يوضح هذا البروتوكول عزل الألياف المفردة من العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد وتصنيف نوع الألياف وفقا لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) باستخدام تقنية النشاف النقطية. يمكن بعد ذلك تحليل عينات الألياف MHC I و II المحددة بشكل أكبر بحثا عن الاختلافات الخاصة بنوع الألياف في تعبير البروتين باستخدام النشاف الغربي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد نوع الألياف للعضلات الهيكلية البشرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن استخدام التقنية الموصوفة هنا لتحديد أشكال متماثلة محددة من سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) في أجزاء من ألياف العضلات الفردية باستخدام النشاف النقطي ، ويشار إليها فيما يلي باسم اكتشاف سلسلة الأوسينالثقيلة الخاصة بي بواسطة Dot Blotting لتحديد معرفنوع الألياف العضلية (MyDoBID). يصف هذا البروتوكول عملية تجفيف العضلات الهيكلية البشرية بالتجميد وعزل أجزاء من ألياف العضلات المفردة. باستخدام MyDoBID ، يتم تصنيف الألياف من النوع الأول والثاني مع الأجسام المضادة الخاصة ب MHCI و IIa ، على التوالي. ثم يتم دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف لكل خزعة.
يتم تحديد البروتين الكلي في كل عينة بواسطة الرحلان الكهربائي لثنائي الصوديوم - كبريتات بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وتقنية الجل المنشط بالأشعة فوق البنفسجية. يتم التحقق من صحة نوع الألياف من العينات باستخدام النشاف الغربي. كما تم وصف أهمية إجراء تطبيع تحميل البروتين لتعزيز اكتشاف البروتين المستهدف عبر البقع الغربية المتعددة. تشمل فوائد دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف مقارنة بالبقع الغربية أحادية الألياف ، تعدد استخدامات العينات ، وزيادة إنتاجية العينة ، واستثمار وقت أقصر ، وتدابير توفير التكاليف ، كل ذلك مع الاحتفاظ بمعلومات قيمة خاصة بنوع الألياف والتي غالبا ما يتم تجاهلها باستخدام عينات العضلات المتجانسة. الغرض من البروتوكول هو تحقيق تحديد دقيق وفعال للألياف من النوع الأول والنوع الثاني المعزولة من عينات العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد.
يتم دمج هذه الألياف الفردية لاحقا لإنشاء عينات خاصة بنوع الألياف من النوع الأول والنوع الثاني. علاوة على ذلك ، تم توسيع البروتوكول ليشمل تحديد ألياف النوع IIx ، باستخدام الأكتين كعلامة للألياف التي كانت سلبية ل MHCI و MHCIIa ، والتي تم تأكيدها على أنها ألياف IIx بواسطة النشاف الغربي. ثم يتم استخدام كل عينة خاصة بنوع الألياف لتحديد التعبير عن البروتينات المستهدفة المختلفة باستخدام تقنيات النشاف الغربية.
