت مدة الطرد المركزي (5 ثوان) من البداية (0 × جم) حتى تصل السرعة إلى ~ 2500 × جم.
    5. اترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. قم بتجميد العينات ثم إذابتها قبل الاستخدام.

3. نقطة النشاف

  1. إعداد الغشاء وتفعيله
    1. قم بقياس وتسمية وقطع غشاء واحد من البولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF) (حجم مسام 0.2 ميكرومتر) ليناسب 50 عينة (~ 10.5 سم × 5.5 سم).
    2. ضع علامة على الحد الأيسر عدديا من أعلى إلى أسفل (من 1 إلى 10) والحد العلوي أبجديا من اليسار إلى اليمين (A إلى E) متباعدا بمقدار 1 سم.
    3. قم بإعداد أربع أوراق من ورق الترشيح بأبعاد 12.5 سم × 7.5 سم.
    4. كومة ورقتين معا لتشكيل كومة. قم بنقع كومة ورق الترشيح مسبقا في مخزن مؤقت للنقل 1x.
    5. ضع الغشاء في وعاء. صب 95٪ إيثانول على الغشاء ، مع حجم كاف لغمر الغشاء بالكامل (10-15 مل). هياج على الروك لمدة 1 دقيقة.
    6. تذكر الإيثانول ، واغمر الغشاء في مخزن مؤقت لنقل 1x (~ 15 مل) ، والصخور لمدة 2 دقيقة أخرى.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام كل من الإيثانول ومخزن النقل المؤقت في تجارب النشاف النقطي المستقبلية حتى يتشكل الترسيب (يتغير بعد ستة استخدامات).
    7. ضع كومة ورق الترشيح المبللة بمخزن مؤقت للنقل على سطح متحرك مسطح مثل غطاء كبير وقم بتسويتها باستخدام الأسطوانة. ضع غشاء PVDF على المكدس باستخدام مانع هلام أو ملاقط.
    8. ضع ورقة واحدة من ورق الترشيح الجاف أعلى الغشاء وحرك الأسطوانة فوق ورق الترشيح لامتصاص أي مخزن مؤقت زائد على سطح الغشاء. قم بإزالة ورق الترشيح العلوي دون فرك الغشاء.
      تنبيه: الميثانول (الفئة 3 ، المخاطر الفرعية 6.1) والإيثانول (الفئة 3) خطران. ارجع إلى ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) للحصول على توصيات المناولة الآمنة.
  2. امتصاص العينة إلى الغشاء
    1. قم بإذابة عينات الألياف ، وقم بإجراء جهاز طرد مركزي قصير (5 ثوان) في درجة حرارة الغرفة كما في الخطوة 2.3.4 واخلط العينة جيدا.
    2. دون لمس الغشاء بطرف الماصة ، قم ببطء بإيداع قطرة ~ 1 ميكرولتر من كل عينة على الغشاء في المنطقة المخصصة. أبعاد المنطقة المعينة لكل عينة ألياف هي ~ 1 سم × 1 سم. استهدف تحديد العينة في وسط هذه المنطقة.
    3. اترك قطرات العينة تنقع عبر الغشاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. تأكد من عدم بقاء مخزن مؤقت للعينة وامتصاصه بالكامل.
    4. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ارفع الغشاء بعناية عن كومة ورق الترشيح الرطبة ، وضعه على ورقة جافة واحدة من ورق الترشيح ، وقم بتجفيف الغشاء لمدة 5 دقائق على الأقل.
    5. بمجرد أن تتحول بقع العينة إلى اللون الأبيض تماما ، أعد تنشيط الغشاء.
  3. إعادة تنشيط الغشاء وحظره
    1. أعد تنشيط الغشاء بتكرار الخطوتين 3.1.5 و 3.1.6.
    2. ضع الغشاء في محلول الغسيل واشطفه لمدة 5 دقائق بالتأرجح. تخلص من المخزن المؤقت للغسيل.
    3. احتضان الغشاء في العازلة المانعة لمدة 30 دقيقة أثناء التأرجح.
    4. اشطف الغشاء 3x بمحلول غسيل حتى يختفي المخزن المؤقت من الغيوم.
    5. اترك الغشاء في الغسيل النهائي على الروك.

