Method Article

العزلة والتحديد السلوكي وتقييم الإمراضية للفطريات المسببة للأمراض الحشرية من حفار خشب الغابة

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا للحصول على الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من حفار خشب الغابات وطريقة بديلة لتقييم أنشطتها المسببة للأمراض الحشرية باستخدام حشرة نموذج غمدية الأجنحة. هذه الطريقة فعالة ومريحة لاستكشاف الموارد الفطرية المسببة للأمراض الحشرية من الآفات الحشرية المملة للخشب في الغابات الطبيعية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتسبب حفار خشب الغابات (FWB) في أضرار جسيمة للأشجار وخسائر اقتصادية في جميع أنحاء العالم. يعتبر إطلاق الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) خلال فترة ظهور FWB بديلا مقبولا للمكافحة الكيميائية. ومع ذلك ، فقد تم استكشاف موارد EPF بشكل أقل بكثير بالنسبة ل FWBs ، على عكس الآفات الحشرية الزراعية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لاستكشاف موارد EPF من FWBs باستخدام مجموعات Monochamus alternatus البرية كمثال. في هذا البروتوكول ، فإن تعيين الفخاخ الطعم مع M. تضمن جاذبات Alternatus لمختلف السكان جمع عينات كافية مع أعراض العدوى الطبيعية ، خلال فترات ظهور الخنفساء. بعد تشريح التكامل بدقة ووضعها على وسط انتقائي ، تم عزل الأنواع الفطرية من كل جزء من أجسام الخنافس وتحديدها بناء على كل من السمات الجزيئية والمورفولوجية.

تم اعتماد العديد من الأنواع الفطرية على أنها EPFs طفيلية عن طريق إعادة إصابة M. alternatus السليم بمعلقات البوغ. لوحظت أنماطهم الظاهرية السلوكية على M. alternatus باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ومقارنتها كذلك مع تلك الموجودة في حشرة نموذج غمدية الأجنحة Tribolium castaneum. بالنسبة ل EPFs التي تقدم أنماطا ظاهرية متسقة للتطفل على كلا النوعين من الخنافس ، قم بتقييم أنشطتها على T. قدم Castaneum معلومات قيمة عن الفتك للدراسة المستقبلية على M. alternatus. ساعد هذا البروتوكول في اكتشاف EPF المبلغ عنه حديثا عن مجموعات M. alternatus في الصين ، والتي يمكن تطبيقها كنهج فعال لاستكشاف المزيد من موارد EPF من FWBs الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدى الدمار الذي تسببه الآفات الحشرية إلى خسائر إيكولوجية واقتصادية كبيرة في كل من النظم الإيكولوجية للغابات والزراعة. تعرض معظم الآفات الزراعية نفسها للأعداء الطبيعيين أو عوامل المكافحة الاصطناعية بينما تلحق الضرر بالنباتات المضيفة. بدلا من ذلك ، يكمل حفار خشب الغابات (FWB) تقريبا دوراتهم التنموية الكاملة داخل جذوع الأشجار المضيفة1 ، مما يثير تحديات كبيرة لاستكشاف كائنات المكافحة الحيوية الفعالة من FWB في الحقل البري. والأسوأ من ذلك هو أن FWBs تحمل عددا كبيرا من مسببات الأمراضالنباتية 2 أو لها علاقة حميمة مع مسببات الأمراض هذه كناقلات محتملةلها 3,4 ، مما يضخم بشكل كبير الآثار السلبية ل FWB على صحة الغابات. الاستخدام المفرط للمبيدات الحشرية الكيميائية يمكن أن يخفف من شدة FWB ، لكن ظهور مقاومة المبيدات الحشرية 5,6 يحد من تطبيقها البيئي. في بعض الحالات ، تم إطلاق طفيليات الحشرات والمفصليات المفترسة وكذلك الميكروبات المسببة للأمراض الحشرية كعوامل مكافحة حيوية إلى مناطق توزيع FWB7 وثبت أنها بدائل فعالة ومقبولة اقتصاديا للمكافحة الكيميائية8،9،10.

