مقالة منهجية

عزل وزراعة وتوصيف الخلايا الجذعية لب الأسنان من الأسنان اللبنية والدائمة البشرية

3.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65767

⸱

مايو 17, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

في هذه المقالة

ملخص

يؤكد هذا البروتوكول على استخراج وثقافة وحفظ الخلايا الجذعية متعددة القدرات من لب الأسنان من خلال الهضم الأنزيمي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوضح قدرتها على التمايز إلى بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية ، مما يسلط الضوء على أهمية الدقة والاتساق في العملية.

الملخص

في مجال الطب التجديدي والتطبيقات العلاجية ، تكتسب أبحاث الخلايا الجذعية زخما سريعا. برزت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) ، الموجودة في كل من الأسنان اللبنية والدائمة ، كمصدر حيوي للخلايا الجذعية نظرا لإمكانية الوصول إليها وقدرتها على التكيف وقدرات التمايز الفطرية. توفر DPSCs خزانا وفيرا ومتاحا بسهولة من الخلايا الجذعية الوسيطة ، مما يعرض تنوعا وإمكانات رائعة ، خاصة لأغراض التجدد. على الرغم من وعدهم ، تكمن العقبة الرئيسية في عزل وتوصيف DPSCs بشكل فعال ، نظرا لتمثيلهم ككسر دقيق داخل خلايا لب الأسنان. نفس القدر من الأهمية هو الحفاظ السليم على هذا المورد الخلوي الذي لا يقدر بثمن. الطريقتان السائدتان لعزل DPSC هما الهضم الأنزيمي (ED) والنمو من نباتات الأنسجة (OG) ، وغالبا ما يشار إليها باسم النمو التلقائي. يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على نهج الهضم الأنزيمي لعزل DPSC ، مع تفصيل الخطوات التي تشمل الاستخراج والمعالجة داخل المختبر والحفاظ على الخلايا. بالإضافة إلى الاستخراج والحفظ ، يتعمق البروتوكول في براعة التمايز ل DPSCs. على وجه التحديد ، يحدد الإجراءات المستخدمة لحث هذه الخلايا الجذعية على التمايز إلى خلايا دهنية ، بانيات عظمية ، وخلايا غضروفية ، وعرض سماتها متعددة القدرات. يسهل الاستخدام اللاحق لتقنيات التلوين اللوني التصور الدقيق وتأكيد التمايز الناجح ، وبالتالي التحقق من عيار ووظائف DPSCs المعزولة. يعمل هذا البروتوكول الشامل كمخطط يشمل مجموعة كاملة من استخراج الخلايا الجذعية لب الأسنان وزراعتها وحفظها وتوصيفها. إنه يؤكد على الإمكانات الكبيرة التي تؤويها DPSCs ، مما يدفع استكشاف الخلايا الجذعية إلى الأمام ويبشر بالاختراقات التجديدية والعلاجية المستقبلية.

المقدمة

ازدهرت أبحاث الخلايا الجذعية في العلوم الطبية الحيوية بسبب تطبيقاتها الواعدة في الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. جذبت الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) ، المشتقة من أنسجة اللب لكل من الأسنان اللبنية البشرية والدائمة ، اهتماما كبيرا كمصدر للخلايا الجذعية نظرا لتوافرها الجاهز وقدرتها المتعددة 1,2. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الشحمية ، وبانيات العظم ، والخلايا الغضروفية ، كما أكدت العديد من الدراسات3.

على مدى العقود القليلة الماضية ، ارتفعت الأبحاث والتطبيقات العلاجية للخلايا الجذعية. تتطلب الإمكانات التوسعية للخلايا الجذعية تنويع المصادر التي يتم الحصول عليها منها. هناك عدة عوامل تؤثر على كفاءة الخلايا المختارة وقابليتها للحياة وجذعها. على الرغم من وجود العديد من خزانات الخلايا الجذعية المعروفة ، مثل نخاع العظام والأنسجة الدهنية ، فإن الإجراءات الغازية ، ومراضة الموقع ، والمخاوف الأخلاقية المرتبطة بهذه المصادر غالبا ما تحد من استكشافها 4,5. من بين مصادر الخلايا الجذعية المختلفة ، اكتسبت الخلايا الجذعية السنية الاهتمام بسبب سهولة الوصول إليها ، واللدونة العالية ، والتطبيقات المحتملة المتنوعة. تم بحث الخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية ، على وجه الخصوص ، على نطاق واسع لآفاقها العلاجية6. الأسنان ، التي يتم التخلص منها عادة كنفايات طبية ، تحتوي على ثروة من الخلايا الجذعية الوسيطة7. يتطلب الحفاظ على هذا التجمع القيم للخلايا الجذعية جهودا جماعية من المرضى وأطباء الأسنان والأطباء لضمان عدم إهدار هذه الموارد ، مما يجعل كل خلية جذعية لب الأسنان متاحة لمتطلبات التجدد المستقبلية.

توجد الخلايا الجذعية المشتقة من لب الأسنان ، مثل الخلايا الجذعية لب الأسنان البالغة (DPSCs) والخلايا الجذعية من الأسنان اللبنية البشرية المقشرة (SHED) ، في مكانة حول الأوعية الدموية في لب الأسنان. يعتقد أن هذه الخلايا تنشأ من خلايا القمة العصبية القحفية وتظهر علامات مبكرة لكل من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) والخلايا الجذعية العصبية الظاهرة. أظهرت DPSCs و SHEDs تعدد القدرات والقدرة على تجديد أنواع الأنسجة المتنوعة8.

تشمل المصادر المحتملة للخلايا الجذعية السنية الأسنان اللبنية والدائمة الصحية. تشكل الخلايا الجذعية حوالي 1٪ فقط من إجمالي عدد الخلايا في اللب ، مما يسلط الضوء على أهمية تقنيات العزل والتوسع الفعالة9. وبالتالي ، فإن استخراج وتوسيع هذه الخلايا الجذعية هي خطوات محورية في عزل DPSC10. يجب تخزين الأسنان المستخرجة أو المقشرة في وسط نقل غني بالمغذيات ، مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول ملحي مخزن من هانكس (HBSS).