4. وضع العلامات المناعية

  1. الكشف عن MHCIIa
    1. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي MHCIIa عند 1 في 200 في 10 مل من المخزن المؤقت لألبومين مصل الأبقار (BSA).
    2. تخلص من المخزن المؤقت للغسيل من الغشاء ثم صب الجسم المضاد MHCIIa المخفف على الغشاء.
    3. ضع الحاوية (مع الغشاء في MHCIIa) على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    4. تذكر الجسم المضاد MHCIIa وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء مع عازلة حجب لمدة 2 دقيقة على الروك.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام جميع الأجسام المضادة الأولية حتى خمسة أضعاف طالما ظل المخزن المؤقت واضحا.
    5. شطف مرتين أكثر. 5 دقائق في كل مرة ؛ ثلاث غسلات في المجموع.
    6. تمييع الفأر الغلوبولين المناعي G الفجل بيروكسيديز (IgG-HRP) الجسم المضاد الثانوي في 1 في 20000 في 10 مل من العازلة حجب وإضافة إلى الغشاء.
    7. تخلص من المخزن المؤقت للغسيل واحتضان الغشاء في الماوس IgG-HRP الثانوي مع هزاز لمدة 1 ساعة.
    8. تخلص من الثانوية واغسل الغشاء في محلول الغسيل (2 ، 5 ، 5 دقائق).
    9. اترك الغشاء منقوعا في الغسيل النهائي حتى يصبح جاهزا للتصوير.
    10. قم بتشغيل جهاز التصوير الهلامي، وانتظر 15 دقيقة حتى يصل جهاز التصوير إلى درجة حرارة التشغيل المطلوبة، ثم افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد).
    11. في نافذة البرنامج ، انقر فوق بروتوكول قناة واحدة جديد (الشكل 3 أ). للحصول على صورة ضوء أبيض للغشاء ، ضمن التطبيقات | البقع | انقر فوق القياس اللوني (الشكل 3 ب).
    12. انقر على منطقة الهلام. تمت برمجة كل خيار لأبعاد محددة لتناسب حجم أنواع الجل المختلفة. حدد الخيار المناسب لتناسب أبعاد الغشاء على أفضل وجه (الشكل 3C).
    13. قم بإعداد ECL عن طريق الجمع بين كواشف اللومينول والبيروكسيديز بنسبة 1: 1. اصنع حجما كافيا من خليط ECL لتغطية الغشاء بأكمله ، وعادة ما يكون الحجم الإجمالي مطلوبا من 800-1000 ميكرولتر.
    14. ضع الغشاء على صينية بلاستيكية شفافة كبيرة وقم بتفريق خليط ECL على الغشاء.
    15. ضع الغشاء على لوحة التصوير.
    16. انقر فوق Position Gel (الزر الأصفر) لعرض الكاميرا الحية. انقر مع الاستمرار واسحب زر التكبير / التصغير لزيادة مساحة التصوير في الغشاء. في هذه المرحلة ، قم بتصويب موضع الغشاء إذا لزم الأمر.
    17. انقر فوق تشغيل البروتوكول (الزر الأخضر) وانتظر حتى يتم إنتاج صورة لونية للغشاء. احفظ هذه الصورة للمساعدة في مطابقة النقاط مع عينة الألياف المقابلة.
    18. بدون تحريك الغشاء ، قم بتغيير التطبيق على البرنامج بالنقر فوق خيار تجميع 2 × 2 (Chemi High Resolution) (الشكل 3D).
    19. ضمن التعرض للصور والبرامج ، قم بتحسين وقت التعرض ، انقر فوق نطاقات باهتة (الشكل 3E) | وضع تراكم الإشارة.
    20. ضمن الإعداد ، اكتب 1 ثانية للصورة الأولى ، و 30 ثانية للصورة الأخيرة ، و 30 صورة إجمالية (الشكل 3F).
    21. انقر فوق تشغيل البروتوكول.
    22. احفظ صورة في المراحل التالية: قبل تشبع الإشارة (جميع النقاط المرئية سوداء) ، تشبع الإشارة الأولي (تبدأ بعض النقاط في التشبع) ، والبقع المفرطة التشبع (جميع البقع ذات الإشارة القوية المكتشفة مشبعة).
    23. احفظ جميع الصور المطلوبة قبل إنهاء تراكم الإشارة. أخرج الغشاء من جهاز التصوير.
    24. باستخدام محرر الجل ، ضع الغشاء مرة أخرى في الحاوية باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.
  2. الكشف عن MHCI
    1. صب المخزن المؤقت للغسيل وعالج الغشاء بمحلول تجريد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (تأكد من غمر الغشاء تماما).
    2. تذكر المخزن المؤقت للتجريد واشطف الغشاء في محلول الغسيل لمدة 5 دقائق مع التأرجح.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت للتجريد 10 مرات قبل التخلص منه.
    3. اسكب المخزن المؤقت للغسيل وهذه المرة ضع الجسم المضاد الأساسي MHCI المخفف بتركيز يبدأ من 1 في 200 (النطاق: 1 في 200 إلى 1 في 500). صخرة الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. بعد الحضانة في الجسم المضاد الأولي MHCI ، تذكر الجسم المضاد واغسل الغشاء كما في الخطوتين 4.1.4 و 4.1.5.
    5. تمييع الجسم المضاد الثانوي IgM HRP للفأر في حجب المخزن المؤقت عند 1 في 20,000. اسكب المخزن المؤقت المانع من الغشاء واحتضانه في الماوس IgM الثانوي كما في الخطوة 4.1.7.
    6. تم اكتشاف غسل والتقاط الصور MHCI كما في الخطوات من 4.1.8 إلى 4.1.24.
      تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت للتجريد على الفوسفين العضوي 3-5٪ (الفئة 8). ارجع إلى MSDS للحصول على توصيات التعامل الآمن.
  3. الكشف عن MHCIIx المحتملة باستخدام الأكتين
    1. قم بتجريد الغشاء مرة أخرى (الخطوتان 4.2.1 و 4.2.2).
    2. كرر القسم 4.1 ، هذه المرة بتطبيق الجسم المضاد الأولي للأكتين المخفف عند 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA ثم الجسم المضاد الثانوي HRP للأرانب المخفف عند 1 في 20000 في المخزن المؤقت للحظر.