تعتبر الفطريات المسببة للأمراض الحشرية (EPF) لها ميزة في السيطرة على FWB على معظم المجموعات الميكروبية الأخرى. يمكن أن تحمل جراثيمها بواسطة مضيفات الحشرات وتثبت بثبات على أسطح الجسم عن طريق اختراق بشرة أو تكامل 8,11. يوفر EPF أيضا قدرة ممتازة على التكيف مع الضغوط البيئية وبعض الأنواع تستعمر جيدا في أنسجة الأشجار مثل النباتات الداخلية12,13 ، مما يسهل نموها وبقائها وانتقالها. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ذلك في الصناعات الزراعية ، فإن تنوع الأنواع من EPF المستخدم في النظم الإيكولوجية للغابات الطبيعية مقيد بشكل ملحوظ14،15،16. تم إثبات Beauveria bassiana (سلالة PPRI 5339) على أنها السلالة الواعدة للترويج لبرنامج IPM لسوس الأوكالبتوس في جنوب إفريقيا17 ومزيج من عزلتين واعدتين من B. قدمت باسيانا فرصة للتحكم الميكروبي العملي لسوسة النخيل الحمراء ، Rhynchophorus ferrugineus ، في مراحل الحياة المختلفة في حقول أشجار النخيل18. بالإضافة إلى Beauveria و Metarhizium المعروفة ، أظهرت أجناس EPF الأخرى من رتبة Hypocreales ، وخاصة أنواع Lecanicillium (التي يصنف الكثير منها الآن في جنس Akanthomyces19,20) ، إمراضية قوية وإمكانات عالية في إدارة آفات الغابات ، مثل من السرو في تشيلي21.

خنفساء الصنوبر Monochamus alternatus هي آفة غابات الصنوبر سيئة السمعة في الصين والدول المجاورة ، والتي تحفر في فروع وجذوع أشجار الصنوبر لإعاقة نقل العناصر الغذائية والمياه22،23،24. علاوة على ذلك ، م. يعزز البديل أيضا غزو نيماتودا خشب الصنوبر الطفيلية النباتية (Bursaphelenchus xylophilus ، PWN) كخنفساء ناقل رئيسية. نوع آخر متجانس من الخنفساء ، M. galloprovincialis ، انتشر PWN في العديد من البلدان في أوروبا في السنوات الأخيرة25. ذكرت الأبحاث السابقة عدة أجناس من EPFs الطبيعية من Monochamus spp. ، مثل Beauveria و Metarhizium و Lecanicillium (Verticillium ، وهو الاسم السابق ل Lecanicillium) ، في إسبانيا واليابان ومقاطعات Anhui / Zhejiang في الصين26،27،28،29. ومع ذلك ، يبدو أن هذه المجموعات من EPFs مقيدة بشكل شائع في موقع معين ، مقارنة بالتواجد الواسع لخنافس Monochamus في الحقول الطبيعية. نظرا لأن خنفساء M. alternatus لها توزيع جغرافي واسع في الصين ، يمكن اعتبارها حفار خشب تمثيلي لاستكشاف المزيد من EPFs المحتملة عبر مجموعات سكانية مختلفة.

في هذا البروتوكول ، نقدم إجراء محددا يستكشف EPFs من عدة مجموعات جغرافية من M. البديل في جنوب الصين. يستخدم هذا البروتوكول نموذج خنفساء غمدية الأجنحة كبديل لإجراء مقايسات مسببات الأمراض الحشرية ، بشرط أن يكون للأنواع الفطرية المختبرة نمط ظاهري سلوكي ثابت على كلا النوعين من الخنافس. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول أيضا نظرة ثاقبة لاستكشاف EPF لحفار خشب الغابات الآخرين ، حيث يتم التقليل من تنوع أنواعها الفطرية المسببة للأمراض الحشرية أو أقل تحقيقا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عزل الفطريات من M. alternatus (الشكل 1)