يمكن الحصول على لب الأسنان من خلال طرق مختلفة ، اعتمادا على نوع السن 7,11. بالنسبة للأسنان اللبنية ذات الجذور الممتصة ، يمكن إجراء الاستخراج عبر قمة الجذر. وبالمثل ، يمكن استخدام الدبابيس الشائكة المعقمة للحصول على اللب من الأسنان الدائمة ذات القمة المفتوحة غير الناضجة. في حالات الأسنان الدائمة ذات الجذور المتطورة بالكامل ، يتضمن الوصول إلى حجرة اللب فصل تاج الأسنان عن الجذر. يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع السن باستخدام قرص ماسي عند تقاطع المينا الأسمنتية. يكشف هذا الشق حجرة اللب ، مما يتيح استرجاع أنسجة اللب12،13،14.

يمكن عزل الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من خلال الهضم الأنزيمي (ED) أو النمو من نباتات الأنسجة (OG) ، والمعروف أيضا باسم النمو التلقائي. تستخدم طريقة الضعف الجنسي الإنزيمات ، في المقام الأول كولاجيناز I و dispase ، لتكسير الأنسجة إلى معلقات أحادية الخلية15,16. تستلزم طريقة OG ، أبسط وأسرع ، تقطيع شظايا اللب ووضعها مباشرة في لوحة مزرعة ، مما يسمح للخلايا بالنمو من الأنسجةالمزروعة 17. استخدم الباحثون وقارنوا كلتا التقنيتين لتقييم معدلات تكاثر الخلايا ، والحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية المعزولة ، والتمايز ، وتعبير علامات السطح18. يمكن أن يؤدي إنشاء وتوحيد بروتوكولات للحصول على DPSCs بكفاءة عالية وجذع إلى تمهيد الطريق لعلاجات فعالة وآمنة19. يشمل هذا البروتوكول استخراج DPSCs باستخدام الهضم الأنزيمي ، والمعالجة المعملية ، والحفظ ، وتمايز الخلايا مع تلطيخ لوني لتكوين الدهون ، وتكوين العظام ، وتكوين الغضروف.

يقدم البروتوكول الموضح في هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة ، بدءا من العزل الأولي للب الأسنان من السن ، متبوعا بزراعة وصيانة DPSCs في المختبر ، ويختتم بتوصيفها باستخدام علامات محددة للخلايا الجذعية (الشكل 1). كما تم وصف تقنيات تحفيز هذه الخلايا الجذعية في سلالات خلايا مختلفة ، مع تسليط الضوء على تعدد قدراتها.

البروتوكول

يتوافق البروتوكول المبين هنا مع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية (IRB ، مركز أبحاث Pushpagiri ، ولاية كيرالا). تم استخدام الأسنان المستخرجة وفقا للمعايير الأخلاقية لضمان نزاهة وكرامة وحقوق المشاركين. كان المشاركون الذين تم اختيارهم لهذه الدراسة من الأفراد الأصحاء الذين تقل أعمارهم عن 30 عاما والذين يحتاجون إلى قلع الأسنان لعلاج تقويم الأسنان. تم استبعاد أولئك الذين يعانون من تسوس الأسنان على نطاق واسع أو التهاب اللثة الحاد من الدراسة. تم جمع الأسنان اللبنية من الأطفال الذين يحتاجون إلى قلع الأسنان المحتجزة. كما تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص المشاركين في هذه الدراسة.

1. قلع ونقل الأسنان

  1. مجموعة من الأسنان اللبنية والدائمة
    1. اشرح للمشاركين الغرض من الإجراء والاستخدام المحتمل للأسنان المستخرجة لأغراض البحث.
    2. إجراء قلع الأسنان تحت التخدير الموضعي عن طريق إعطاء عامل مخدر بالقرب من السن المراد خلعه. على وجه التحديد ، تم حقن 1.75 مل من الليدوكائين الممزوج بالإبينفرين (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 200000 لهذه الدراسة. يفضل اختيار الأسنان التي لا تظهر تسوس الأسنان الشديد أو التهاب دواعم السن20,21.
  2. نقل الأسنان المقلوعة
    ملاحظة: يوصى بالعمل في ظروف معقمة لتجنب التلوث. ويشمل ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية ، مثل القفازات ومعطف المختبر ، والعمل في بيئة معقمة ، مثل غطاء التدفق الصفحي للمخاطر البيولوجية.
    1. بعد خلع السن ، اشطفه بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الدم والحطام الآخر. باستخدام ملقط معقم ومشرط ، قم بإزالة أي بقايا أنسجة رخوة متصلة بعناية من سطح السن (الشكل 2 أ).
    2. اغمر السن في محلول مطهر ، مثل 70٪ إيثانول ، لمدة 10 ثوان. بعد التطهير ، شطف السن مع برنامج تلفزيوني معقم لغسل أي مطهر متبقي.
    3. ضع السن في وعاء معقم يحتوي على وسيط النقل.
      ملاحظة: يتكون وسط النقل من Alpha-MEM ، وهو وسط استزراع تجاري مكمل بالمضادات الحيوية: 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين (انظر جدول المواد). زودت هذه الوسيلة العناصر الغذائية الأساسية للخلايا داخل السن المستخرج ، مما يضمن بقائها حتى المعالجة المختبرية. عملت المضادات الحيوية على تثبيط نمو البكتيريا.
    4. الحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية أثناء النقل لإبطاء أنشطة التمثيل الغذائي الخلوي وتأخير موت الخلايا. نقل السن إلى المختبر للخطوات التالية ، بما في ذلك معالجة وعزل الخلايا الجذعية لب الأسنان.