5. تحديد نوع الألياف

  1. تحليل إشارات MHCI و MHCIIa و Actin
    1. تعرف على لوحة شدة الإشارة (الشكل 4 أ). دون الخطوات من 5.1.2 إلى 5.1.4.
    2. تشير شدة الإشارة المشبعة نوعيا إلى أن اكتشاف البروتين قوي.
    3. يشير المعتدل إلى أن البروتين المستهدف موجود على مستوى متوسط.
    4. تشير الإشارة الخافتة إلى وجود القليل من البروتين المستهدف.
    5. استخدم لوحة شدة الإشارة لتصنيف الألياف ذات شدة الإشارة "المشبعة" أو "المعتدلة" أو "الخافتة" (الشكل 4 أ).
    6. قم بإجراء تحديد نوع الألياف من خلال مقارنة نتائج MHCIIa و MHCI أولا (الشكل 4B ، البقع اليسرى والوسطى).
    7. سجل الألياف ذات شدة الإشارة المشبعة أو المعتدلة لشكل isoform MHC واحد فقط.
    8. إذا كانت إشارة الشكل المتماثل MHC "باهتة" ، فاترك الألياف بدون علامة (انظر الشكل 4B).
    9. أخيرا ، حيث يتم ملاحظة الأكتين (شدة إشارة معتدلة أو مشبعة) في الألياف مع عدم اكتشاف MHCI أو IIa ، قم بتسجيله كألياف محتملة من النوع IIx (الشكل 4B ، اللطخة اليمنى).
    10. سجل الألياف بإشارة متساوية الشكل MHC خافتة ولكن تم اكتشاف الأكتين (كثافة معتدلة أو مشبعة) على أنها غير معروفة.
    11. تجاهل العينات التي تحتوي على اكتشاف خافت أو معدوم (لم يتم جمع الألياف) لجميع البروتينات المستهدفة الثلاثة (الشكل 4C).
    12. سجل أي ألياف حيث يتم اكتشاف كل من إشارات MHCI و MHCII بإشارة "مشبعة" أو معتدلة. هذه العينات ليست للاستخدام في التحضير الخاص بنوع الألياف.
  2. تحضير عينات خاصة بنوع الألياف
    1. قم بإعداد عينة منفصلة من النوع الأول والنوع الثاني لكل خزعة. بالنسبة لعينة من النوع الثاني ، اجمع الحد الأدنى المطلوب من الألياف (المحسوبة في الخطوة 2.1.5) التي يتم فيها اكتشاف MHCIIa عند مستويات مشبعة أو معتدلة.
    2. في أنبوب منفصل يسمى النوع الأول ، كرر هذه العملية للألياف التي يتم فيها اكتشاف MHCI (الشكل 4D).
    3. استخدم أليافا ذات كثافة إشارة معتدلة إذا لم يكن هناك ما يكفي من الألياف ذات الإشارات المشبعة.
    4. الجمع بين أي ألياف IIx المحتملة.
    5. استخدم على الفور عينات خاصة بنوع الألياف للنشاف الغربي أو قم بتخزينها في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

6. تأكيد نوع الألياف لطخة الغربية

  1. استخدم 10 ميكرولتر من كل عينة خاصة بنوع الألياف ، (الحد الأدنى لحجم العينة المطلوب ، انظر الخطوة 2.1.5).
  2. افصل العينات باستخدام الجل مسبق الصب المحدد عبر SDS-PAGE وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. استخدم جهاز تصوير جل للكشف عن البروتين الموجود في الجل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. ضع الجل في مخزن مؤقت لنقل 1x بارد لمدة 10 دقائق.
