Method Article

تقنية نقل عكسي عكسية قائمة على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر للاستكشاف السريع لنسب الحمض النووي

DOI:

10.3791/65766

⸱

December 8th, 2023

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة للنقل العكسي المتعدد للخلايا الجذعية الجنينية للفأر أثناء الزراعة باستخدام وسائط 2i و LIF. تنتج هذه الطريقة قابلية وكفاءة أعلى من بروتوكولات النقل الأمامية التقليدية ، مع تمكين تحسين نسب البلازميد في وعاء واحد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لبساطته النسبية وسهولة استخدامه ، أصبح النقل العابر لخطوط خلايا الثدييات بالأحماض النووية دعامة أساسية في البحوث الطبية الحيوية. في حين أن معظم خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع لديها بروتوكولات قوية للانتقال في ثقافة ثنائية الأبعاد ملتصقة ، فإن هذه البروتوكولات غالبا لا تترجم جيدا إلى خطوط أقل دراسة أو تلك التي تحتوي على أشكال غير نمطية يصعب نقلها. باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات للفأر المزروعة في وسائط 2i / LIF ، وهو نموذج استزراع يستخدم على نطاق واسع للطب التجديدي ، تحدد هذه الطريقة بروتوكول نقل عكسي محسن وسريع قادر على تحقيق كفاءة نقل أعلى. بالاستفادة من هذا البروتوكول ، يتم إجراء نقل متعدد ثلاثي البلازميد ، مع الاستفادة من الكفاءة الأعلى من المعتاد في توصيل البلازميد لدراسة نطاق موسع من القياس الكيميائي للبلازميد. يسمح بروتوكول النقل المتعدد العكسي هذا بطريقة تجريبية ذات وعاء واحد ، مما يمكن المستخدمين من تحسين نسب البلازميد في بئر واحد ، بدلا من العديد من عمليات النقل المشتركة. من خلال تسهيل الاستكشاف السريع لتأثير القياس الكيميائي للحمض النووي على الوظيفة العامة للدوائر الجينية المسلمة ، يقلل هذا البروتوكول من وقت وتكلفة نقل الخلايا الجذعية الجنينية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توصيل الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى خلايا الثدييات بمثابة ركيزة أساسية للبحوث الطبية الحيوية1. طريقة شائعة لإدخال الأحماض النووية الخارجية (NA) في خلايا الثدييات هي من خلال النقل العابر 2,3. تعتمد هذه التقنية على خلط NA مع كواشف النقل المتاحة تجاريا القادرة على توصيلها إلى الخلايا المتلقية. عادة ، يتم تسليم NA عن طريق النقل الأمامي ، حيث تتلقى الخلايا الملتصقة بسطح ثنائي الأبعاد مجمع النقل. في حين أن النقل الأمامي لخطوط الخلايا الراسخة الأكثر شيوعا قوي والبروتوكولات منشورة جيدا ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ذات الأشكال غير أحادية الطبقة لا تنتقل بسهو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكواشف لثقافة mPSC