2. جمع أنسجة اللب

  1. قم بتأمين السن باستخدام ملقط الأسنان لضمان بقائه في مكانه أثناء العملية. استخدم قرصا ماسيا لقطع السن في قبضة الأسنان (انظر جدول المواد) المتصلة بمبرد ماء (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: الهدف هو كشف حجرة اللب دون التسبب في أضرار غير ضرورية لأنسجة اللب بداخلها.
  2. استخدم حفارة أسنان (انظر جدول المواد) لإزالة أنسجة اللب. تتيح هذه الأداة استخراج اللب دون إلحاق الضرر ، وبالتالي الحفاظ على صلاحية الخلايا الجذعية لب الأسنان (الشكل 2C).
  3. ضع الأنسجة التي تم الحصول عليها على طبق بتري الزجاجي. اغسل أنسجة اللب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات.

3. هضم أنسجة اللب وعزل الخلايا

  1. فرم الأنسجة والهضم
    1. باستخدام شفرة جراحية معقمة ، قم بفرم أنسجة اللب بعناية إلى أجزاء صغيرة (الشكل 2 د) وضعها في مطحنة أنسجة صغيرة مع برنامج تلفزيوني للحصول على خليط متجانس بدقة. تزيد هذه العملية من مساحة سطح الأنسجة ، مما يسهل عمل الإنزيم بشكل أكثر كفاءة أثناء الهضم.
    2. انقل شظايا الأنسجة المتجانسة المفرومة إلى أنبوب سعة 15 مل وهضمها إنزيميا باستخدام خليط من 3 مجم / مل كولاجيناز من النوع الأول و 4 مجم / مل ديسباز (انظر جدول المواد). تم إذابة هذه الإنزيمات في محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) لتحقيق التركيزات المطلوبة.
    3. احتضان أنسجة اللب في خليط الإنزيم (الخطوة 3.1.2) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتحييد الإنزيمات ، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (الخطوة 3.2.1) لمزيد من الثقافة.
  2. الطرد المركزي وإعادة التعليق
    1. بعد الحضانة ، انقل الأنسجة المهضومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بتدويرها عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا. تفصل هذه الخطوة الخلايا عن شظايا الأنسجة والإنزيمات المتبقية غير المهضومة. تخلص بعناية من الوسط الطافي ، مع التأكد من عدم إزعاج حبيبات الخلية في أسفل الأنبوب.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط استزراع جديد. يوفر هذا الوسط العناصر الغذائية والبيئة اللازمة للخلايا المعزولة للبقاء والتكاثر.

4. ثقافة الخلية

  1. تصفيح وحضانة الخلايا
    1. انقل الخلايا المعاد تعليقها بعناية إلى دورق مزرعة 25 سم².
      ملاحظة: يتم نقل جميع المواد من لب واحد إلى دورق واحد 25 سم2 ثقافة الخلية. يضمن حجم الوسائط من 5-7 مل تغطية كافية وتوافر المغذيات للخلايا. تأكد من أن وسط الاستزراع ل DPSCs هو وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ -20٪ (FBS) (انظر جدول المواد) لتوفير عوامل النمو اللازمة. علاوة على ذلك ، استكمل الوسط ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين لمنع التلوث البكتيري. تأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء القارورة لتعزيز النمو المتجانس.
    2. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  2. التغيير المتوسط ومراقبة التقاء
    1. قم بتغيير وسط الاستزراع كل 2-3 أيام لتوفير العناصر الغذائية الطازجة وإزالة النفايات الأيضية. للقيام بذلك ، استنشق بعناية الوسط القديم باستخدام ماصة مصلية معقمة واستبدلها بوسيط جديد.
    2. راقب بانتظام ثقافة الخلية تحت المجهر لتتبع نمو الخلايا والتحقق من أي علامات تلوث.
    3. استمر في هذه العملية حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، وهي النقطة التي تغطي فيها الخلايا معظم مساحة سطح القارورة ولكنها ليست مزدحمة بشكل مفرط.
  3. التربسين الخلوي وتمريره أو تجميده
    1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -90٪ ، قم بإزالة وسط المزرعة واغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الخلايا المتوسطة المتبقية وغير الملتصقة.
    2. أضف محلول 0.25٪ trypsin-EDTA إلى الدورق لفصل الخلايا عن سطح القارورة. احتضان لمدة 2-5 دقائق على 37 درجة مئوية حتى ترفع الخلايا.
    3. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع ، ثم قم بسحب تعليق الخلية برفق لأعلى ولأسفل لضمان انفصال الخلية بالكامل.
    4. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
    5. أعد تعليق الخلايا في وسط استزراع جديد وإما إعادة طلائها (مرور) لمزيد من النمو أو تجميدها لاستخدامها في المستقبل. عند التجميد ، استخدم وسيط تجميد يحتوي على مادة واقية من البرودة ، مثل DMSO ، لحماية الخلايا من التلف أثناء التجميد.

5. توصيف DPSCs

  1. تحليل التدفق الخلوي
    1. لتأكيد طبيعة الخلايا الجذعية الوسيطة للخلايا المعزولة ، قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي22,23. في البداية ، التربسين وجمع الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4.3.
    2. تحديد صلاحية الخلية من خلال تقنية استبعاد صبغة التريبان. قم بإجراء التحليل باستخدام محلل صلاحية الخلية (انظر جدول المواد)خلال المقطعين 2 و 8. إجراء تحليل النمط الظاهري عبر مقياس التدفق الخلويخلال الممرات 3 و 7.
    3. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي لإزالة الأجسام المضادة الزائدة وتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) ، و 1٪ -2٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 0.1٪ أزيد صوديوم (NaN3). يمنع FBS أو BSA الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة ، بينما يعمل أزيد الصوديوم كمادة حافظة. يجب أن تعبر نسبة عالية من الخلايا عن علامات الخلايا الجذعية الوسيطة وتفتقر إلى علامات المكونة للدم ، مما يؤكد هويتها على أنها DPSCs24.
    4. افصل DPSCs وقم بتلطيخها بالأجسام المضادة المناعية لتحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: يعتمد اختيار علامات تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على الإجماع الذي أنشأته الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) ، والذي ينص على أن MSCs يجب أن تعبر عن CD105 و CD73 و CD90 ، وتفتقر إلى التعبير عن CD45 أو CD34 أو CD14 أو CD11b أو CD79a أو CD19 و HLA من الفئةII 25. تستخدم هذه العلامات بشكل شائع في الدراسات التي تبحث في الخلايا الجذعية لب الأسنان26. يمكن أن تختلف تركيزات الأجسام المضادة للتلطيخ اعتمادا على الجسم المضاد المحدد المستخدم ، ويوصى باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) لتخفيفات الأجسام المضادة وظروف الحضانة25.
    5. وضع معايير التصنيف27,28 للتعبير عن علامات CD كما ذكر: أقل من 10٪ ، لا يوجد تعبير ؛ بين 11٪ و 40٪ ، تعبير منخفض ؛ نطاق من 41٪ إلى 70٪ ، تعبير معتدل ؛ فوق 71٪ ، تعبير عالي.
    6. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من عدم وجود علامات المكونة للدم عن طريق احتضان حصص خلية منفصلة مع الأجسام المضادة ضد CD34 و CD45.

