Method Article

قياس التدفق الخلوي التصويري لدراسة التجميع الذاتي الميكروبي

DOI:

10.3791/65788

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, 2Ilse Kats Institute for Nanoscale Science & Technology, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 4The Scojen institute for synthetic biology, Reichman university

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نهجا كميا لقياس التجميع الذاتي الميكروبي باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب البكتيريا المفيدة والبروبيوتيك أدوارا أساسية في مضيفيها ، حيث توفر فوائد صحية مختلفة ، بما في ذلك المناعة ضد الأمراض المعدية. تتكون عائلة Lactobacillaceae من بكتيريا إيجابية الجرام ذات خصائص بروبيوتيك مؤكدة. تستخدم هذه الدراسة أنواع Lactobacillaceae كنموذج لإثبات فعالية تحليل الإنتاجية العالية أحادية الخلية في دراسة التجميع الخلوي. ينصب التركيز على تحليل استجابة هذه الأنواع المفيدة للكربوهيدرات البسيطة من النظام الغذائي.

تعرض الدراسة كيف يمكن لقياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) التغلب على الاختلافات الأساسية في تجميع بكتيريا البروبيوتيك في وجود وغياب الكربوهيدرات. يجمع IFC بين قوة وسرعة قياس التدفق الخلوي التقليدي والدقة المكانية للفحص المجهري ، مما يتيح قياسات مورفومترية معقدة عالية المعدل بطريقة محددة ظاهريا عبر مكتبة من السلالات والظروف البكتيرية المفيدة. يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة حول التجميع الذاتي لأنواع Lactobacillaceae ويلقي الضوء على استجابتها للكربوهيدرات الغذائية ، مما يساهم في فهم الآليات الكامنة وراء الآثار المفيدة لهذه البكتيريا بروبيوتيك.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتبر التجمع الذاتي البكتيري خطوة أساسية في تكوين الأغشية الحيوية. في هذه العملية (تسمى أحيانا التراص الذاتي أو التلبد) ، تشكل البكتيريا من نفس النوع كتلا متعددة الخلايا تستقر في النهاية في قاع أنابيب الاستزراع أو تلتصق بالأنسجة أو السطح المستهدف1.

التجميع الذاتي هو ظاهرة لوحظت على نطاق واسع وقد ثبت حتى الآن في مسببات الأمراض سالبة الجرام مثل العامل الممرض الانتهازي Acinetobacter baumannii2 ، ومسببات الأمراض السنية Aggregobacter actinomycetemcomitans3 ، والممرض الناشئ Burkholderia pseudomallei4. كما تم وصف التجميع الذات....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير ملف .ast ، مع قالب Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) كمثال ، في ملف الترميز التكميلي 1.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. تحضير مرق العصيات اللبنية MRS باتباع تعليمات الشركة المصنعة (55 جم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات) وألواح أجار Lactobacilli MRS مع 1.5٪ (وزن / حجم) أجار (انظر جدول المواد). بعد تعقيم الأوتوكلاف ، يكون الوسيط جاهزا للاستخدام مباشرة أو يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية.
  2. تحضير 50٪ (15 جم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات) مرق الصويا التربتيك (TSB) (انظر جدول المواد) ، TSB مكمل ب 1٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز و 1٪ (وزن / حجم) D-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح النتائج أن هذه الطريقة يمكن بسهولة قياس الاختلافات في التجميع الذاتي استجابة للسكريات الغذائية في بكتيريا LAB. من خلال فصل الأفراد عن المجاميع ، تسمح الطريقة بحساب النسبة المئوية لسكان أحداث التجميع من جميع الأحداث استجابة للسكريات القابلة للتخمير أو غير القابلة للتخمير من النظام الغذائي. بالإضافة إلى ذلك ، كان من الممكن قياس ما إذا كانت هناك اختلافات في متوسط حجم إجمالي السكان بين العلاجات.

توضح الصور التمثيلية في الشكل 3 استراتيجية البوابات لكل بكتيريا LAB........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس التدفق الخلوي هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد شدة التألق في الخلايا حقيقية النواة ، ولكنها قد لا توفر قياسات دقيقة للخلايا البكتيرية بسبب حجمها الأكبر أو مجاميعها الصغيرة. يمكن أن تؤثر هذه العوامل بشكل كبير على القياس الكمي الدقيق للتجميع الذاتي والمستوى الأساسي لتشكيل الركام في ظروف مختلفة. لمعالجة هذا الأمر ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) للحصول على دقة أفضل لكيفية تأثير الكربوهيدرات على تراكم بكتيريا البروبيوتيك5. يجمع IFC بين الأهمية الإحصائية لأحجام العينات الكبيرة ف.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 119/16) ومنحة IMoh (3-15656) إلى IKG. R.S. بدعم من زمالة كريتمان.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 مل أنابيب ثقافة Falcon352051
15 مل أنبوب الطرد المركزيFalcon352096
باكتو أجاربايتون ، ديكنسون وشركاه214010
باكتو مرق الصويا النموذجيبايتون ، ديكنسون وشركاه211825
D- (+) - الجلوكوزسيجماG7021-1KG
D- (+) - رافينوز خماسي هيدراتسيجما83400-25G
Difco Lactobacilli MRS مرقBaeton و Dickinson and Company288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 مل (Eppendorf)FL Medical23053
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN / A& nbsp ؛ التفاصيل متوفرة على: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/A  التفاصيل متوفرة عند: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS ، 3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيكفيشر الكواشف الحيويةBP308-500
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةفيشر ساينتيك ، 174.18 جم / مولBP363-1
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ، 136.09 جم / مولP0662-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
  2. Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating hig....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometryMicrobial AutoaggregationLactobacillaceae SpeciesProbiotic BacteriaSingle Cell AnalysisDietary CarbohydratesHigh Throughput ImagingAggregate Size DistributionBright Field MicroscopyCell Aggregation

Related Articles