  5. نقل البروتينات الرطبة إلى غشاء نيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر (9.5 سم × 13.5 سم) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. بعد النقل ، شطف الغشاء لفترة وجيزة مع H2O عالية النقاء في وعاء. اسكب الماء فائق النقاء.
  7. أضف 10 مل من محلول محسن إشارة الأجسام المضادة إلى الغشاء والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  8. تذكر محلول محسن إشارة الأجسام المضادة واغسل 5x (5 ثوان لكل غسلة) باستخدام H2O عالي النقاء.
    ملاحظة: يمكن استخدام محلول محسن إشارة الأجسام المضادة 5x قبل التخلص منه.
  9. اسكب الغسيل الأخير ، وأضف محلول الحجب ، والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  10. استخدم شفرة مشرط نظيف أو مقص لقطع أفقيا عبر الغشاء بوزن جزيئي يضمن وجود البروتينات التي تبلغ 180 كيلو دالتون وما فوق في الجزء العلوي من الغشاء.
  11. استخدم هذا القسم العلوي لمزيد من تأكيد نوع الألياف.
  12. استخدم الجزء الذي يقل عن 180 كيلو دالتون للكشف عن البروتينات المستهدفة المختلفة.
  13. في الجزء العلوي من الغشاء ، اتبع القسم 4.1 مع الجسم المضاد الثانوي MHCIIx الأساسي والفأر Immunoglobulin M (IgM) HRP.
  14. قم بتجريد الغشاء (كما هو موضح في القسمين 4.2.1 و 4.2.2) قبل تكرار العملية باستخدام الجسم المضاد الثانوي MHCIIa IgG IgG الأساسي والفأر.
  15. تجريد مرة أخرى وأخيرا تطبيق MHCI IgM الأساسي والماوس IgM HRP الأجسام المضادة الثانوية.
    ملاحظة: هذه الخطوة نوعية وبالتالي فإن أي فقدان للبروتين بسبب تجريد الغشاء ليس مصدر قلق.
  16. قارن الإشارة المكتشفة عبر الأشكال المتماثلة المختلفة ل MHC (كما هو موضح في الشكل 5B). عندما يتم الكشف عن شدة الإشارة عند مستويات معتدلة إلى مشبعة في العينة المتوقعة (MHCI - النوع الأول ، MHCIIa - النوع الثاني و MHCIIx - النوع IIx) ، سيتم تسجيل العينات الخاصة بنوع الألياف على أنها موثوقة للاستخدام في الدراسات المستقبلية.
  17. سجل العينة على أنها غير موثوقة عند اكتشاف أكثر من شكل متساو MHC في العينة.
    تنبيه: يحتوي محلول محسن الأجسام المضادة على هيدروكسيد الصوديوم 50٪. ارجع إلى MSDS للحصول على توصيات التعامل الآمن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحديد الألياف العضلية الفردية MHCI و MHCIIa و MHCIIx باستخدام النشاف النقطي
تتمثل إحدى ميزات MyDoBID في تصنيف شدة إشارة MHC و Actin المتغيرة في ألياف معينة (الشكل 4A). تم تحديد نوع الألياف من خلال وجود أو عدم وجود أشكال متماثلة MHCI و IIa (الشكل 4B). لم تظهر ستة ألياف أي اكتشاف ل MHC أو الأكتين ، مما يشير إلى عدم وجود ألياف تم جمعها. كانت نتائج هذه اللطخة النقطية المحددة هي تحديد 22 أليافا من النوع الثاني و 7 ألياف من النوع الأول و 3 ألياف مح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

