Method Article

تطوير وتوصيف الهلاميات المائية خارج الخلية خارج الخلية الرئوية

DOI:

10.3791/65768

⸱

December 8th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Engineered Cancer and Organ Models Laboratory, Koç University, 2Research Center for Translational Medicine (KUTTAM), Koç University, 3Department of Chemical and Biological Engineering, School of Engineering, Koç University, 4Department of Medical Biology, School of Medicine, Koç University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول منهجيتين متميزتين لإزالة الخلايا يتم تطبيقهما على الأنسجة الرئوية البقرية الأصلية ، مما يوفر سردا شاملا لخصائص كل منهما.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح استخدام الهلاميات المائية المشتقة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) في هندسة الأنسجة شائعا بشكل متزايد ، حيث يمكنها محاكاة البيئة الطبيعية للخلايا في المختبر. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على المحتوى الكيميائي الحيوي الأصلي ل ECM ، وتحقيق الاستقرار الميكانيكي ، وفهم تأثير عملية إزالة الخلايا على الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية ECM يمثل تحديا. هنا ، تم وصف خط أنابيب لإزالة الخلايا من أنسجة الرئة البقرية باستخدام بروتوكولين مختلفين ، والتوصيف النهائي لفعالية إزالة الخلايا ، وتصنيع الهلاميات المائية ECM الرئوية المعاد تشكيلها وتقييم خصائصها الميكانيكية والتوافق الخلوي. تمت متابعة إزالة الخلايا من الرئة البقرية باستخدام طريقة فيزيائية (دورات تجميد وذوبان) أو طريقة كيميائية (قائمة على المنظفات). تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين للتحقق من صحة إزالة الخلايا والاحتفاظ بمكونات ECM الرئيسية. لتقييم محتوى الكولاجين المتبقي والجليكوزامينوجليكان الكبريتي (sGAG) داخل العينات منزوعة الخلايا ، تم استخدام تقنيات تلطيخ سيريوس الأحمر والأزرق الألسياني ، على التوالي. تميزت الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية ECM الرئوية منزوعة الخلايا بالريولوجيا التذبذبية. تشير النتائج إلى أن الهلاميات المائية للرئة البقرية منزوعة الخلايا يمكن أن توفر بديلا عضويا موثوقا به لمنتجات ECM التجارية من خلال الاحتفاظ بمعظم مكونات ECM الأصلية. علاوة على ذلك ، تكشف هذه النتائج أن طريقة إزالة الخلايا المفضلة تؤثر بشكل كبير على حركية الهلام وكذلك الصلابة والخصائص اللزجة المرنة للهلاميات المائية الناتجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تقدم ظروف الاستزراع أحادية الطبقة التقليدية تمثيلا مخلصا للبيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية وتفتقر إلى القدرة على توفير سقالة ثلاثية الأبعاد (3D) مع روابط إرشادية تمكن من تفاعلات مصفوفة الخلية والخلية1. تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) والخصائص الميكانيكية محددة للغاية للأنسجة ، وتعتمد على الوقت ، وتخضع لتغيرات في الحالات المرضية. لذلك ، هناك حاجة لنماذج الأنسجة 3D المحاكاة الحيوية التي تسمح بضبط هذه الخصائص ، وتعديل السلوك الخلوي ، وتحقيق وظائف الأنسجة المطلوبة. تجذب المواد الحيوية الأصلية المشتقة من ECM الكثير من الاهتمام في هندسة الأنسجة مع القدرة على الاستخدام المباشر ل ECM1،2،....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على رئتين أصليتين طازجتين من متبرعين بقري صغار (1-2 سنة) من مسلخ محلي ونقلهما في حاوية بلاستيكية محكمة الغلق على الجليد إلى المختبر. يتم تقديم التضحية بالحيوانات للاستهلاك العام للحوم (يتم التخلص من الرئتين كنفايات) ولا يرتبط بالدراسة أو بسببها. نؤكد أن المسلخ يتوافق مع القوانين واللوائح الوطنية للتضحية بالحيوانات. علاوة على ذلك ، نؤكد أننا استخدمنا النفايات فقط ولم يكن للمشروع البحثي تأثير على عدد التي تم التضحية بها.