6. تمايز متعدد السلالات

ملاحظة: تحدد الخطوات التالية بروتوكولات التمايز العظمي والشحمي والغضروفي للخلايا الجذعية السنية. ابدأ بزرع الثقافات بكثافة 1 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المغلفة بالفبرونيكتين مع وسط كامل (CM). راقب نمو الخلايا حتى يتم تحقيق التقاء 80٪ -90٪ قبل بدء بروتوكول التمايز المطلوب. لتقييم إمكانات التمايز متعدد السلالات ل DPSCs ، ابدأ عملية التمايز نحو بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية عن طريق زرع الخلايا في 24 صفيحة جيدة واستزراعتها في وسائط التمايز المناسبة.

  1. التمايز العظمي
    1. ابدأ بزراعة DPSCs في وسط نمو منتظم في ظل الظروف القياسية حتى تصل إلى التقاء 70٪ -80٪.
    2. قم بإزالة وسط النمو من الخلايا ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS. أضف وسط التمايز العظمي (ODM) إلى الخلايا.
      ملاحظة: يتكون ODM من ألفا الحد الأدنى من الوسط الأساسي (α-MEM) المكمل ب 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، 0.25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 10 مللي مول بيتا جليسيروفوسفات ، و 100 نانومتر ديكساميثازون (انظر جدول المواد).
    3. احتضان الخلايا في الوسط العظمي عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تغيير الوسط العظمي كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: بعد 14 إلى 21 يوما ، يجب أن تكون DPSCs متمايزة إلى خلايا تشبه بانيات العظم. يمكن تأكيد ذلك عن طريق التحقق من وجود زيادة في التعبير عن علامات خاصة ببانيات العظم ، مثل الفوسفاتيز القلوي ، أو باستخدام تقنيات التلوين للكشف عن المصفوفة المعدنية ، مثل تلطيخ Alizarin Red S.
    4. إصلاح الخلايا عن طريق احتضانها مع 70 ٪ من الإيثانول الجليد البارد لمدة 1 ساعة عند -20 درجة مئوية.
    5. قم بتلطيخ الخلايا الثابتة بمحلول تلطيخ 40 نانومتر Alizarin Red S (درجة الحموضة 4.2) في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10-15 دقيقة. تصور التلوين تحت المجهر لتأكيد التمايز العظمي (الشكل 3). تأكيد التمايز عن طريق تلطيخ الخلايا مع Alizarin Red S ، والذي يحدد رواسب الكالسيوم التي تدل على التمعدن29,30.
  2. التمايز الأديبوجيني
    1. كما هو مفصل في القسم السابق ، استزرع DPSCs في ظل الظروف القياسية في جو مرطب مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1x PBS. استبدل الوسط المغسول بوسط تمايز شحمي. يتكون هذا الوسط بشكل عام من DMEM ، 10٪ FBS ، 10 ميكروغرام / مل أنسولين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 200 ميكرومتر إندوميتاسين ، و 0.5 مللي متر IBMX (انظر جدول المواد).
    3. تغيير وسط التمايز كل 3-4 أيام. بعد حوالي 3 أسابيع ، اغسل DPSCs المتمايزة للدهون باستخدام PBS وقم بإصلاحها باستخدام 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بتلطيخ الخلايا الثابتة بالزيت الأحمر O (انظر جدول المواد) لتصور تراكم قطرات الدهون (الشكل 4). لمزيد من تأكيد التمايز الدهني ، قم بإجراء تحليل التعبير الجيني للعلامات الدهنية مثل غاما مستقبلات البيروكسيسوم المنشطة (PPARγ) والأديبونيكتين31,32.
  3. التمايز الغضروفي
    1. يتم استخدام مزارع DPSCs التي يتم الحفاظ عليها في جو مرطب مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية للتمايز الغضروفي. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
    2. نضح الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1x PBS. استبدل الوسط المغسول بوسط تمايز غضروفي ، والذي يحتوي عادة على نسبة عالية من الجلوكوز في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، و 1٪ ITS ، و 100 نانومتر ديكساميثازون ، و 50 ميكروغرام / مل أسكوربات -2-فوسفات ، و 40 ميكروغرام / مل من البرولين ، و 10 نانوغرام / مل تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGF-β3) (انظر جدول المواد).
    3. الحفاظ على الخلايا في وسط التمايز الغضروفي ، وتغيير الوسط كل 2-3 أيام. بعد حوالي ثلاثة أسابيع ، يجب أن تكون DPSCs قد تمايزت إلى خلايا تشبه الخلايا الغضروفية.
    4. إصلاح الخلايا عن طريق احتضانها مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت ، قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق الألسياني (انظر جدول المواد) وتصورها تحت المجهر لتأكيد التمايز الغضروفي (الشكل 5).
    5. تأكد من تمايز DPSCs إلى خلايا غضروفية باستخدام تقنيات مثل تلطيخ Alcian Blue للبروتيوغليكان أو تحليل التعبير الجيني للعلامات الغضروفية مثل aggrecan و SOX9 والكولاجين من النوع الثاني33,34.