جمع الألياف
بناء على عدة سنوات من الخبرة ، يمكن لمعظم الباحثين إتقان هذه التقنية. ومع ذلك ، تؤدي الممارسة إلى جمع الألياف بشكل أسرع وأكثر كفاءة للتحليلات النهائية. لتكون قادرا على عزل 30 قطعة ألياف مفردة بجودة التجميع ، يوصى بجمع 50 قطعة ألياف لكل عينة. يوصى بدراسة فيديو جمع الألياف بعناية وبعد إجراء جلستين تدريبيتين (~ 50 ألياف لكل جلسة) لتحقيق معيار معقول. تخضع جميع الألياف التي تم جمعها ل MyDoBID لتحديد نوع الألياف ، مما سيكشف عن مدى فعالية تنفيذ التقنية. سينظر إلى هذا على أنه عدد منخفض من إشارة MH...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

تم تطوير الأجسام المضادة ضد MHC I (A4.840) و MHCIIa (A4.74) المستخدمة في هذه الدراسة من قبل الدكتور H. M. Blau وتم تطوير الجسم المضاد ضد MHCIIx (6H1) من قبل الدكتور C. A. Lucas وتم الحصول عليه من بنك الدراسات التنموية Hybridoma (DSHB) ، وذلك بفضل رعاية المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وتحتفظ به جامعة أيوا ، قسم العلوم البيولوجية (أيوا سيتي ، IA). نشكر Victoria L. Wyckelsma على تقديم عينات العضلات البشرية لهذه الدراسة. تم الحصول على غالبية الصور في الشكل 1 من BioRender.com.

