يحدد هذا البروتوكول طريقة لزرع غشاء النافذة المستديرة من عظام خنزير غينيا الصدغية ، مما يوفر موردا قيما للدراسات خارج الجسم الحي .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خنزير غينيا جولة نافذة غشاء الزرع للدراسات خارج الجسم الحي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمثل توصيل الدواء الفعال والأقل بضعا إلى الأذن الداخلية تحديا كبيرا. أصبح غشاء النافذة المستديرة (RWM) ، كونه أحد نقاط الدخول القليلة إلى الأذن الداخلية ، محورا حيويا للتحقيق. ومع ذلك ، نظرا لتعقيدات عزل RWM ، يظل فهمنا لحركيتها الدوائية محدودا. يتكون RWM من ثلاث طبقات متميزة: الظهارة الخارجية ، وطبقة النسيج الضام الأوسط ، والطبقة الظهارية الداخلية ، ولكل منها خصائص توصيل فريدة.
تستخدم النماذج الحالية للتحقيق في النقل عبر RWM نماذج حيوانية في الجسم الحي أو نماذج RWM خارج الجسم الحي تعتمد على مزارع الخلايا أو شظايا الغشاء. تعمل خنازير غينيا كنموذج قبل سريري معتمد لفحص الحرائك الدوائية داخل الأذن الداخلية وهي نموذج حيواني مهم للتطوير الانتقالي لمركبات التوصيل إلى القوقعة. في هذه الدراسة ، وصفنا نهجا لزرع خنزير غينيا RWM مع عظم القوقعة المحيط لتجارب توصيل الأدوية الموضوعة على الطاولة. تسمح هذه الطريقة بالحفاظ على بنية RWM الأصلية وقد توفر تمثيلا أكثر واقعية للحواجز أمام النقل من نماذج الطاولة الحالية.
المقدمة
ظهرت فئات جديدة من العلاجات لعلاج فقدان السمع الحسي العصبي. إن ترجمة هذه العلاجات إلى المجموعات السريرية محدودة بطرق النقل الآمنة والفعالة إلى الأذن الداخلية. تعتمد الطرق الحالية للتسليم في الجسم الحي في الدراسات التي أجريت على إما على التكاثر في الأذن الداخلية أو الانتشار من خلال غشاء النافذة المستديرة (RWM) ، وهو حاجز غير عظمي يفصل مساحة الأذن الوسطى عن القوقعة1.
يعتبر الحقن الجراحي والحقن المجهري في الأذن الداخلية غازيين ويمكن أن يشكلان مخاطر على وظيفة الأذن الداخلية المتبقية2. لذلك ، يعد RWM طريقا مهما لتوصيل الأدوية المحلية ، وخنازير غينيا هي النموذج الحيواني الأساسي قبل السريري المستخدم لدراسة الحرائك الدوائية الدوائية المحلية عبر RWM وفي الأذن الداخلية لتطوير الأدوية 3,4. على الرغم من أنه أرق من RWM البشري ، إلا أن خنزير غينيا RWM يشترك في بنية متطابقة ثلاثية الطبقات. يبلغ قطرها حوالي 1 مم ، وسمكها 15-25 ميكرومتر ، وتتألف من طبقتين من الخلايا الظهارية التي تحيط بطبقة النسيج الضام5. الطبقة الظهارية التي تواجه الأذن الوسطى مكتظة بكثافة ومتصلة عبر تقاطعات ضيقة ، في حين أن الطبقة التي تواجه الأذن الداخلية و scala tympani لها بنية أكثر مرونة وليس لها التصاقات كبيرة بين الخلايا.
تعتمد الدراسات قبل السريرية الحالية التي تبحث في نفاذية الدواء في خنزير غينيا RWM على حقن الأذن الوسطى في الجسم الحي متبوعة بأخذ عينات من السائل المحيط بالأذن داخل الأذن الداخلية ، مما لا يسمح بإجراء دراسة محددة لنقل RWM 6,7. تم استخدام شظايا نباتات RWM في الدراسات قبل السريرية ، ولكن نظرا لهشاشتها وصغر حجمها ، فهي غير مناسبة للتحقيقات المنهجية والدقيقة لنقل الأدوية والمركبات التي تتطلب ختما مانعا للماء عبر RWM2. استخدمت مجموعات أخرى نماذج في المختبر مع خلايا ظهارية بشرية مستزرعة لتقريب RWM8،9،10. ومع ذلك ، فإن غالبية هذه التركيبات تركز فقط على الطبقة الظهارية الخارجية ولا تلتقط تعقيد بنية الأنسجة الأصلية. من أجل فهم أكثر تفصيلا لآليات النقل عبر RWM ، يلزم إجراء دراسات مستهدفة خارج الجسم الحي.