المقدمة
العضلات الهيكلية هي نسيج غير متجانس ، مع خصائص التمثيل الغذائي وانقباض الخلوية المتميزة التي تعتمد على ما إذا كانت الخلية (الألياف) هي نشل بطيء (النوع الأول) أو نشل سريع (النوع الثاني). يمكن التعرف على نوع الألياف من خلال فحص الأشكال المتساوية لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) ، والتي تختلف عن بعضها البعض بعدة طرق ، بما في ذلك وقت الانكماش وسرعة التقصير ومقاومة التعب1. تشمل الأشكال المتساوية الرئيسية MHC النوع الأول والنوع IIa والنوع IIb والنوع IIx وتكون ملامحها الأيضية إما مؤكسدة (النوع الأول و IIa) أو تحلل السكر (IIx ، IIb) 1. تختلف نسبة أنواع الألياف هذه في نوع العضلات وبين الأنواع. تم العثور على النوع IIb على نطاق واسع ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على عينات من العضلات البشرية من الأوعية الجانبية من n = 3 (2 ذكور ، 1 أنثى) ، تتراوح أعمارهم بين 70-74 سنة تحت ظروف معقمة باستخدام التخدير الموضعي (Xylocaine) وإبرة Bergstrom المعدلة للشفط اليدوي11،12. كانت العينات مجموعة فرعية من دراسة سابقة وافقت عليها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة فيكتوريا (HRETH11/221) وأجريت وفقا لإعلان هلسنكي13. قدم المشاركون موافقة خطية مستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة. التفاصيل الكاملة لجميع المواد المطلوبة لهذا البروتوكول موضحة في جدول المواد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير قائمة باستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها التي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحديد الألياف العضلية الفردية MHCI و MHCIIa و MHCIIx باستخدام النشاف النقطي
تتمثل إحدى ميزات MyDoBID في تصنيف شدة إشارة MHC و Actin المتغيرة في ألياف معينة (الشكل 4A). تم تحديد نوع الألياف من خلال وجود أو عدم وجود أشكال متماثلة MHCI و IIa (الشكل 4B). لم تظهر ستة ألياف أي اكتشاف ل MHC أو الأكتين ، مما يشير إلى عدم وجود ألياف تم جمعها. كانت نتائج هذه اللطخة النقطية المحددة هي تحديد 22 أليافا من النوع الثاني و 7 ألياف من النوع الأول و 3 ألياف مح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
جمع الألياف
بناء على عدة سنوات من الخبرة ، يمكن لمعظم الباحثين إتقان هذه التقنية. ومع ذلك ، تؤدي الممارسة إلى جمع الألياف بشكل أسرع وأكثر كفاءة للتحليلات النهائية. لتكون قادرا على عزل 30 قطعة ألياف مفردة بجودة التجميع ، يوصى بجمع 50 قطعة ألياف لكل عينة. يوصى بدراسة فيديو جمع الألياف بعناية وبعد إجراء جلستين تدريبيتين (~ 50 ألياف لكل جلسة) لتحقيق معيار معقول. تخضع جميع الألياف التي تم جمعها ل MyDoBID لتحديد نوع الألياف ، مما سيكشف عن مدى فعالية تنفيذ التقنية. سينظر إلى هذا على أنه عدد منخفض من إشارة MH.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
تم تطوير الأجسام المضادة ضد MHC I (A4.840) و MHCIIa (A4.74) المستخدمة في هذه الدراسة من قبل الدكتور H. M. Blau وتم تطوير الجسم المضاد ضد MHCIIx (6H1) من قبل الدكتور C. A. Lucas وتم الحصول عليه من بنك الدراسات التنموية Hybridoma (DSHB) ، وذلك بفضل رعاية المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وتحتفظ به جامعة أيوا ، قسم العلوم البيولوجية (أيوا سيتي ، IA). نشكر Victoria L. Wyckelsma على تقديم عينات العضلات البشرية لهذه الدراسة. تم الحصول على غالبية الصور في الشكل 1 من BioRender.com.