التمويل:
ولم تتلق هذه الدراسة أي تمويل خارجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x المخزن المؤقت لتغيير طبيعةالطبيعة اصنع وفقا للوصفةيمكن الحصول على المكونات من Sigma-Aldrich أو شركات توزيع المواد الكيميائية الأخرى  ؛ يتم إجراء 1x المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة عن طريق تخفيف 3x المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة 1 في 3 V / V مع 1X Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3x المخزن المؤقت لتغيير طبيعةالطبيعة اصنع وفقا للوصفةيمكن الحصول على المكونات من Sigma-Aldrich أو غيرها من الموزعين الكيميائيين يحتوي3x denatturing buffer على: 0.125M Tris-HCI ، 10٪ جلسرين ، 4٪ SDS ، 4 M يوريا ، 10٪ 2-mercaptoethanol ، و 0.001٪ بروموفينول أزرق ، درجة الحموضة 6.8. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
95٪ من الإيثانولN / A100٪ من أي شركةمخففة إلى 95٪ باستخدام H2< / sub>O فائق النقاء.
الأكتين أرنب الأجسام المضادة متعددة النسيلةسيجما-ألدريتش  A2066تخفيف 1 في 1,000 مع المخزن المؤقت BSA.
الموازين التحليليةMettler Toledoرقم الموديل: MSZ042101
محسن الأجسام المضادةThermo Fischer Scientific32110اسم المنتج هو Miser Antibody Extender Solution NC.
دورق (100 مل)N / AN / A
جهاز طرد مركزيEppendorf5452اسم الموديل: Mini Spin.
المخزن المؤقت للحظر: 5٪ حليب خالي الدسم في محلول الغسيل.تم شراءالدبلوم
من BSA المخزن المؤقت: 1٪ BSA / PBST ، 0.02٪ NaN3< / sub>BSA: Sigma-Aldrich                           PBS: مختبرات Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich BSA: A6003-25G                                                10x PBS: 1610780                                            NaN3:ألبومين مصل الأبقار S2002 (BSA) ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، وأزيد الصوديوم (NaN3). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
رافعة فتح الكاسيت مختبرات بيو4560000تستخدم لفتح أشرطة الجل مسبقة الصب.
Chemidoc MP Imager مختبرات بيو رادرقم الموديل: غطاء المحرك العالمي IIIأي نظام تصوير مزود بإمكانيات تصوير جل خال من البقع.
Criterion blotterBio-Rad1704070تتضمن عبوة ثلج ، وصينية نقل ، وبكرة ، و 2 حامل كاسيت ، وورق ترشيح ، ووسادات إسفنجية وغطاء مع كابلات.
خلية معيار (Bio-Rad)مختبرات Bio-Rad1656001
ECL (التلألؤ الكيميائي المعزز)مختبرات Bio-Rad1705062اسم المنتج: ركيزة Clarity Max Western ECL.
عازلة الرحلان الكهربائي 1x Tris Glycine SDS (TGS)Bio-Rad Laboratories1610772تمييع 10x TGS 1 في 10 مع H2< / sub>O.
ورق ترشيح ، سمك 0.34 ممWhatmann3030917حجم السائب 3 مم ، عبوة 100 ورقة ، 315 × 335 مم.
ملقط تشريح الأنسجة الدقيقةDumontF6521-1EAJeweller' ملقط رقم 5.
صينية / غطاء بلاستيكي مسطح   N / AN / Aكبير بما يكفي لوضع الغشاء عليه. تأكد من أن السطح مسطح تماما.
نظام التجفيف بالتجميدLabconco7750030المنطقة الحرة 4.5 لتر مع مرحلة عينة الغرفة الزجاجية.
فريزر -80 oC N / AN / Aأي فريزر بدرجة حرارة ثابتة -80 درجة ؛ C مناسب.
1653320 محررات الجلBio-RadSlide تحت الغشاء لجمع الغشاء أو تحريكه.
قلم رصاص رماديN / AN / A &NBSP
؛ برامج مختبر الصور Bio-Rad LaboratoriesFiguresإلى إصدار البرنامج 5.2.1 ولكن يمكن استخدام إصدارات أخرى.
حاضنةمختبرات بيوراد 1660521أي حاضنة يمكن ضبطها على 37 درجة ؛ C يكفي.
مصباحN / AN / A
النمام المغناطيسي مع البراغيثN / AN / A