1. حصاد الأعضاء وإعداد الأنسجة

  1. قم بتخزين أنسجة الرئة البقري التي تم الحصول عليها حديثا في -80 درجة مئوية حتى التجربة.
  2. في يوم التجربة ، انتظر حتى تذوب أنسجة الرئة المجمدة في درجة ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إزالة الخلوية
تم تحقيق إزالة الخلايا من أنسجة الرئة البقرية لإنتاج الهلاميات المائية dECM التي من شأنها تلخيص البيئة المكروية الأصلية للرئة من خلال كل من الطرق الفيزيائية (تجميد الذوبان) والكيميائية (Triton-X-100). بعد التشريح ، تم غسل قطع الأنسجة في المضادات الحيوية المحتوية على dH2O لإزالة مسببات الأمراض التي يمكن أن تؤثر لاحقا على عقم الهلاميات المائية dECM. تم تطبيق ما مجموعه خمس دورات بالتناوب بين حمام مائي من النيتروجين السائل إلى 37 درجة مئوية لطريقة التجميد والذوبان لتعطيل الهياكل ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت الهلاميات المائية المشتقة من الأعضاء نماذج واعدة تلخص الأنسجة الأصلية ECM وتحاكي الوظيفة الخلوية العضوية. على الرغم من أن ECM الرئوي منزوع الخلايا غالبا ما يستخدم في هندسة الأنسجة ، فإن التوصيف الشامل لتكوين المواد الحيوية والخصائص الميكانيكية سيفيد فهما أفضل لكيفية تعديل تفاعلات الخلايا و ECM لنمذجة العمليات البيولوجية أثناء التوازن أو المرض. وعلى وجه الخصوص، فإن تقييم ومراقبة الخواص الميكانيكية للهلاميات المائية المعاد تشكيلها، مثل الصلابة والمرونة اللزوجية، له أهمية كبيرة لأنها كانت متضمنة في تنظيم العديد من الظ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحث العلمي والتكنولوجي في تركيا (TÜBİTAK) (المنحة رقم 118C238). تقع المسؤولية الكاملة للمنشور / الورقة على عاتق مالك المنشور. لا يعني الدعم المالي الذي تم تلقيه من TÜBİTAK أن محتوى المنشور معتمد بالمعنى العلمي من قبل TÜBİTAK. يقر المؤلفون بامتنان باستخدام خدمات ومرافق مركز أبحاث جامعة كوتش للطب الانتقالي (KUTTAM). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 أ باستخدام Biorender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الإيثانول المطلقISOLAB64-17-5
حمض الخليكISOLAB64-19-7
Alcian الحل الأزرقSigma-AldrichB8438
Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقريSigma-AldrichDN25
Discovery HR-2 مقياس الريومترTA Instruments
Entellan تصاعد المتوسطةميرك107960
محلول إيوسينمشرق الشريحة2.BS01-105-1000
علوم المجهر الإلكترونيالفورمالديهايد50-980-485
حمض الهيدروكلوريكميرك100317
اليودسيجما ألدريتش3002
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش7786-30-3
محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين من مايرMerck2.BS01-103-1000
مركب OCTTissue-Tek4583
البنسلين / الستربتومايسينBiowestL0018-100
البيبسين من الغشاء المخاطي للمعدة الخنازيرسيجما ألدريتشP6887
حمض بيكريكPolysciences88-89-1
سيريوس أحمرPolysciences09400-25
هيدروكسيد الصوديومSigma-AldrichS5881
السكروز  سيجما ألدريتشS0389
تريتون-X-100ميرك112298

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, X., et al. Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening. Mater Today Bio. 15, 100274(2022).
  2. Ulldemolins, A., et al. Lung extracellular matri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Decellularized Lung MatrixECM HydrogelsTissue EngineeringLung DecellularizationFreeze Thaw MethodDetergent Based DecellularizationOscillatory RheologyMechanical PropertiesViscoelastic PropertiesDisease Modeling

Related Articles