  1. اجمع عينة الخنفساء
    1. جمع الصنوبر مناشير الخنافس M. البديل باستخدام الفخاخ التجارية (انظر جدول المواد) الطعم مع الجاذبات قبل فترات الظهور المتوقعة لمجموعات الخنافس في غابات الصنوبر المصابة بشكل طبيعي.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم جمع الخنافس من خمس مناطق جغرافية في جنوب الصين (هوتشو / تشجيانغ ، ليانغشان / سيتشوان ، شيامن / فوجيان ، شاوقوان / قوانغدونغ ، يولين / قوانغشي). إعداد المصيدة من أعلى إلى أسفل هو كما يلي: قمة مستديرة (قطرها 50 سم) ، لوحة متقاطعة الشكل (عرضها 35 سم وطولها 66 سم) ، قمع (35.5 سم في القطر العلوي المستدير و 5.5 سم في القطر الدائري السفلي) ، كوب تجميع (قطره 10.5 سم وطوله 26.5 سم). يتم استخدام المواد المتطايرة المضيفة (مثل الإيثانول و α-pinene) وفرمون التجميع (2-undecyloxy-1-ethanol) كطعم30.
    2. قم بتسمية العينة قبل نقلها إلى المختبر. ضع كل خنفساء في أنابيب معقمة فردية ذات أغصان جديدة. استبدال الأغصان مع أخرى جديدة كل 2 أيام.
    3. قم بتربية الخنافس الحية عند 25 ± 1 درجة مئوية في حاضنة غير رطبة (دورات 16-8 لتر / يوم) وراقبها يوميا.
    4. تسجيل العينات التي تظهر انخفاض التغذية والتنقل. نقل الميت م. البديل الذي يصبح صلبا وقاسيا على الغرف الرطبة لمراقبة نمو الفطريات الفطرية والكونيديا.
      ملاحظة: بمجرد الإصابة بالفطريات المسببة للأمراض الحشرية ، أظهرت الخنافس انخفاضا في التغذية والتنقل في المرحلة الأولى من العدوى31,32. بعد الموت ، أصبحت أجسادهم صلبة وقاسية ، مع ظهور الفطريات والكونيديا بعد عدة أيام من التخزين في غرفة رطبة33.
    5. قم بتخزين جثث الخنافس المصابة بالتهابات فطرية عند 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. لاتباع هذا البروتوكول ، قم بمعالجة العينات على الفور في غضون ساعات قليلة لتجنب التلوث بالفطريات الأكثر تروما.
  2. إعداد متوسطة النمو
    1. أضف 39 جم من مسحوق أجار سكر العنب (PDA) في 1 لتر من الماء النقي وقم بتعقيمه لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    2. تبرد إلى درجة حرارة قابلة للتشغيل (~ 50 درجة مئوية) ، أضف 0.05 جم من الستربتومايسين ، و 0.05 جم من البنسلين G ، و 0.05 جم من التتراسيكلين ، ورج لتوزيع الوسط.
    3. ضعي الوسط في أطباق بتري تحت مقعد نظيف واستخدميه بعد التصلب.
      ملاحظة: يستخدم وسط PDA مع المضادات الحيوية للعزل عن الخنافس ، مما يمنع نمو البكتيريا دون التأثير على نمو الفطريات أثناء العزل. ومع ذلك ، يتم استخدام وسيط PDA بدون مضادات حيوية للزراعة اليومية والحفظ.
    4. ضعي 35 جم من مسحوق مرق سكر العنب (PDB) في 1 لتر من ddH2O وقم بتعقيمه لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية. تبريده للاستخدام.
  3. تشريح عينة الخنفساء مع أعراض العدوى الفطرية
    1. تحضير المقصات والمشارط ودبابيس الحشرات المعقمة ؛ ثم ، اعمل تحت مقعد نظيف مع موقد كحول.
      ملاحظة: يمكن ضبط استخدام أدوات التشريح وفقا للتفضيلات الشخصية. دبابيس الحشرات أكثر حدة من إبر التشريح القياسية ، ويمكن أن تلبي المواصفات المختلفة الحاجة إلى التشريح.
    2. تشريح تكامل جسم الخنفساء باستخدام أدوات في أطباق بتري المعقمة وذات الاستخدام الواحد. احرص على تجنب الضرر المحتمل لأنسجة الأمعاء الوسطى والأمعاء الخلفية التي قد تحلب المحتويات الداخلية.
    3. قسم أجسام الخنفساء إلى المواضع الرئيسية على النحو التالي: الهوائيات والرأس والصدر والبطن والأجنحة (كل زوج) والساقين.
  4. تنقية الفطريات
    1. قطع تكامل كل موقف إلى قطع صغيرة مع مقص. اضغط برفق على السطح الخارجي على سطح ألواح PDA بالمضادات الحيوية.
      ملاحظة: تأكد من تلقيح الفطريات الفطرية على التكامل على اللوحة.
    2. ختم مع parafilm بعناية، وزرع في حاضنة في 25 ± 1 درجة مئوية حتى يتم تغطية الأنسجة تماما من قبل mycelium.
    3. نقل المستعمرات المفردة وفقا لخصائص النمط الظاهري (اللون والشكل) إلى PDA جديد مع المضادات الحيوية للثقافة عند 25 ± 1 درجة مئوية.
    4. كرر الخطوة 1.4.3 مرتين أو ثلاث مرات على القناة النوعية الزيتية السالكة مع المضادات الحيوية حتى يتم عزل المستعمرات النقية بشكل منفصل.
      ملاحظة: إذا نمت سلالات فطرية متعددة في الأطباق الأصلية ، فاختر الفطريات بدقة لتسهيل فرز المزيد من الأنواع الفطرية.
  5. تخزين العزلات الفطرية
    1. نقل كتل أجار (~ 5 مم في القطر) من المستعمرات إلى لوحات PDA الجديدة.
    2. الثقافة في حاضنة في 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
    3. ضعه في ثلاجة على حرارة 4 درجة مئوية للتخزين اليومي لمزيد من الاستخدام.
    4. تلقيح السلالات الفطرية في 50 مل من PDB المعقم في دورق 250 مل ، ويهز عند 180 دورة في الدقيقة / دقيقة عند 25 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام.
    5. حصاد 1 مل من الفطريات الفطرية المزروعة حديثا وتعليقه في 1 مل من الجلسرين المعقم بنسبة 20٪ في أنابيب الفريزر المعقمة 2 مل (التركيز النهائي للجلسرين هو 10٪).
    6. أغلق الأنابيب بالبارافيلم وقم بتبريدها مسبقا عند -20 درجة مئوية و -40 درجة مئوية. ثم حافظ على الأنابيب عند -80 درجة مئوية كمخزون.