في هذه الدراسة ، نوضح زرع خنزير غينيا RWM مع الدعم العظمي المحيط للحفاظ على سلامة الغشاء وتوضيح استخدامها في نموذج تجريبي مصمم لدراسة محددة لنقل RWM لمركبات توصيل المخدرات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (GP18M226). تم استخدام خنازير غينيا Hartley albino (ذكورا وإناثا ، تزن 500-700 جم) في هذه الدراسة.
1. إعداد الإجراء وإعداده
- تعقيم جميع الأدوات بأكسيد الإيثيلين قبل بدء التجربة.
- القتل الرحيم للحيوانات وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا.
ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم استخدام غرفة غير مشحونة مسبقا لإطلاق ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100٪ (CO2) من أسطوانة تجارية. تم استخدام مقيد مضمن لتنظيم تدفق الغاز ، والحفاظ عليه في حدود 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة وفقا لإرشادات AVMAلعام 2020 11. - ضع في الغرفة ووزع ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 دقائق. يتم الحفاظ على تدفق CO2 لمدة 1 دقيقة بعد توقف التنفس.
- إجراء قطع الرأس بعد توقف التنفس لضمان القتل الرحيم.
2. النهج الجراحي والزرع
- استخراج العظم الصدغي من جمجمة خنزير غينيا بالطريقة المعتادة12. إزالة الأنسجة الرخوة الزائدة مع rongeur. حدد الصماخ الصوتي الخارجي ، الفقاعة الصدغية ، وقناة الوجه13 (الشكل 1).
- قم بحفر الجوانب البطنية للفقاعة الصدغية باستخدام لقمة ماسية مقاس 6 مم (انظر جدول المواد) ، مع تعريض مساحة الأذن الوسطى والقناة السمعية الخارجية محيطيا.
- باستخدام rongeurs ، قم بإزالة القناة السمعية الخارجية والحلقة الطبلية برفق ، مع فصل المفصل الداخلي في وقت واحد. حدد المفصل الشريبي والقناة والقناة نصف الدائرية الأفقية وقناة الوجه13 (الشكل 2 أ).
- افصل المفصل incudostapedial وأزل السنك باستخدام ملقط. تحديد مكانة عظمية من النافذة المستديرة.
- استخدم لقمة ماسية مقاس 6 مم لحفر الصفيحة العظمية التي تربط القوقعة بالجدار الإنسي للتجويف الطبلي باتجاه قناة الطبلة الموترة. قم بفك ضغط القناة العظمية للطبلة الموتر بعناية وإزالة عضلة الطبلة الموترة باستخدام إبرة 28 جرام.
ملاحظة: يتصل الجدار الإنسي لحفرة الطبلة الموترة مباشرة بعظم القوقعة حول RWM ، ويتم الحرص على عدم التسبب في كسور يمكن أن تمتد إلى النافذة المستديرة. - تخلص من الصفيحة العظمية التي تربط القوقعة بالجدار السفلي للتجويف الطبلي حتى يكون هناك 1 مم من الحافة العظمية المتاخمة للقوقعة المتبقية (الشكل 2 ب).
- باستخدام لقمة ماسية 2 مم (انظر جدول المواد) ، قم بعمل فغر القوقعة عند المنعطف القاعدي للقوقعة ، تاركا حوالي 2 مم من العظم إلى النافذة المستديرة. استمر في فغر القوقعة بشكل سفلي في مستوى مواز لغشاء النافذة المستديرة لفصل القاعدة عن قمة القوقعة.
- قم بتمديد قطع فغر القوقعة عبر قاعدة الجمجمة ، والتي تكون أكثر كثافة ، مما يؤدي إلى عرض مقطعي للمنعطف القاعدي للقوقعة.
ملاحظة: يؤدي توجيه المثقاب نحو صماخ القناة السمعية الداخلية إلى مسار يزيد من إزالة العظام مع تجنب العبور بالقرب من النافذة المستديرة. - افحص العينة من جانب قاعدة الجمجمة ، وإذا لم يتم ذلك بالفعل ، فحدد القناة السمعية الداخلية وحفر فتحة القوقعة. قم بإزالة العصب القوقعي بإبرة 28 جرام.