بكرة غشاء   ؛مختبرات بيوراد 1651279في حزمة النقل. ومع ذلك ، إذا لم يكن هذا المنتج متاحا ، فإن أي أنبوب أسطواني أملس السطح طويل بما يكفي للتدحرج فوق الغشاء سيكون كافيا.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة  (0.6 مل)N / AN / A
الماوس IgG HRP الثانويThermo Fisher Scientific31430الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، RRID AB_228341. خفف عند 1 في 20,000 في المخزن المؤقت للحظر.
الماوس IgM HRP الثانويةAbcamab97230IgM IgM المضادة للفأر. استخدم في نفس التخفيف مثل IgG للماوس.
الميوسين السلسلة الثقيلة I (MHCI) الجسم المضاد الأساسيDSHBA4.840 نطاق التخفيف: 1 في 200 إلى 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA.
الميوسين الثقيلة سلسلة IIa (MHCIIa) الجسم المضاد الأساسيDSHBA4.74 نطاق التخفيف: 1 في 200 إلى 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA.
تخفيف الجسم المضاد الأساسي للسلسلة الثقيلة من الميوسين الثقيلة IIx (MHCIIx): 1 في 200 إلى 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA.
غشاء النيتروسليلوز 0.45 & ميكرو; m مختبرات بيو1620115للنشاف الغربي.
غطاء طبق بتريN / AN / A
ملاقط بلاستيكيةN / AN / A
Power Pack   ؛مختبرات Bio-Rad164-5050اسم المنتج: مصدر الطاقة الأساسي.
سلم البروتينThermo Fisher Scientific26616PageRuler سلم البروتين الملون ، من 10 إلى 180 كيلو دالتون.
غشاء PVDF 0.2 & micro; ممختبرات Bio-Rad1620177
Rabbit HRP الثانويةThermo Fisher Scientific31460الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) ، RRID AB_228341. التخفيف مثل الأجسام المضادة الثانوية للفأر.
الروكN / AN / A
المسطرةN / AN / A
مقصN / AN / A
مجهر مجسمMoticSMZ-168
تجريد العازلةThermo Fisher Scientific21059اسم المنتج: استعادة المخزن المؤقت لتجريد اللطخة الغربية.
مناديل (خالية من الوبر)كيمبرلي كلارك المهنية34120اسم المنتج: Kimwipe.
عازلة النقل (1x Tris Glycine buffer (TG) ، 20٪ ميثانول) TG: Bio-Rad Laboratories   ؛   الميثانول:Merck TG buffer: 1610771                    الميثانول: 1.06018مخفف 10x TG مع H2O فائق النقاء إلى 1x. أضف 100٪ ميثانول إلى التركيز النهائي 20٪ من الميثانول. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
صينية نقلمختبرات Bio-Rad1704089
  جل مسبقة الصب للأشعة فوق البنفسجيةBio-Rad Laboratories5678085نوع الجل: 4 & ndash ؛ 15٪ Criterion TGX جل بروتين خال من البقع ، 26 بئر ، 15 ميكرو لتر.
VortexN / AN / A
عازلة غسيل (1x TBST)10x TBS: Astral Scientific   ؛ Tween 20: Sigma  وصفة BIOA0027-4 لتر1x TBST: يتم تخفيف 10x Tris-buffered Saline (TBS) إلى 1x مع H2< / sub>O فائق النقاء ، يضاف Tween 20 إلى التركيز النهائي 0.1٪. مخزن المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية.
حاويات الغسيل اشترىمتجرSistemaأي حاوية tupperware ، التي تناسب الأبعاد التقريبية للغشاء ستكون كافية.
يمكن الحصول على متجر راد مختبرات تشير يمكن شراء سلسلة نطاق راد

المراجع

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273(2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ألياف العضلات الهيكليةالسلسلة الثقيلة للميوسينلطخة النقطةالألياف من النوع الأولالألياف من النوع الثانيالألياف من النوع الثاني إكس (IIx)لطخة ويسترنالفصل الكهربائي للهلام بـ SDSعزل ألياف العضلات
تحديد نوع الألياف للعضلات الهيكلية البشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.