2. التحديد الجزيئي والمورفولوجي للعزلات الفطرية

  1. استخراج الحمض النووي الجينومي الفطري
    1. فطريات الاستزراع في PDB كما هو موضح في الخطوة 1.5.4.
    2. حصاد الفطريات وتصفيتها لفصلها عن PDB. تجانس في النيتروجين السائل باستخدام هاون مبرد مسبقا ومدقة.
    3. استخرج الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي للفطريات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
    1. تحضير خليط تفاعل تفاعل PCR على النحو التالي: 25 ميكرولتر من بوليميراز Taq DNA ، 1 ميكرولتر من القالب ، 2 ميكرولتر من البادئات الأمامية والخلفية ، و ddH2O إلى حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر.
    2. تضخيم منطقة rDNA-ITS لعينة الحمض النووي باستخدام أزواج التمهيدي ITS1 و ITS434 (انظر الجدول 1) بالإجراء التالي: تغيير الطبيعة الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، تليها 35 دورة من تغيير طبيعة 94 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، والتلدين عند 58 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، والاستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، واستطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. الكهربائي للمنتجات المضخمة باستخدام 1.5 ٪ هلام الاغاروز في 100 فولت ، 100 مللي أمبير.
    4. تسلسل PCR.
    5. قم بمحاذاة التسلسل باستخدام Clustal X2.0 و MEGA 6.0.
      ملاحظة: أثناء محاذاة التسلسل، يتم استبعاد المواقع ذات المحاذاة الغامضة، ويتم التعامل مع الفجوات على أنها بيانات مفقودة.
    6. قارن التسلسل الذي تم الحصول عليه مع تلك الموجودة في قاعدة بيانات تسلسل ITS في GenBank باستخدام BLAST على موقع المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI). تحديد معلومات أنواع السلالات الفطرية بشكل مبدئي.
  3. التعرف المورفولوجي
    1. استخدم كاميرا لالتقاط مورفولوجيا المستعمرة النقية الفطرية الناضجة على الجانبين الأمامي والخلفي لألواح PDA.
    2. نتف كونيديا من المستعمرات الفطرية الثقافة النقية بإبرة تلقيح ونقلها إلى شريحة زجاجية مع قطرة من الماء المعقم.
    3. أمسك زلة الغطاء وضعها ببطء بزاوية ~ 45 درجة ، بحيث يمكن لزلة الغطاء تغطية العينة بدون فقاعات.
    4. قطع كتلة أجار 5 مم2 بمشرط من المستعمرات على حافة المستعمرة الفطرية ، ونقلها إلى شريحة زجاجية نظيفة مع قطرة من الماء المعقم. ندف بعناية بعيدا الفطريات بإبرة دقيقة لرؤية هياكل محددة.
    5. كرر الخطوة 2.3.3.
    6. راقب الشكل اللاجنسي للفطريات تحت المجهر الضوئي (OM) ، بما في ذلك شكل وشفافية ووضعية الخيوط الفطرية والكونيديوفورات والفياليدات والكونيديا. سجل وقياس شكل وحجم الصفات اللاجنسية لتمييز العزلات الفطرية المختلفة عن بعضها البعض.
      ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من القدرة على مراقبة الهياكل الفطرية ، استخدم البقع وتصاعد المتوسطة35.