  1. تحضير ملحق N2.
    1. في الظروف غير المعقمة، قم بإعداد محاليل المخزون التالية (الخطوة 1.1.1.1) في غطاء دخان السلامة الكيميائية. أضف المسحوق الصلب لكل مادة كيميائية إلى أنبوب مخروطي الوزن مسبقا سعة 50 مل. وزن كل أنبوب بعد إضافة المسحوق وإضافة كمية مناسبة من المذيب لتحقيق التركيزات أدناه. بالنسبة لدفعة واحدة من الوسائط ، قم بإعداد الحد الأدنى للمبلغ المدرج.
      ملاحظة: الكواشف التالية خطرة ويجب التعامل معها وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المحلية. تأكد من معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند المناولة ، واعمل فقط مع أشكال المسحوق الصلب لهذه المواد الكيميائية في غطاء دخان كيميائي لمنع الاستنشاق.
      1. الحد الأدنى من 0....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد كل من عمليات النقل الأمامية والعكسية على التفاعل بين غشاء الخلية ومجمعات كاشف الحمض النووي الوارد ، مما يسمح بتوصيل NA إلى الخلايا المستقبلة. حيث تختلف هذه التقنيات هي حالة الخلية عند الولادة - بينما يتم تسليم الحمض النووي عادة إلى أحاديات الخلايا الملتصقة في النقل الأمامي التقليدي ، يعتمد النقل العكسي بدلا من ذلك على التقاء مركب الكاشف والحمض النووي بالخلايا أثناء تعليق خلية واحدة. يمكن أن يكون هذا الاختلاف حاسما بشكل خاص في المواقف التي لا تنمو فيها الخلايا كطبقة أحادية موحدة ومسطحة وبدلا من ذلك تتبنى مورفولوجيا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن الأسباب الرئيسية لاعتماد بروتوكولات النقل على نطاق واسع إمكانية استنساخها وإمكانية الوصول إليها؛ ومع ذلك ، تتطلب هذه البروتوكولات التحسين عبر السياقات التجريبية. لم يذكر أعلاه هو الاختبار القياسي المطلوب عند محاولة نقل خط خلية جديد لأول مرة. أولا ، يعد اختيار كاشف النقل أمرا أساسيا ، حيث أن الكواشف المتاحة تجاريا ليست مقاسا واحدا يناسب الجميع وستختلف في كفاءة صلاحية توصيل NA عبر أنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب العثور على الكمية المثالية من NA وكاشف النقل ، بالإضافة إلى النسبة المثلى ، اختبارا. غالبا ما يكون ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون الاعتراف بالعديد من المساهمات في هذا المجال التي لم يتم ذكرها في هذا العمل بسبب قيود المساحة ، وكذلك وكالات التمويل التي أتاحت هذه الفرصة. يقر المؤلفون بالتمويل المقدم من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، التي دعمت هذا العمل. حصل KM على منحة CGS-M من NSERC ومنحة Killam للدكتوراه من جامعة كولومبيا البريطانية. N.S. هو الحائز على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية BC Scholar.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase MilliporeSigmaSCR005
Apotransferrin MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 الملحق  ThermoFisher Scientific 17504044
بيتا ميركابتو إيثانولThermoFisher Scientific 21985023
كسر BSA V (7.5٪)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
حبات توحيد قياس التدفقالخلوي SpherotechURCP-38-2K
الجيلاتين  MilliporeSigmaG1890
مكمل GlutaMAX  ThermoFisher Scientific 35050061
الأنسولين جيبكو12585-0014
ليبوفاكتامين 2000   ;Invitrogen11668-019كاشف النعداء
الوسائط العصبيةالقاعدية ThermoFisher Scientific  21103049
OptiMEM Invitrogen31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
ProgesteroneMilliporeSigmaP8783المخاطر الكيميائية - استشر إرشادات السلامة المحلية ، وتأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، والعمل مع شكل مسحوق صلب فقط في غطاء الدخان الكيميائي
PutrescineMilliporeSigmaP6780الخطر الكيميائي - استشر إرشادات السلامة المحلية ، وتأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، والعمل مع شكل مسحوق صلب فقط في غطاء
الدخان الكيميائيمؤتلف mLIF BioTechne8878-LF-500 / CF
سيلينيت الصوديوم  MilliporeSigmaS5261-25Gالمخاطر الكيميائية - استشر إرشادات السلامة المحلية ، وتأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، والعمل مع شكل مسحوق صلب فقط في غطاء الدخان
الكيميائي Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific   ؛25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reverse Poly TransfectionMouse Embryonic Stem CellsNucleic Acid RatiosPlasmid DeliveryTransient TransfectionGene DosageFlow CytometryPluripotent Stem CellsDNA StoichiometryLipofectamine Transfection

Related Articles