النتائج

أسفر التنفيذ الناجح للبروتوكول المحدد عن خلايا جذعية لب الأسنان (DPSCs) قادرة على التمايز متعدد السلالات ، مما يدل على تعدد قدراتها.

مقايسات الجدوى
تم تقييم جدوى DPSCs باستخدام مقايسة استبعاد Trypan Blue في نقاط زمنية مختلفة. تظهر النتائج قابلية عالية باستمرار (أكبر من 95٪) طوال فترة الاستزراع ، مما يدل على متانة بروتوكول العزلة والثقافة لدينا.

مقايسات وحدة تشكيل المستعمرات (CFU)
تم إجراء فحوصات CFU لتقييم قدرة التجديد الذاتي ل DPSCs. تم طلاء تعليق خلية واحدة بكثافة منخفضة واستزراعه لمدة 14 يوما. ثم تم تلطيخ المستعمرات التي تشكلت وعدها. تظهر النتائج العديد من المستعمرات ، مما يشير إلى وجود نسبة عالية من الخلايا ذاتية التجدد داخل سكان DPSC.

وقت مضاعفة الخلية
تم حساب وقت مضاعفة الخلية بناء على منحنى نمو DPSCs. تم زرع الخلايا بكثافة محددة وعدها بانتظام لبناء منحنى نمو. ثم تم حساب وقت المضاعفة باستخدام مرحلة النمو الأسي للمنحنى. تظهر النتائج مضاعفة الوقت بما يتفق مع الوقت المبلغ عنه ل MSCs ، مما يشير إلى وجود مجموعة خلايا صحية وتكاثرية (الشكل 6).

تحليل التدفق الخلوي
أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن الغالبية العظمى من DPSCs (على سبيل المثال ، >95٪) كانت إيجابية ل CD90 و CD73 و CD105 ، مما يؤكد هويتها على أنها MSCs (الشكل 7). علاوة على ذلك ، كان أقل من 2٪ من الخلايا إيجابيا ل CD45 و CD34 و HLA-DR ، مما يؤكد عدم وجود تلوث كبير للخلايا المكونة للدم أو البطانية.

التمايز العظمي
عند الانتهاء من التمايز العظمي ، أظهرت الخلايا مصفوفة معدنية ، والتي يتم تصورها بواسطة تلطيخ Alizarin Red S (الشكل 3). يشير وجود اللون الأحمر في الخلايا الملطخة إلى الترسب الناجح لمصفوفة معدنية ، وهي سمة أساسية للتمايز العظمي. يمكن ربط عدم القدرة على تحقيق تلطيخ التمايز بنجاح بالتحديات التي تمت مواجهتها أثناء إجراء جمع العينات.

التمايز الأديبوجيني
أثناء التمايز الدهني ، تراكمت DPSCs قطرات الدهون ، مما يدل على تكوين الدهون. يمكن ملاحظة قطرات الدهون مع تلطيخ Oil Red O (الشكل 4). أدى التمايز الناجح إلى قطرات دهنية مصبوغة باللون البرتقالي والأحمر داخل الخلايا.

التمايز الغضروفي
أخيرا ، بعد التمايز الغضروفي ، أنتجت DPSCs الجليكوزامينوجليكان ، وهو مكون غضروفي مهم أكده تلطيخ Alcian Blue ، والذي يرتبط بهذه الجليكوزامينوجليكان. أظهرت الخلايا التي خضعت بنجاح لتكوين الغضروف لونا أزرق عند تلطيخها (الشكل 5).

قد تكون الخلايا التي فشلت في إظهار تغيرات اللون المعنية في إجراءات التلوين بسبب التمايز دون المستوى الأمثل ، ربما بسبب مشكلات في وسائط التمايز أو الجودة الأولية ل DPSCs. من المهم ضمان جودة الوسائط والمكملات الغذائية وصحة وعدد مرور DPSCs المستخدمة. إن التمايز الناجح ل DPSCs إلى بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية يتحقق من صحة الطبيعة متعددة القدرات لهذه الخلايا ويؤكد إمكاناتها في الطب التجديدي والتطبيقات العلاجية.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على عزل الخلايا الجذعية لب الأسنان وتوصيفها وتمايزها. يوفر هذا الشكل تمثيلا تخطيطيا لسير العمل لعزل وتوصيف وتمييز الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs). تبدأ العملية باستخراج السن (أو الأسنان) ، يليها عزل أنسجة اللب ، والتي يتم اشتقاق DPSCs منها. بعد العزلة ، تخضع DPSCs لاختبارات توصيف مختلفة لتأكيد هوية الخلايا الجذعية وتقييم صلاحيتها ومعدل انتشارها والسمات الرئيسية الأخرى. تتضمن المرحلة الأخيرة الممثلة في هذا الشكل تحريض التمايز؛ حيث تعامل DPSCs بعوامل محددة لتوجيه تحولها إلى أنواع خلايا متخصصة، مثل بانيات العظم أو الخلايا الشحمية أو الخلايا الغضروفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: استرجاع اللب من الأسنان المقلوعة. (أ) سن مستخرج معد لاستخراج أنسجة اللب. (ب) تقسيم السن المستخرج باستخدام بر الماس. ج: إزالة أنسجة اللب من حجرة اللب. د: تفتيت أنسجة اللب باستخدام شفرة جراحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التمايز العظمي للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) كما يتضح من تلطيخ Alizarin Red S (40x). يكشف التلوين الأحمر الفاتح عن ترسب المصفوفة المعدنية ، وهي سمة مميزة لبانيات العظم ، مما يؤكد التمايز العظمي الناجح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التمايز الأديبوجيني للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) الذي أظهره تلطيخ Oil Red O. يمثل وجود قطرات حمراء زاهية تراكم الدهون ، وهي السمة المميزة للخلايا الشحمية ، مما يؤكد التمايز الشحمي الناجح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) الذي أظهره تلطيخ ألسيان الأزرق (40x). يشير اللون الأزرق المكثف إلى وجود مصفوفة خارج الخلية غنية بالبروتيوغليكان ، وهي سمة من سمات الخلايا الغضروفية ، مما يؤكد التمايز الغضروفي الناجح. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: وقت مضاعفة الخلايا للخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs). يوضح هذا الشكل منحنى نمو DPSCs بمرور الوقت. تم زرع الخلايا في البداية بكثافة محددة ، وتم أخذ عدد الخلايا على فترات منتظمة (ممثلة على المحور السيني) لمراقبة معدل الانتشار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تعبير علامة سطح الخلايا الجذعية في مزرعة DPSC. يوضح هذا الشكل التعبير عن علامات سطحية محددة على DPSCs. تظهر علامات الخلايا الجذعية الوسيطة CD44 و CD90 و CD105 مستويات عالية من التعبير ، مما يشير إلى وجود صفات اللحمة المتوسطة في هذه الخلايا. على العكس من ذلك ، فإن التعبير عن علامات المكونة للدم (CD34 و CD45) وجزيء معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية (HLA-DR) يكاد لا يكاد يذكر ، مما يؤكد عدم وجود خلايا سلالة المكونة للدم في الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يحدد البروتوكول عزل وثقافة وتوصيف الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من الأسنان اللبنية والدائمة البشرية. يتضمن وصفا لتخزين وتكاثر هذه الخلايا ، بالإضافة إلى تقييم إمكانية تمايزها في المختبر إلى بانيات العظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية35.