3. تحريض أعراض العدوى الفطرية على M. alternatus لمراقبة الأنماط الظاهرية السلوكية

  1. إعداد تعليق كونيدي
    1. تحضير 0.01٪ Tween-80 بالماء النقي والتعقيم لمدة 25 دقيقة عند 121 درجة مئوية. استخدم بعد التبريد.
    2. أضف كمية مناسبة من الخرز الزجاجي الصغير المعقم ومحلول Tween-80 بنسبة 0.01٪ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
    3. كشط المستعمرات الفطرية في الأنبوب ورجها بما فيه الكفاية مع شاكر دوامة حتى يتم تفتيت المستعمرة. تصفية من خلال طبقتين من الشاش لإزالة mycelium.
      ملاحظة: يتم الاهتزاز لضمان تعليق conidiospore في محلول Tween-80 بنسبة 0.01٪.
    4. عد عدد الجراثيم تحت OM باستخدام مقياس الدم ، واضبط على 1 × 108 مخروطي / مل مع معقم 0.01٪ Tween-80 ، واحفظه عند 4 درجات مئوية للاستخدام.
  2. تحضير الخنافس
    1. الأوتوكلاف أغصان الصنوبر (تقريبا نفس الحجم) وجفف في الفرن (~ 60 °C).
    2. احتفظ ب M الذي تم جمعه ميدانيا. بالغون بالتناوب مع أغصان الصنوبر في حاضنة عند 25 ± 1 درجة مئوية.
    3. تجويع الخنافس لمدة 24 ساعة وتعقيم سطح الخنافس بالمبيض والإيثانول والماء المقطر [10:10:80 (v: v)] قبل الاستخدام.
  3. تحريض العدوى الفطرية
    1. اعمل تحت مقعد نظيف ، واغمر أغصان الصنوبر في تعليق كونيدي لمدة 10 ثوان ، وجففها في الهواء.
    2. اغمس الخنافس في تعليق كونيدي لمدة 10 ثوان ، ثم انقلها إلى أنابيب معقمة سعة 50 مل (خنفساء واحدة وغصين واحد لكل أنبوب). استبدال الأغصان بأخرى جديدة كل 2 أيام.
    3. للتحكم السلبي ، قم بتغيير التعليق المخروطي إلى محلول Tween-80 معقم بنسبة 0.01٪ فقط. اصنع خمس مكررات لكل سلالة فطرية ومجموعة تحكم.
    4. تقييم نشاط الخنافس على أساس كمية frass المنتجة على أغصان الصنوبر. عندما تتوقف التغذية ، اعتبرها ميتة.
    5. انقل الخنافس الميتة إلى أنابيب معقمة جديدة سعة 50 مل وضع قطعة من القطن الرطب المعقم. احتضان في 25 ± 1 درجة مئوية.
      ملاحظة: يستخدم القطن الرطب للحفاظ على الرطوبة ، حيث يتطلب نمو الفطريات رطوبة مناسبة ، ولكن ليس كثيرا.
    6. مراقبة وتصوير تغير سطح الخنفساء في نفس الوقت كل يوم.
  4. إعادة عزل وتأكيد الأنواع الفطرية
    1. حتى تظهر الأنماط الظاهرية للعدوى الفطرية الواضحة على سطح الخنافس ، اختر الفطريات من الأنسجة المختلفة بشكل فردي في لوحات PDA جديدة.
    2. استزراع في 25 ± 1 درجة مئوية والمراقبة للتأكد من أن التشكل يتوافق مع الفطريات الملقحة.
  5. علاج خنفساء النموذج
    1. كرر الخطوات 3.2.1-3.3.6 على نموذج خنفساء Tribolium castaneum ، باستخدام نخالة القمح كغذاء ، وتعقيم نخالة القمح بضوء الأشعة فوق البنفسجية.
    2. المس الخنافس برفق باستخدام ملاقط معقمة. افترض أنهم ماتوا إذا لم يكن هناك رد.