- فحص العينة من الجانب داخل القوقعة. تحديد وإزالة الصفيحة الحلزونية العظمية في المنعطف القاعدي والموديولوس المتبقية بالملقط أو إبرة 28 جرام.
- قم بري تجويف سكالا تيمباني-سكالا الدهليزي الموحد بغزارة لإزالة الحطام. يجب أن تكون النافذة المستديرة مرئية بوضوح من استئصال القوقعة دون أي حطام علوي (الشكل 2C).
- بعد ذلك ، افحص العينة من جانب الأذن الوسطى. حفر القناة نصف الدائرية الجانبية وقناة الوجه إلى مستوى النافذة البيضاوية. قم بإزالة الركابي برفق باستخدام ملقط ، وفضح مكانة النافذة البيضاوية. من الجدير بالذكر أن هناك جسرا عظميا بين كرورا الركابي المعروف باسم crista stapedis.
- باستخدام مثقاب ماسي 1 مم (انظر جدول المواد) ، افتح الدهليز أكثر عن طريق تمديد النافذة البيضاوية على طول وجه النافذة المستديرة ، مع الحرص على الحفاظ على 1-2 مم من عظم القوقعة المتاخم لمكانة النافذة المستديرة (الشكل 2 د).
- أكمل جروح العظم الصدغي عن طريق توصيل قطع النافذة البيضاوية بقطع استئصال القوقعة على كل جانب من جوانب النافذة المستديرة.
ملاحظة: نظرا لهشاشة عظم القوقعة ، فإن الحفاظ على حفرة الطبلة الموترة في العينة وتجنب الجروح من خلالها سيساعد على منع كسور عظام القوقعة التي تمتد إلى RWM وتعرض سلامتها للخطر. - قم بعمل المرفقات النهائية للعظم الكثيف لقاعدة الجمجمة المجاورة للقناة السمعية الداخلية واحلق برفق لينتج عنه عينة RWM مستأصلة (الشكل 3 أ).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تسمح هذه الطريقة بزرع غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا السليم بحلقة محيطة من العظم الصلب. يجب أن تكون RWM متصلة بالكامل بالحلقة العظمية محيطيا. لا ينبغي تقدير أي كسور في عظم القوقعة. بالمقارنة مع عينات النوافذ المستديرة البشرية ، لا يحتوي خنزير غينيا RWM على غشاء كاذب يعلو. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس البشر ، هناك جسر عظمي بين كرورا من ركائز خنزير غينيا ، الأمر الذي يتطلب التكسير والإزالة قبل استخراج البنية الفوقية الركابية. يظهر التحليل النسيجي (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في توصيل الدواء المحلي إلى الأذن ، يعد RWM هو الطريق الرئيسي لمرور العلاجات للوصول إلى الأذن الداخلية. هناك حاجة إلى نموذج دقيق وموثوق به على الطاولة لفهم آليات النقل والنفاذية بشكل أفضل عبر مركبات التسليم الجديدة ولتطوير الأدوية. في هذه الدراسة ، أثبتنا أن زراعة خنزير غينيا RWM هو إجراء ممكن ويمكن الاعتماد عليه للسماح بإجراء تحقيقات منهجية للتفاعلات بين غشاء الدواء. وصف Lundman et al. و Kelso et al. سابقا استخدام نموذج نفاذية RWM مماثل2،16 ؛ ومع ذلك ، لم يتم تفص...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات للقيام بها.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح NIDCD رقم 1K08DC020780 و 5T32DC000027-33 ، وصندوق روبنشتاين لأبحاث السمع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مم مثقاب الكرة الماسية | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 مم مثقاب الكرة الماسية | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 مم مثقاب الكرة الماسية | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | سيعمل أي نظام حفر لقطع العظام |
| BD Eclipse Needle 27 G × 1/2 بوصة. مع حقنة BD Luer-Lok قابلة للفصل 1 | بيكتون وديكنسون وشركاه | 382903057894 | أي إبرة 27-28 جرام |
| غوريلا إيبوكسي | غوريلا | 4200101 | |
| Kwik-CAST | أدوات الدقة العالمية | KWIK-CAST |
المراجع
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789(2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032(2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