أظهر Chen et al.36 أنه يمكن الحصول على الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) من مصادر مختلفة ، بما في ذلك الأسنان البشرية الحيوية المصابة بحالات مثل التهاب دواعم السن ، وارتشاف الجذر ، والتهاب التامور ، وكسور الأسنان ، وكذلك الأسنان الزائدة عن العدد والمنحرفة. تم تأكيد هذه النتيجة بشكل أكبر من خلال الدراسات اللاحقة التي حددت الأسنان الحيوية المصابة كمصادر محتملة ل DPSCs37،38،39،40. ومع ذلك ، أشار Bernardi et al.10 إلى أن زيادة ارتشاف الجذر يمكن أن يؤثر بشكل ضار على صلاحية هذه الخلايا الجذعية. هناك عقبة كبيرة في هذه العملية تتمثل في الحفاظ على الخلايا ومنع تدهورها ، والذي يبدأ مباشرة بعد قلع الأسنان أو تقشيرها. علاوة على ذلك ، من المهم ملاحظة أنه لا ينبغي استخدام الأسنان المتأثرة بحالات قاسية مثل الخراجات حول الذروة أو الأورام أو الخراجات لاستخراج الخلايا الجذعية40,41.

يمكن الحصول على DPSCs من خلال تقنية الهضم الأنزيمي (ED) أو طريقة النمو من زراعة الأنسجة (OG) ، والمعروفة أيضا باسم تقنية النمو التلقائي14,15. يستخدم الباحثون هذه الاستراتيجيات للتحقيق في كفاءة تكاثر الخلايا أو الحفاظ على السمات المورفولوجية والنمط الظاهري للخلايا الجذعية المعزولة17. وجدت الدراسات أن الخلايا الجذعية المعزولة عن طريق طريقة OG تظهر معدل انتشار أبطأ وتعبيرا أضعف عن علامات الخلايا الجذعية18. على العكس من ذلك ، أظهرت DPSCs المعزولة من خلال طريقة الضعف الجنسي انتشارا وتمايزا وتعبيرا متزايدا عن علامات سطحية إضافية أسرع من تلك المعزولة بطريقة OG. ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا الجذعية غير الناضجة لب الأسنان (IDPSCs) المستخرجة من الأسنان اللبنية باستخدام تقنية OG أظهرت أن زراعة الخلايا شجعت على الانتشار الانتقائي ل IDPSCs ، وبالتالي منع التمايز المبكر42.

يعد تنقية DPSCs أمرا بالغ الأهمية للحصول على خلايا عالية التجدد ويتطلب علامات خلايا محددة. يتم إجراء اختيار الخلية باستخدام طرق فرز الخلايا الفلورية أو المنشطة مغناطيسيا. إلى جانب العلامات المذكورة أعلاه ، يتم أيضا استخدام العديد من المستضدات السطحية الأخرى بسبب الطبيعة غير المتجانسة لكالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي43. ومع ذلك ، لم يتم تحديد علامة واحدة لفصل المجموعات السكانية الفرعية.

بالمقارنة مع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام ، تم التعرف على DPSCs كمصدر واعد للخلايا متعددة القدرات بسبب إمكاناتها متعددة السلالات44. من المحتمل أن يكون هذا الجذع نتيجة لعدم النضج النسبي للأنسجة المصدر ، حيث أن ضروس العقل ، التي غالبا ما تكون مصدر قلع DPSCs ، هي آخر الأسنان الدائمة التي تتطور وبالتالي فهي أقل نضجا من نخاع العظم45. يستكشف هذا البروتوكول بنجاح الطبيعة متعددة القدرات للخلايا الجذعية لب الأسنان عن طريق حث هذه الخلايا على الخضوع لتكوين الدهون وتكوين العظم وتكوين الغضروف. والجدير بالذكر أن DPSCs هي نوع الخلايا الوحيد الذي ينظم تعبير DSPP عند استزراعه في ظل ظروف عظمية المنشأ ، مما يدل على تمايزها المستقبلي إلى الأرومات السنية46.