4. تأكيد الأنماط الظاهرية للعدوى من الفطريات على M. alternatus وخنفساء النموذج

  1. إعداد العينة للمراقبة
    1. تشريح M المصابة. جثث Alternatus بعناية كما في الخطوة 1.3.
    2. اختيار T. أجسام الصنج مع أعراض واضحة للعدوى الفطرية.
    3. قطع سدادات قرصية 5 مم لأربع مستعمرات فطرية ناضجة تنمو على المساعد الرقمي الشخصي.
  2. المعالجة المسبقة للعينة
    1. ضع المقابس وأنسجة الخنفساء المصابة والأجسام في جلوتارالدهيد مبرد بنسبة 2.5٪ عند 4 درجات مئوية لمدة يومين.
    2. اغسل العينات ثلاث مرات في محلول فوسفات 0.1٪ (درجة الحموضة 7.2-7.4) لمدة 5 دقائق وجفف في 30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪ إيثانول لمدة 10 دقائق.
    3. جفف العينات في مجفف تجميد فراغ.
      ملاحظة: يجب أن تكون عملية المعالجة المسبقة بأكملها حذرة ، بما في ذلك القطع والنقع والجفاف والغسيل والتجفيف ، لمنع تلف العينة.
  3. مراقبة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
    1. قم بتغطية العينات المعالجة مسبقا بالبلاتين باستخدام مغلف الرش ، وراقبها تحت المجهر الإلكتروني الماسح36.
    2. سجل الخصائص المورفولوجية للخيوط الفطرية والكونيديا التي تنمو على PDA ، M. أنسجة البديل ، وأجسام الخنفساء النموذجية.
    3. قارن ما إذا كانت النتائج متوافقة مع تلك الواردة في OM في الخطوة 2.3.

5. تقييم النشاط الممرض للحشرات

  1. إعداد تعليق كونيدي
    1. إعداد التعليق المخروطي هو نفسه كما في الخطوات 3.1.1 إلى 3.1.4.
  2. المعالجة المسبقة لخنفساء النموذج
    1. الثقافة والتغذية والتعقيم والتجويع T. الكاستانيوم كما في الخطوة 3.5.1.
    2. تعقيم نخالة القمح عن طريق الأشعة فوق البنفسجية ، ووضع وزن متساو لأطباق بتري معقمة.
  3. اختبار النشاط الممرض للحشرات
    1. عالج نخالة القمح بالتعليق الكونيدي وجففها في الهواء تحت مقعد نظيف في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغمر ت. خنافس الصنج في التعليق المخروطي لمدة 10 ثوان ونقلها إلى طبق بتري (ن = 20 في كل طبق بتري). استبدل نخالة القمح الجديدة بنفس العلاج الكونيدي كل 4 أيام.
    3. للتحكم السلبي ، ضع محلول Tween-80 المعقم فقط بنسبة 0.01٪.
      ملاحظة: ضع جانبا ثلاثة مكررات على الأقل لكل مجموعة علاج وعنصر التحكم.
    4. عد الخنافس الميتة يوميا.
      ملاحظة: المس الخنافس برفق باستخدام ملاقط معقمة. افترض أنهم ماتوا إذا كان هناك نقص في الاستجابة.
  4. تحليل النشوء والتطور متعدد الجينات
    1. استخراج الحمض النووي الجينومي الفطري الممرض للحشرات كما هو موضح في الخطوة 2.1.
      ملاحظة: يتم إجراء تحديد متعدد الجينات ل EPFs الطفيلية التي تظهر أنماطا ظاهرية كبيرة للعدوى وأنشطة قوية للأمراض الحشرية ضد خنفساء النموذج.
    2. تضخيم الجينات التالية ، بما في ذلك منطقة تمتد على جين SSU34 الريبوسومي النووي ، وجزء من جين rRNA للوحدة الفرعية الكبيرة (LSU37,38) ، وجزء من جين عامل الاستطالة 1-alpha (tef-1α39) ، وثاني أكبر تسلسل وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي ІІ (rpb240) ، وجزء من β-tubulin41 ، باستخدام أزواج التمهيدي NS1 / NS4 و LR7 / LROR و EF-983F / EF-2218R و RPB2-5'F / RPB2-5'R و TUB1 / TUB22 (انظر الجدول 1) ، على التوالي.
      1. تحضير خليط تفاعل تفاعل PCR كما في الخطوة 2.2.1.
      2. قم بإجراء التضخيم على النحو التالي: تغيير الطبيعة الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، متبوعا ب 35 دورة (tef-1α ، rpb2 ، SSU) ، 38 دورة (LSU) أو 39 دورة (β-توبولين) من تغيير الطبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، والتلدين عند 47 درجة مئوية لمدة 60 ثانية (LSU) ، و 55 درجة مئوية لمدة 60 ثانية (tef-1α) ، و 54 درجة مئوية لمدة 40 ثانية (β-tubulin) ، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (rpb2 ، SSU) ، استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، واستطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. قم بالتسلسل والمحاذاة باتباع نفس الخطوات الموضحة في الخطوات من 2.2.4 إلى 2.2.5.
    4. قم بإجراء تحليل النشوء والتطور بواسطة MEGA 6.0 بناء على طريقة الاحتمال الأقصى (ML)42.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل وتحديد العزلات الفطرية من M. البديل
بمساعدة الفخاخ الجاذبة ، هناك عدد كبير (حوالي 500 خنفساء في المجموع) من M. تم جمع البديل من خمس مناطق جغرافية. تم اختيار جثث الخنفساء ذات الأعراض النموذجية للعدوى بالفطريات المسببة للأمراض الحشرية. بعد ذلك ، تم تشريح تكامل الجسم لكل خنفساء إلى عدة أوضاع كما هو موضح في البروتوكول الخطوة 1.3. نتيجة لذلك ، تم عزل أكثر من 600 عزلة فطرية من أوضاع مختلفة للجسم. هذا يسمح للمرشحين الفطريين الأكثر ثراء لفحص مسببات الأمراض ضد خنافس منش...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد تطور المجموعات الجغرافية المختلفة من FWB تفاعلات متنوعة مع الفطريات الطبيعية المسببة للأمراض الحشرية ، بسبب التكيف البيئي طويل الأجل لأنواع EPF مع عوامل المناخ المحلية والسكان الوراثيين المحددين للحشرة المضيفة44,45. يساعد توسيع مواقع أخذ العينات إلى مناطق تواجد الحشرات المتعددة على زيادة إمكانية الحصول على سلالات أو أنواع متنوعة من EPF من مضيفاتها الطبيعية ، كما هو موضح في الدراسات السابقة حول الآفات الحشرية الزراعية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFC2600100) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (LY21C040001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل ، 2 مل أنابيب الطرد المركزي BiosharpBS-15-M
10 & micro ؛ L نصائح الماصةSangon BiotechF601216
10 & micro ؛ L ، 20 وميكرو ؛ لتر ، 100 وميكرو ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ لتر ، 1,000 وميكرو ؛ L ماصاتRainin
1,000 & micro; L نصائح ماصةسانجون للتكنولوجيا الحيويةF630102
2 مل قوارير مبردةكورنينج430659
20x PBS عازلةسانغون للتكنولوجيا الحيويةB548117-0500
200 & L نصائح الماصةسانجون للتكنولوجيا الحيويةF601227
صانع 2,000 نقطة أساسTaKaRarSD0531
50 مل أنابيبعش602052
محلول جلوتارالديهايد 50٪سانجون للتكنولوجيا الحيويةG916054
50x TAE عازلةسانجون للتكنولوجيا الحيوية B548101
6x عازلة تحميلTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
الإيثانول اللامائيJkchemicalLB10V37
خزانة زراعة الكيمياء الحيويةShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
مصائد الخنافس التجاريةFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
جل تصويرBio-RadGelDoc XR +
الجلسرينسانجون التكنولوجيا الحيويةA600232
جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعةسيجماD-37520
وعاء التعقيم بالبخار عالي الضغطMettler ToledoJA5003
كحول الأيزوبروبيلكاشف عامG75885B
الحمضسانجون للتكنولوجيا الحيويةA616696
مجهر بصري ، OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
البطاطس سكر العنب أجار ، المساعد الشخصي الرقميOxoidCM0139
مرق سكر العنب البطاطا ، بادئات PDBSolarbioP9240
Sangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
طقم عزل الحمض النووي الجينومي السريع للفطرياتSangonB518229
المجهر الإلكتروني الماسح ، SEMهيتاشيS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
مجفف تجميد فراغياماتوDC801
دوامة شاكرHLDWH-861
& بيتا ؛ -MercaptoethanolMarklinM6230
صبغة النووي Biotech

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles