في هذه الدراسة ، تم تطوير رواية في التعبير الجيني للنباتات وطريقة تحرير الجينات بوساطة Agrobacterium في الخيزران. حسنت هذه الطريقة بشكل كبير من كفاءة التحقق من صحة وظيفة الجينات في الخيزران ، والتي لها آثار كبيرة على تسريع عملية تربية الخيزران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في بلانتا التعبير الجيني وتحرير الجينات في أوراق الخيزران موسو
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم تطوير طريقة جديدة في تحويل الجينات النباتية للخيزران ، والتي تتجنب الحاجة إلى عمليات تحريض الكالس وتجديده التي تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة. تتضمن هذه الطريقة التعبير الجيني بوساطة Agrobacterium عن طريق الجرح والفراغ لشتلات الخيزران. لقد أظهر بنجاح التعبير عن الجينات الخارجية ، مثل مراسل RUBY وجين Cas9 ، في أوراق الخيزران. تم تحقيق أعلى كفاءة تحويل لتراكم البيتالين في شتلات الياقوت باستخدام سلالة GV3101 ، بنسبة 85.2٪ بعد الإصابة. على الرغم من أن الحمض النووي الأجنبي لم يندمج في جينوم الخيزران ، إلا أن الطريقة كانت فعالة في التعبير عن الجينات الخارجية. علاوة على ذلك ، تم أيضا تطوير نظام تحرير الجينات مع مراسل أصلي باستخدام هذه الطريقة ، والتي يتم من خلالها إنشاء طفرة في الموقع بواسطة جين de-epoxidase المحرر من الخيزران (PeVDE) في أوراق الخيزران ، بمعدل طفرة يبلغ 17.33٪. أدت طفرة PeVDE إلى انخفاض قيم التبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQ) تحت الضوء العالي ، والتي يمكن اكتشافها بدقة بواسطة مقياس الفلورومتر. هذا يجعل PeVDE المحرر مراسلا أصليا محتملا لكل من الجينات الخارجية والداخلية في الخيزران. مع مراسل PeVDE ، تم تحرير جين اختزال سينامويل-CoA بنجاح بمعدل طفرة 8.3٪. تتجنب هذه العملية عملية زراعة الأنسجة أو تحريض الكالس ، وهي سريعة وفعالة للتعبير عن الجينات الخارجية وتحرير الجينات الداخلية في الخيزران. يمكن لهذه الطريقة تحسين كفاءة التحقق من وظائف الجينات وستساعد في الكشف عن الآليات الجزيئية لمسارات التمثيل الغذائي الرئيسية في الخيزران.
المقدمة
إن التحقيق في وظيفة الجينات في الخيزران يحمل وعدا كبيرا للفهم المتقدم للخيزران وإطلاق العنان لإمكاناته للتعديل الوراثي. يمكن تحقيق طريقة فعالة لذلك من خلال عملية العدوى بوساطة Agrobacterium في أوراق الخيزران ، حيث يتم إدخال جزء T-DNA الذي يحتوي على جينات خارجية في الخلايا ، مما يؤدي لاحقا إلى التعبير عن الجينات داخل خلايا الأوراق.
الخيزران هو مورد قيم ومتجدد مع مجموعة واسعة من التطبيقات في التصنيع والفن والبحث. يمتلك الخيزران خصائص خشبية ممتازة مثل القوة الميكانيكية العالية والمتانة والصلابة المعتدلة والمرونة1 ، والتي تستخدم الآن على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من اللوازم المنزلية والصناعية ، بما في ذلك فرش ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير شتلات الخيزران
- تحضير شتلات موسو الخيزران (Phyllostachys edulis) باستخدام البذور التي تم حصادها في قويلين ، قوانغشي ، الصين. ابدأ بنقع البذور في الماء لمدة 2-3 أيام ، مع التأكد من تغيير الماء يوميا. بعد ذلك ، قم بإنشاء ركيزة عن طريق خلط التربة والفيرميكوليت بنسبة 3: 1.
- زرع البذور المنقوعة في الركيزة للإنبات. الحفاظ على الشتلات تحت ظروف المختبر ، والحفاظ على درجة الحرارة بين 18-25 درجة مئوية. تأكد من فترة ضوئية مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات مع شدة ضوء تبلغ 250-350 ميكرومول / م2 / ثانية خلال مرحلة الضوء.
- الحفاظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 60٪. بالنسبة لعدوى Agrobacterium ، استخدم الشتلات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Agrobacterium بوساطة في التعبير الجيني بلانتا في أوراق الخيزران
وقد ثبت أن جين مراسل روبي فعال في تصور التعبير الجيني العابر بسبب قدرته على إنتاج بيتالين أحمر زاهي من التيروزين10. في هذه الدراسة ، تم استخدام التحول بوساطة Agrobacterium للتعبير بشكل عابر عن جين RUBY الخارجي في أوراق الخيزران (الشكل 1). في3 أيام بعد الإصابة ، لوحظ اللون الأحمر في الأوراق المطوية غير الناضجة ، والتي أصبحت أكثر حي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقلل هذه الطريقة بشكل كبير من الوقت المطلوب مقارنة بطرق التحول الجيني التقليدية ، والتي تستغرق عادة 1-2 سنوات ، وتحقق تعبيرا عابرا عن الجينات الخارجية وتحرير الجينات للجينات الداخلية في غضون 5 أيام. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها قيود لأنها لا يمكنها تحويل سوى نسبة صغيرة من الخلايا ، والأوراق المعدلة جينيا وهمية وتفتقر إلى القدرة على التجدد إلى نباتات كاملة. ومع ذلك ، فإن هذا في التعبير الجيني للنباتات وتكنولوجيا تحرير الجينات يوفر نهجا قويا للتحقق الوظيفي من جينات الخيزران الداخلية.
ح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (المنحة رقم 2021YFD2200502) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31971736) على الدعم المالي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 35S:: RUBY< / em> | Addgene ، الولايات المتحدة | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium < / em> الخلايا المختصة من GV3101 و EHA105 و LBA4404 و AGL1 | Biomed ، الصين | BC304-01 و BC303-01 و BC301-01 و BC302-01 | لعدوى Agrobacterium |
| CTAB | Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة | 57-09-0 | استخراج الحمض النووي |
| تصوير PAM مقياس الفلور | Walz ، Effeltrich ، ألمانيا | الكشف عن مضان الكلوروفيل لأوراق الخيزران | |
| ImagingWin | Walz ، Effeltrich ، ألمانيا | برنامج لمقياس الفلور IMAGING | |
| PAM Paq < / em>CI أو Aar < / em>I | NEB ، الولايات المتحدة | R0745S | قم بدمج التسلسل المستهدف في متجه CRISPR / Cas9. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara ، اليابان | R045Q | لاستنساخ الجينات |
| T4 DNA ligase | NEB ، الولايات المتحدة | M0202V | قم بدمج التسلسل المستهدف في ناقل CRISPR / Cas9. |
المراجع
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus M....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