تعرض الخلايا الجذعية السنية ، المعزولة من مصادر مختلفة ، العديد من إمكانات الانتشار والتمايز47. أثرت الخطوات الكبيرة التي تحققت في الأنظمة المختبرية بشكل عميق على بيولوجيا الخلايا الجذعية وعلاجاتها. على الرغم من هذه التطورات ، لا تزال هناك تحديات عند ترجمة علاجات الخلايا الجذعية من مقاعد البدلاء إلى السرير. يجب إيلاء اهتمام خاص لبقاء واستقرار الخلايا الجذعية لضمان أن تقنيات الحفظ لا تضر بصلاحية هذه الخلايا. في حين أن أبحاث الخلايا الجذعية السنية قد أسفرت عن نتائج واعدة في النماذج الحيوانية ، إلا أن هناك حاجة ملحة لتوسيع نطاق هذه النتائج لتشمل التجارب البشرية. من خلال الاستمرار في دفع البحث والتطوير الصارم ، تستعد الخلايا الجذعية للأسنان للعب دور كبير في تطوير مجال بنك الخلايا الجذعية.

بينما يستخدم على نطاق واسع ، فإن نهج الهضم الأنزيمي لعزل الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) يقدم العديد من القيود. قبل كل شيء ، يمكن أن تؤثر العملية على صلاحية الخلية ، حيث يمكن للإنزيمات مثل الكولاجيناز و dispase أن تلحق الضرر عن غير قصد بأغشية الخلايا ، مما ينتج عنه عدد أقل من الخلايا الجذعية الحية17. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تؤدي هذه الطريقة إلى تدهور المصفوفة الحيوية خارج الخلية (ECM) ، وهو أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على الخصائص المتأصلة للخلايا الجذعية48. قد يغير الإجراء أيضا علامات سطح الخلية ، مما يعوق التحديد الدقيق وتوصيف DPSCs43. وبعيدا عن هذه القيود البيولوجية، فإن هذا النهج يستغرق وقتا طويلا، مما يزيد من مخاطر التلوث الميكروبي بسبب الحضانة المطولة عند 37 درجة مئوية. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي عدم الاتساق بين دفعات الإنزيم إلى نتائج متغيرة ، مما يتحدى قابلية استنساخ إجراء العزل. لا يمكن التغاضي عن العبء المالي ، لأن الإنزيمات عالية الجودة المناسبة لهضم الأنسجة باهظةالثمن 49. علاوة على ذلك ، قد تشهد آثار الهضم نشاطا إنزيميا متبقيا يمكن أن يؤثر بشكل ضار على مزارع الخلايا ، مما يؤثر على صحتها وانتشارها وتمايزها. أخيرا ، قد تؤدي إمكانية الهضم الأنزيمي لعزل بعض المجموعات السكانية الفرعية DPSC بشكل تفضيلي على الآخرين إلى تحريف تجمع الخلايا الناتج عن غير قصد ، مما يؤثر على إمكاناتها العلاجية50.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور ماثيو مازافانشيريل ، مدير ورئيس مركز أبحاث بوشباغيري في ثيروفالا ، لدعمه في توثيق الإجراءات في مركز الأبحاث.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-isobuty-l-methyl-xanthine شركة سيجما ألدريتش سانت لويس ، ميزوري 63103.USAI5879
حمض الخليك   ؛Sigma-Aldrich سانت لويس ، MO 63103.USAAS001
Alcian Blue   ؛شركة Sigma-Aldrich Co. St. Louis، MO 63103.USARM471
Alizarin Red S Staining Co. St. Louis، MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase - Staining KitThermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، USA
Alpha Minimum Essential Medium (&alpha ؛ -MEM)   ؛ثيرمو فيشر العلمي ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةGibco
Alpha الحد الأدنى من الوسط الأساسي (&alpha ؛ -MEM)  ثيرمو فيشر العلمي ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةGibco
Alpha-MEM ، أو Alpha MinimumEssential Medium Thermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، USAGibco
Alpha-MEM ، أو Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، USAGibco
Antibiotic / Anti MycoticSigma-Aldrich Co. سانت لويس ، MO 63103.USAP4333
شركة Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. سانت لويس ، MO 63103.USA012-04802
بيتا جليسيروفات   ؛شركة Sigma-Aldrich Co. St. Louis ، MO 63103.USAG9422-10G
خزانة السلامة الحيوية - غطاء التدفق الصفحيLabconco Corporation ، MO 64132-2696 ، الولايات المتحدة الأمريكية
CD90 ، CD105 ، CD73 ، CD34 ، CD45 ، و HLA-DRBioLegend ، Inc.CA 92121 ، مصفاة
(70 & micro ؛ م )مختبرات هاي ميديا  Ltd.Mumbai ، الهندTCP025مصفاة الخلية
الطرد المركزيREMI Elektrotechnik Limited (REMI) أجهزة
الطرد المركزيHiMedia Laboratories   ؛ Ltd.Mumbai ، الهند1101 | 1102
CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
Collagenase من النوع الأولWorthington Biochem. Corp. NJ 08701 ، الولايات المتحدة الأمريكية
كولاجيناز النوع الأولWorthington Biochem. Corp. NJ 08701 ، الولايات المتحدة الأمريكية
النمو الكامل متوسطمختبرات HiMedia   ؛ Ltd.Mumbai ، الهندAT006DMEM
أنابيب مخروطية (15 أو 50)Thermo Fisher Scientific ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية546021P / 546041P15 مل و 50 مل
حاوية تجميد CryoThermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية15-350-50
Cryolabelsتسمية الهند:
صناديق التخزين المبردة   ؛تخزين Cryostore
CryovialsThermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
Cryovials (1.8 مل) ThermoFisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةPW1282
قارورة ثقافية قائمة بذاتها (25 سم & sup2 ؛)Corning Inc.NY 14831 ، قوارير ثقافة الولايات المتحدة
الأمريكية مختبرات HiMedia   ؛ Ltd.Mumbai ، الهندTCG4 / TCG6T25 / T75
لوحات الثقافة HiMediaLaboratories   ؛ Ltd.Mumbai ، الهندTCP129 / TCP008للأسنان 60 مم / 100 مم
Komet SC 29730 ، الولايات المتحدة الأمريكيةKomet & nbsp ؛
حفارة ملعقة الأسنانBrasseler ، GA 31419 ، الولايات المتحدة الأمريكية5023591U0
ديكساميثازونشركة Sigma-Aldrich Co. سانت لويس ، MO 63103.USAD4902-25MG
ديكساميثوزونشركة سيجما ألدريتش سانت لويس ، ميزوري 63103.USAD4902-25MG
ديكساميثوزونشركة سيجما ألدريتش سانت لويس ، ميزوري 63103.USAD4902-25MG
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)شركة Sigma-Aldrich سانت لويس ، MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics ، مانهايم ، ألمانيا.
DispaseRoche Diagnostics GmbH ، مانهايم ، ألمانيا