التمويل:
ولم تتلق هذه الدراسة أي تمويل خارجي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1x المخزن المؤقت لتغيير طبيعة | الطبيعة اصنع وفقا للوصفة | يمكن الحصول على المكونات من Sigma-Aldrich أو شركات توزيع المواد الكيميائية الأخرى | ؛ يتم إجراء 1x المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة عن طريق تخفيف 3x المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة 1 في 3 V / V مع 1X Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. |
| 3x المخزن المؤقت لتغيير طبيعة | الطبيعة اصنع وفقا للوصفة | يمكن الحصول على المكونات من Sigma-Aldrich أو غيرها من الموزعين الكيميائيين يحتوي | 3x denatturing buffer على: 0.125M Tris-HCI ، 10٪ جلسرين ، 4٪ SDS ، 4 M يوريا ، 10٪ 2-mercaptoethanol ، و 0.001٪ بروموفينول أزرق ، درجة الحموضة 6.8. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية. |
| 95٪ من الإيثانول | N / A | 100٪ من أي شركة | مخففة إلى 95٪ باستخدام H2< / sub>O فائق النقاء. |
| الأكتين أرنب الأجسام المضادة متعددة النسيلة | سيجما-ألدريتش | A2066 | تخفيف 1 في 1,000 مع المخزن المؤقت BSA. |
| الموازين التحليلية | Mettler Toledo | رقم الموديل: MSZ042101 | |
| محسن الأجسام المضادة | Thermo Fischer Scientific | 32110 | اسم المنتج هو Miser Antibody Extender Solution NC. |
| دورق (100 مل) | N / A | N / A | |
| جهاز طرد مركزي | Eppendorf | 5452 | اسم الموديل: Mini Spin. |
| المخزن المؤقت للحظر: 5٪ حليب خالي الدسم في محلول الغسيل. | تم شراء | الدبلوم | |
| من BSA المخزن المؤقت: 1٪ BSA / PBST ، 0.02٪ NaN3< / sub> | BSA: Sigma-Aldrich PBS: مختبرات Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: | ألبومين مصل الأبقار S2002 (BSA) ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، وأزيد الصوديوم (NaN3). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| رافعة فتح الكاسيت | مختبرات بيو | 4560000 | تستخدم لفتح أشرطة الجل مسبقة الصب. |
| Chemidoc MP Imager | مختبرات بيو راد | رقم الموديل: غطاء المحرك العالمي III | أي نظام تصوير مزود بإمكانيات تصوير جل خال من البقع. |
| Criterion blotter | Bio-Rad | 1704070 | تتضمن عبوة ثلج ، وصينية نقل ، وبكرة ، و 2 حامل كاسيت ، وورق ترشيح ، ووسادات إسفنجية وغطاء مع كابلات. |
| خلية معيار (Bio-Rad) | مختبرات Bio-Rad | 1656001 | |
| ECL (التلألؤ الكيميائي المعزز) | مختبرات Bio-Rad | 1705062 | اسم المنتج: ركيزة Clarity Max Western ECL. |
| عازلة الرحلان الكهربائي 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | تمييع 10x TGS 1 في 10 مع H2< / sub>O. |
| ورق ترشيح ، سمك 0.34 مم | Whatmann | 3030917 | حجم السائب 3 مم ، عبوة 100 ورقة ، 315 × 335 مم. |
| ملقط تشريح الأنسجة الدقيقة | Dumont | F6521-1EA | Jeweller' ملقط رقم 5. |
| صينية / غطاء بلاستيكي مسطح | N / A | N / A | كبير بما يكفي لوضع الغشاء عليه. تأكد من أن السطح مسطح تماما. |
| نظام التجفيف بالتجميد | Labconco | 7750030 | المنطقة الحرة 4.5 لتر مع مرحلة عينة الغرفة الزجاجية. |
| فريزر -80 oC | N / A | N / A | أي فريزر بدرجة حرارة ثابتة -80 درجة ؛ C مناسب. |
| 1653320 محررات الجل | Bio-Rad | Slide تحت الغشاء لجمع الغشاء أو تحريكه. | |
| قلم رصاص رمادي | N / A | N / A &NBSP | |
| ؛ برامج مختبر الصور | Bio-Rad Laboratories | Figures | إلى إصدار البرنامج 5.2.1 ولكن يمكن استخدام إصدارات أخرى. |
| حاضنة | مختبرات بيو | راد 1660521 | أي حاضنة يمكن ضبطها على 37 درجة ؛ C يكفي. |
| مصباح | N / A | N / A | |
| النمام المغناطيسي مع البراغيث | N / A | N / A | |
| بكرة غشاء ؛ | مختبرات بيو | راد 1651279 | في حزمة النقل. ومع ذلك ، إذا لم يكن هذا المنتج متاحا ، فإن أي أنبوب أسطواني أملس السطح طويل بما يكفي للتدحرج فوق الغشاء سيكون كافيا. |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (0.6 مل) | N / A | N / A | |
| الماوس IgG HRP الثانوي | Thermo Fisher Scientific | 31430 | الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، RRID AB_228341. خفف عند 1 في 20,000 في المخزن المؤقت للحظر. |
| الماوس IgM HRP الثانوية | Abcam | ab97230 | IgM IgM المضادة للفأر. استخدم في نفس التخفيف مثل IgG للماوس. |
| الميوسين السلسلة الثقيلة I (MHCI) الجسم المضاد الأساسي | DSHB | A4.840 | نطاق التخفيف: 1 في 200 إلى 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA. |
| الميوسين الثقيلة سلسلة IIa (MHCIIa) الجسم المضاد الأساسي | DSHB | A4.74 | نطاق التخفيف: 1 في 200 إلى 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA. |
| تخفيف الجسم المضاد الأساسي للسلسلة الثقيلة من الميوسين الثقيلة IIx (MHCIIx | ): 1 في 200 إلى 1 في 500 في المخزن المؤقت BSA. | ||
| غشاء النيتروسليلوز 0.45 & ميكرو; m | مختبرات بيو | 1620115 | للنشاف الغربي. |
| غطاء طبق بتري | N / A | N / A | |
| ملاقط بلاستيكية | N / A | N / A | |
| Power Pack ؛ | مختبرات Bio-Rad | 164-5050 | اسم المنتج: مصدر الطاقة الأساسي. |
| سلم البروتين | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler سلم البروتين الملون ، من 10 إلى 180 كيلو دالتون. |
| غشاء PVDF 0.2 & micro; م | مختبرات Bio-Rad | 1620177 | |
| Rabbit HRP الثانوية | Thermo Fisher Scientific | 31460 | الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) ، RRID AB_228341. التخفيف مثل الأجسام المضادة الثانوية للفأر. |
| الروك | N / A | N / A | |
| المسطرة | N / A | N / A | |
| مقص | N / A | N / A | |
| مجهر مجسم | Motic | SMZ-168 | |
| تجريد العازلة | Thermo Fisher Scientific | 21059 | اسم المنتج: استعادة المخزن المؤقت لتجريد اللطخة الغربية. |
| مناديل (خالية من الوبر) | كيمبرلي كلارك المهنية | 34120 | اسم المنتج: Kimwipe. |
| عازلة النقل (1x Tris Glycine buffer (TG) ، 20٪ ميثانول) TG | : Bio-Rad Laboratories ؛ الميثانول: | Merck TG buffer: 1610771 الميثانول: 1.06018 | مخفف 10x TG مع H2O فائق النقاء إلى 1x. أضف 100٪ ميثانول إلى التركيز النهائي 20٪ من الميثانول. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| صينية نقل | مختبرات Bio-Rad | 1704089 | |
| جل مسبقة الصب للأشعة فوق البنفسجية | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | نوع الجل: 4 & ndash ؛ 15٪ Criterion TGX جل بروتين خال من البقع ، 26 بئر ، 15 ميكرو لتر. |
| Vortex | N / A | N / A | |
| عازلة غسيل (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific ؛ Tween 20: Sigma | وصفة BIOA0027-4 لتر | 1x TBST: يتم تخفيف 10x Tris-buffered Saline (TBS) إلى 1x مع H2< / sub>O فائق النقاء ، يضاف Tween 20 إلى التركيز النهائي 0.1٪. مخزن المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية. |
| حاويات الغسيل اشترى | متجر | Sistema | أي حاوية tupperware ، التي تناسب الأبعاد التقريبية للغشاء ستكون كافية. |
المراجع
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and huma....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
