يمكن تنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال فرز الخلايا ، باستخدام مزيج من تلطيخ الميتوكوندريا وجزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط (ALCAM ، المعروف أيضا باسم CD166).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطبيق تلطيخ الميتوكوندريا الحية في فرز الخلايا لتنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجذع الجنيني البشري (ES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) لها تطبيقات محتملة في الطب التجديدي القائم على الخلايا لعلاج الأعضاء المريضة بشدة بسبب تكاثرها غير المحدود وخصائصها متعددة القدرات. ومع ذلك ، فإن التمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية / الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية إلى أنواع خلايا مستهدفة نقية بنسبة 100٪ يمثل تحديا بسبب حساسيتها العالية للبيئة. يحدث تكوين الورم بعد الزرع بسبب الخلايا الملوثة والمكاثرة وغير المتمايزة ، مما يجعل تقنية التنقية العالية ضرورية لتحقيق آمن للطب التجديدي. للتخفيف من خطر تكوين الأورام، تم تطوير تقنية عالية التنقية لخلايا الكبد البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. تستخدم الطريقة FACS (فرز الخلايا المنشط بالتألق) باستخدام مزيج من المحتوى العالي للميتوكوندريا وعلامة سطح الخلية ALCAM (جزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط) دون تعديل وراثي. 97٪ ± 0.38٪ (ن = 5) من خلايا الكبد المنقاة باستخدام هذه الطريقة أظهرت تعبيرا عن بروتين الألبومين. تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات مفصلة لهذه الطريقة ، كما هو مطبق على أحدث طريقة تمايز ثنائية الأبعاد لخلايا iPS البشرية إلى خلايا الكبد.
المقدمة
تعتبر الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات (ES و iPS ، على التوالي) مصادر خلايا واعدة للعلاجات التجديدية. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف كفاءة تمييز هذه الخلايا إلى أنواع محددة من الخلايا المستهدفة ، حتى عند استخدام نفس خط الخلية والبروتوكول والمجرب1،2،3،4. يمكن أن يعزى هذا التباين إلى الحساسية العالية لخلايا ES / iPS البشرية لبيئتها. لذلك ، من الصعب حاليا الحصول على خلايا مستهدفة نقية باستمرار. لتحقيق الطب التجديدي الآمن للغاية ، من الأهمية بمكان القضاء على الخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير المتمايزة في الخلايا العلاجية ، وتكنولو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
استخدمت هذه الدراسة خلايا iPS البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا (سلالة 253G1) (انظر جدول المواد).
1. صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية
- الحفاظ على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية في ظروف خالية من التغذية في وسط AK02 على أطباق الاستزراع المغلفة ب 0.25 ميكروغرام / سم2 iMatrix-511 (انظر جدول المواد).
2. التمايز الكبدي للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية في الثقافات ثنائية الأبعاد
ملاحظة: راجع الشكل 1 أ لمعرفة الجدول الي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الجدول الزمني للعمليات التي تحفز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية على التمايز إلى خلايا كبدية من خلال ثقافة ثنائية الأبعاد (الشكل 1 أ) وخصائص الخلية التمثيلية (الشكل 1 ب). تقريبا في يوم التمايز 12 ، بدأت الخلايا في إظهار أشكال الخلايا متعددة الأضلاع والنوى المستديرة ، وهي سمة من سمات خلايا الكبد. أظهرت بعض خلايا الكبد أيضا تعدد النوى.
تم إجراء تحليل FACS باستخدام الخلايا في يوم التمايز 27. لتحديد مجتمع ALCAM +.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا لوظائفها في استقلاب المغذيات وإزالة السموم ، تمتلك خلايا الكبد عددا كبيرا نسبيا من الميتوكوندريا مقارنة بأنواع الخلاياالأخرى 15. ALCAM هو عضو في عائلة الغلوبولين المناعي الفائقة ويلعب دورا في التصاق الخلايا والهجرة. يتم التعبير عنها في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكبدية والظهارية واللمفاوية والنخاعية والخلايا الليفيةوالخلايا العصبية 16. من خلال استخدام مزيج من الطريقة القائمة على الميتوكوندريا والجسم المضاد ALCAM ، تم تحديد خلايا الكبد البشرية المشتقة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا رقم المنحة [23390072].
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 253G1 خط خلية iPS البشري | RIKEN BioResource Research | Center HPS0002 | |
| 4 ٪ بارافورمالدهايد | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
| Activin A Solution ، بشري ، مؤتلف | NACALAI TESQUE، INC. | 18585 | |
| الأجسام المضادة للنوى ، استنساخ 235-1 | Chemicon | MAB1281 | الجسم المضاد ضد المستضد النووي البشري |
| B-27 Supplement (50x) ، خال من المصل | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | Cell Sorter | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| سيكلوسبورين أ | فوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن | 035-18961 | |
| كولاجيناز | فوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن | 034-22363 | |
| مخفضة عامل النمو كورنينج ماتريجيل (GFR) مصفوفة الغشاء القاعدي | كورنينج | 354230 | مصفوفة غشاء القاعدي الشبيهة بالهلام |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | مثبط الصخور |
| ديكساميثازون | فوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كوربوريشن | 047-18863 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) فوجي | فيلم واكو بيور كيميكال كوربوريشن | 047-29353 | |
| الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
| الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، مع مصفاة الخلية Snap Cap | Corning | 352235 | |
| مصل | الأبقار الجنينيةBiowest | 51820-500 | |
| مكمل GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine |
| الإنسان / الفأر / الفئران / ALCAM / CD166 الأجسام المضادة | R & D Systems | AF1172 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate ملح الصوديوم | Sigma-Aldrich | H2270 | |
| iMatrix-511 الحرير | Nippi | 892021 | |
| ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | محلول حجب |
| ITS-G الملحق (& مرات ؛ 100) | شركة FUJIFILM Wako Pure Chemical | Corporation 090-06741 | |
| شركة Leibovitz's L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical | Corporation 128-06075 | |
| N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-أميد أميد هيكسانويك (ثنائي هكسا) | تورونتو للكيماويات البحثية | H293745 | |
| الأرنب متعدد النسيلة الألبومين المضاد للإنسان | داكو | A0001 | |
| بولي أوكسي إيثيلين سوربيتان مونولورات (توين 20) | NACALAI TESQUE، INC. | 28353-85 | |
| RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
| الصوديوم L-Ascorbate | NACALAI TESQUE، INC. | 03422-32 | |
| StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
| تيرابايت (10x) | NACALAI TESQUE، INC. | 12748-31 | |
| تتراميثيل رودامين ، إستر الميثيل (TMRM) ثيرمو | فيشر العلمي | T668 | |
| تريتون X-100 | NACALAI TESQUE، INC. | 28229-25 | |
| Trypan Blue Solution | NACALAI TESQUE، INC. | 20577-34 | |
| TRYPSIN 250 | Difco | 215240 | |
| محلول مرق فوسفات التربتوز | Sigma-Aldrich | T8159 |
المراجع
- Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
- Laco, F., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