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
الإيثانول (70٪)مختبرات هاي ميديا   ؛ Ltd.Mumbai ، الهندMB106
الإيثانول -70٪ثيرمو فيشر العلمي ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةملقط
الاستخراج العلمي فيشر   ؛Dentsply Sirona ، الولايات المتحدة الأمريكية
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc. ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةF2442-500ML
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ThermoFisher Scientific Inc. ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةF2442-500ML
مصل الأبقار الجنينية (FBS)مختبرات HiMedia   ؛ Ltd.Mumbai ، الهندRM9954
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc. ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةF2442-500ML
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ThermoFisher Scientific Inc. ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةF2442-500ML
لوحة زراعة الأنسجة المطلية بالفبرونكتينCorning Inc.Corning ، NY 14831 ، الولايات المتحدة الأمريكية
مقياس التدفق الخلويBD Biosciences ، CA 95131 ، الولايات المتحدة الأمريكية
المخزن المؤقت لقياس التدفقBD Biosciences، CA 95131، الولايات المتحدة الأمريكية
زلة غطاء زجاجي 22 × 22 مممختبرات HiMedia   Ltd.Mumbai ، الهندTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) LonzaGroup Ltd ، 4002 بازل ، سويسرا
أسنان عالية السرعة   ؛NSK Ltd ، طوكيو 8216 ، اليابانTi-Max Z
سلسلة مصل الحصانثيرمو فيشر العلمي ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
IBMX ، أو 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. سانت لويس ، MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017 ، الولايات المتحدة الأمريكية
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS) ثيرموفيشر العلمي ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةI5523
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS)ثيرمو فيشر العلمي ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةI5523
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS) بريمكسكورنينج إنكوربوريتد ، ماساتشوستس 01876 ، الولايات المتحدة الأمريكية
المجهر المقلوبأوليمبوس كورب ، طوكيو 163-0914 ، اليابان
إيزوبروبانول (60٪) شركةسيجما ألدريتش سانت لويس ، ميزوري 63103.الولايات المتحدة الأمريكيةI9516
كحول الأيزوبروبيل شركة Sigma-Aldrich Co. سانت لويس ، MO 63103.USAMB063
التدفق الصفحيThermo Fisher Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
ليدوكائين ممزوج ب epinephrineDENTSPLY ، NC 28277 ، الولايات المتحدة الأمريكيةCitanest
السائل النيتروجينالسائل خزان
Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
الماصات الدقيقةEppendorf AG ، 22339 هامبورغ ، ألمانيا30020Accupipet-2-20 & micro ؛ L
طاحونة مناديل صغيرةBio-Rad Lab، Inc. CA 94547 ، الولايات المتحدة الأمريكيةمطاحن صغيرة جاهزة
للتحضير ناقص 80 فريزربلو ستار ليمتد
غرفة عد نيوباورمارينفيلد سوبيريور ، أركثيدنفيلد ، ألمانيا
زيت أحمر O وصمة عارشركة Sigma-Aldrich Co. سانت لويس ، ميزوري 63103.USA1024190250
التمايز العظمي (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) شركة سيجما ألدريتش سانت لويس ، ميزوري 63103.USATCL119
البنسلين الستربتومايسينجيبكو ثيرمو فيشر العلمي ، ماساتشوستس 02451 ، محلول
الأمريكية (PBS) بدون Ca ++< / sup> و Mg++< / sup>HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai ، الهندTS1101
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ThermoFisher ScientificGibco
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ThermoFisher Scientific ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةGibco
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Thermo Fisher Scientific ، MA ، الولايات المتحدة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Thermo Fisher Scientific ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةP3813-1PAK1x PBS ، درجة الحموضة 7.4
Proline   ؛شركة Sigma-Aldrich Co. سانت لويس ، MO 63103.USA
شفرة مشرط مقاس 15   ؛Swann-Morton Ltd ، شيفيلد ، S6 2BJ ، المملكة المتحدةBDF-6955C
مختبرات هيبوكلوريت الصوديومHiMedia   ؛ Ltd.Mumbai ، الهندAS1024٪ w / v حل
أنابيب الطرد المركزي المعقمةTarsons Products Pvt. Ltd.
حاوية معقمة -20 مل3M Center ، MN 55144-1000 ، الولايات المتحدة الأمريكية3 M
محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS)Sigma Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP3813-1PAK1x PBS ، درجة الحموضة 7.4
ماصات معقمة (2 و 5 و 10 مل)Eppendorf AG ، 22339 هامبورغ ، ألمانيا
ماصات ونصائح معقمةEppendorf India Limited
شفرة جراحية التعامل معBecton ، Dickinson and Co. ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF- & beta ؛ 3)R & D Systems ، Inc.MN 55413 ، الولايات المتحدة الأمريكية
تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGF- & beta; 3)R & D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4٪ شركة Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4٪ شركة Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4٪ شركة Sigma-Aldrich سانت لويس ، MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA   ؛شركة Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc. ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
Trypsin-EDTA 0.25٪Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc. ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكية
حمام مائيثيرمو فيشر Scientific ، MA 02451 ، الولايات المتحدة الأمريكيةBSW-01D
شركة الخلية الأمريكية أجهزة صناديق أقراص الماس ثنائي الخلوي قبضة غطاء النيتروجين وسط الفوسفات المخزن بالولايات المتحدة الأمريكية

المراجع

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة