خنزير غينيا جولة نافذة غشاء الزرع للدراسات خارج الجسم الحي

ظهرت فئات جديدة من العلاجات لعلاج فقدان السمع الحسي العصبي. إن ترجمة هذه العلاجات إلى المجموعات السريرية محدودة بطرق النقل الآمنة والفعالة إلى الأذن الداخلية. تعتمد الطرق الحالية للتسليم في الجسم الحي في الدراسات التي أجريت على إما على التكاثر في الأذن الداخلية أو الانتشار من خلال غشاء النافذة المستديرة (RWM) ، وهو حاجز غير عظمي يفصل مساحة الأذن الوسطى عن القوقعة¹.

يعتبر الحقن الجراحي والحقن المجهري في الأذن الداخلية غازيين ويمكن أن يشكلان مخاطر على وظيفة الأذن الداخلية المتبقية². لذلك ، يعد RWM طريقا مهما لتوصيل الأدوية المحلية ، وخنازير غينيا هي النموذج الحيواني الأساسي قبل السريري المستخدم لدراسة الحرائك الدوائية الدوائية المحلية عبر RWM وفي الأذن الداخلية لتطوير الأدوية ^3,4. على الرغم من أنه أرق من RWM البشري ، إلا أن خنزير غينيا RWM يشترك في بنية متطابقة ثلاثية الطبقات. يبلغ قطرها حوالي 1 مم ، وسمكها 15-25 ميكرومتر ، وتتألف من طبقتين من الخلايا الظهارية التي تحيط بطبقة النسيج الضام⁵. الطبقة الظهارية التي تواجه الأذن الوسطى مكتظة بكثافة ومتصلة عبر تقاطعات ضيقة ، في حين أن الطبقة التي تواجه الأذن الداخلية و scala tympani لها بنية أكثر مرونة وليس لها التصاقات كبيرة بين الخلايا.

تعتمد الدراسات قبل السريرية الحالية التي تبحث في نفاذية الدواء في خنزير غينيا RWM على حقن الأذن الوسطى في الجسم الحي متبوعة بأخذ عينات من السائل المحيط بالأذن داخل الأذن الداخلية ، مما لا يسمح بإجراء دراسة محددة لنقل RWM ^6,7. تم استخدام شظايا نباتات RWM في الدراسات قبل السريرية ، ولكن نظرا لهشاشتها وصغر حجمها ، فهي غير مناسبة للتحقيقات المنهجية والدقيقة لنقل الأدوية والمركبات التي تتطلب ختما مانعا للماء عبر RWM². استخدمت مجموعات أخرى نماذج في المختبر مع خلايا ظهارية بشرية مستزرعة لتقريب RWM^8،9،10. ومع ذلك ، فإن غالبية هذه التركيبات تركز فقط على الطبقة الظهارية الخارجية ولا تلتقط تعقيد بنية الأنسجة الأصلية. من أجل فهم أكثر تفصيلا لآليات النقل عبر RWM ، يلزم إجراء دراسات مستهدفة خارج الجسم الحي.

في هذه الدراسة ، نوضح زرع خنزير غينيا RWM مع الدعم العظمي المحيط للحفاظ على سلامة الغشاء وتوضيح استخدامها في نموذج تجريبي مصمم لدراسة محددة لنقل RWM لمركبات توصيل المخدرات.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (GP18M226). تم استخدام خنازير غينيا Hartley albino (ذكورا وإناثا ، تزن 500-700 جم) في هذه الدراسة.

1. إعداد الإجراء وإعداده

1. تعقيم جميع الأدوات بأكسيد الإيثيلين قبل بدء التجربة.
2. القتل الرحيم للحيوانات وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا.
   ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم استخدام غرفة غير مشحونة مسبقا لإطلاق ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100٪ (CO₂) من أسطوانة تجارية. تم استخدام مقيد مضمن لتنظيم تدفق الغاز ، والحفاظ عليه في حدود 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة في الدقيقة وفقا لإرشادات AVMA^{لعام 2020 11}.
3. ضع في الغرفة ووزع ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 دقائق. يتم الحفاظ على تدفق CO₂ لمدة 1 دقيقة بعد توقف التنفس.
4. إجراء قطع الرأس بعد توقف التنفس لضمان القتل الرحيم.

2. النهج الجراحي والزرع

1. استخراج العظم الصدغي من جمجمة خنزير غينيا بالطريقة المعتادة¹². إزالة الأنسجة الرخوة الزائدة مع rongeur. حدد الصماخ الصوتي الخارجي ، الفقاعة الصدغية ، وقناة الوجه¹³ (الشكل 1).
2. قم بحفر الجوانب البطنية للفقاعة الصدغية باستخدام لقمة ماسية مقاس 6 مم (انظر جدول المواد) ، مع تعريض مساحة الأذن الوسطى والقناة السمعية الخارجية محيطيا.
3. باستخدام rongeurs ، قم بإزالة القناة السمعية الخارجية والحلقة الطبلية برفق ، مع فصل المفصل الداخلي في وقت واحد. حدد المفصل الشريبي والقناة والقناة نصف الدائرية الأفقية وقناة الوجه¹³ (الشكل 2 أ).
4. افصل المفصل incudostapedial وأزل السنك باستخدام ملقط. تحديد مكانة عظمية من النافذة المستديرة.
5. استخدم لقمة ماسية مقاس 6 مم لحفر الصفيحة العظمية التي تربط القوقعة بالجدار الإنسي للتجويف الطبلي باتجاه قناة الطبلة الموترة. قم بفك ضغط القناة العظمية للطبلة الموتر بعناية وإزالة عضلة الطبلة الموترة باستخدام إبرة 28 جرام.
   ملاحظة: يتصل الجدار الإنسي لحفرة الطبلة الموترة مباشرة بعظم القوقعة حول RWM ، ويتم الحرص على عدم التسبب في كسور يمكن أن تمتد إلى النافذة المستديرة.
6. تخلص من الصفيحة العظمية التي تربط القوقعة بالجدار السفلي للتجويف الطبلي حتى يكون هناك 1 مم من الحافة العظمية المتاخمة للقوقعة المتبقية (الشكل 2 ب).
7. باستخدام لقمة ماسية 2 مم (انظر جدول المواد) ، قم بعمل فغر القوقعة عند المنعطف القاعدي للقوقعة ، تاركا حوالي 2 مم من العظم إلى النافذة المستديرة. استمر في فغر القوقعة بشكل سفلي في مستوى مواز لغشاء النافذة المستديرة لفصل القاعدة عن قمة القوقعة.
8. قم بتمديد قطع فغر القوقعة عبر قاعدة الجمجمة ، والتي تكون أكثر كثافة ، مما يؤدي إلى عرض مقطعي للمنعطف القاعدي للقوقعة.
   ملاحظة: يؤدي توجيه المثقاب نحو صماخ القناة السمعية الداخلية إلى مسار يزيد من إزالة العظام مع تجنب العبور بالقرب من النافذة المستديرة.
9. افحص العينة من جانب قاعدة الجمجمة ، وإذا لم يتم ذلك بالفعل ، فحدد القناة السمعية الداخلية وحفر فتحة القوقعة. قم بإزالة العصب القوقعي بإبرة 28 جرام.
10. فحص العينة من الجانب داخل القوقعة. تحديد وإزالة الصفيحة الحلزونية العظمية في المنعطف القاعدي والموديولوس المتبقية بالملقط أو إبرة 28 جرام.
11. قم بري تجويف سكالا تيمباني-سكالا الدهليزي الموحد بغزارة لإزالة الحطام. يجب أن تكون النافذة المستديرة مرئية بوضوح من استئصال القوقعة دون أي حطام علوي (الشكل 2C).
12. بعد ذلك ، افحص العينة من جانب الأذن الوسطى. حفر القناة نصف الدائرية الجانبية وقناة الوجه إلى مستوى النافذة البيضاوية. قم بإزالة الركابي برفق باستخدام ملقط ، وفضح مكانة النافذة البيضاوية. من الجدير بالذكر أن هناك جسرا عظميا بين كرورا الركابي المعروف باسم crista stapedis.
13. باستخدام مثقاب ماسي 1 مم (انظر جدول المواد) ، افتح الدهليز أكثر عن طريق تمديد النافذة البيضاوية على طول وجه النافذة المستديرة ، مع الحرص على الحفاظ على 1-2 مم من عظم القوقعة المتاخم لمكانة النافذة المستديرة (الشكل 2 د).
14. أكمل جروح العظم الصدغي عن طريق توصيل قطع النافذة البيضاوية بقطع استئصال القوقعة على كل جانب من جوانب النافذة المستديرة.
    ملاحظة: نظرا لهشاشة عظم القوقعة ، فإن الحفاظ على حفرة الطبلة الموترة في العينة وتجنب الجروح من خلالها سيساعد على منع كسور عظام القوقعة التي تمتد إلى RWM وتعرض سلامتها للخطر.
15. قم بعمل المرفقات النهائية للعظم الكثيف لقاعدة الجمجمة المجاورة للقناة السمعية الداخلية واحلق برفق لينتج عنه عينة RWM مستأصلة (الشكل 3 أ).

كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تسمح هذه الطريقة بزرع غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا السليم بحلقة محيطة من العظم الصلب. يجب أن تكون RWM متصلة بالكامل بالحلقة العظمية محيطيا. لا ينبغي تقدير أي كسور في عظم القوقعة. بالمقارنة مع عينات النوافذ المستديرة البشرية ، لا يحتوي خنزير غينيا RWM على غشاء كاذب يعلو. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس البشر ، هناك جسر عظمي بين كرورا من ركائز خنزير غينيا ، الأمر الذي يتطلب التكسير والإزالة قبل استخراج البنية الفوقية الركابية. يظهر التحليل النسيجي (الشكل 3 ب) ل RWM التمثيلي بنية ظهارية واضحة ثلاثية الطبقات مع مكانة نافذة مستديرة مجاورة سليمة.

من منظور التقنية ، هناك خطوتان حاسمتان. أولا ، عند إجراء استئصال القوقعة في الخطوة 2.7 ، من المهم استخدام خط الاستواء لقمة الحفر ، بدلا من الطرف ، لإجراء القطع ، حيث يمكن أن يؤدي التوتر عند طرف الأزيز إلى كسور رضحية في عظم القوقعة قد تمتد إلى غشاء النافذة المستديرة. ثانيا ، من المهم حفر القناة السمعية الداخلية بالكامل ، حيث يسمح ذلك بالإزالة الكاملة لعصب القوقعة وتشريح أسهل للصفيحة الحلزونية العظمية ، مما يؤدي إلى تجويف موحد على الجانب داخل القوقعة لأخذ العينات التجريبية (الشكل 2C).

بعد استخراج RWM بنجاح ، استخدمت مجموعتنا غرفة استخدام معدلة لتقييم الخصائص الدوائية للغشاء. تم التحقق من صحة غرفة Ussing المعدلة من قبل مجموعات أخرى في أغشية النوافذ الطبلية والمستديرة وكذلك أنسجة الشبكية لتقييم خصائص نقل الأغشية الظهارية14,15. تم إنشاء هذا الجهاز المطبوع ثلاثي الأبعاد باستخدام Poly-Jet Vero ويتكون من قطعتين أساسيتين مثلثتين ، لكل منهما غرفة سائل 400 ميكرولتر (الشكل 3). يتم لصق الحافة العظمية ل RWM على القاعدة باستخدام الإيبوكسي المكون من جزأين (Gorilla ، انظر جدول المواد) ، متبوعا بمانع تسرب السيليكون (انظر جدول المواد) لضمان ختم محكم للماء (الشكل 4). يتم توخي الحذر الدقيق لتجنب أي إيبوكسي أو مادة مانعة للتسرب تلامس الغشاء. مع وضع RWM في مكانه ، يتم بعد ذلك لصق القاعدتين مع الإيبوكسي. أثناء تجارب النقل ، يتم ملء التحميل (مواجهة الأذن الوسطى) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على مركبة التوصيل (أو أي جزيء مهم) ، ويتم ملء غرفة أخذ العينات (مواجهة سكالا تيمباني) ب PBS فقط. على فترات زمنية منتظمة ، يتم استنشاق السائل من غرفة أخذ العينات بالكامل واستبداله ب PBS جديد.

يتم اتخاذ تدابير مراقبة الجودة خلال كل تجربة لضمان وجود ختم محكم للماء حول العينة داخل الجهاز ، بالإضافة إلى غشاء سليم تماما بدون ثقوب دقيقة. النتائج التمثيلية مع محلول الجسيمات النانوية ذات النواة الحديدية البنية موضحة أدناه. يتم التحقق الكمي من ختم محكم الغلق عن طريق استنشاق الحجم الكامل لغرفة أخذ العينات خلال كل فترة أخذ العينات ؛ سيؤدي تسرب السوائل من غرفة أخذ العينات إلى أقل من حجم الشفط الكامل. في ختام كل تجربة ، يجب أن يظل حجم السائل في غرفة التحميل كما هو. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن السائل المستهدف بني اللون ، فإنه يمكن رؤيته بسهولة في حالة حدوث تسرب.

لضمان عدم وجود تسرب داخل الغشاء ، تم اتباع عدة طرق. أولا ، يتم استخراج جميع عينات RWM المستخدمة في هذه الدراسة على الفور ، وتؤكد صور المجهر الضوئي والبؤري والإلكتروني الهياكل الخلوية والأغشية السليمة بدون ثقوب دقيقة (الشكل 3A ، B). ثانيا ، تم إنشاء ثقوب دقيقة عمدا في مجموعة فرعية من عينات RWM لمقارنة التأثير على توصيل الجسيمات النانوية. يعمل الفحص البصري لنضح غرفة أخذ العينات والتحميل كتأكيد إضافي على سلامة العينة والتثبيت المحكم للماء. في RWM مع الثقوب ، هناك توازن سريع لغرفة التحميل وأخذ العينات ، والتي يمكن ملاحظتها من خلال تغيير لون مميز (الشكل التكميلي 1). بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن النقل في RWMs المثقوبة الدقيقة كان أعلى من التباين الأقصى الملاحظ في الأغشية السليمة (الشكل التكميلي 2). تعمل هذه معا كآليات لمراقبة الجودة من أجل سلامة الختم المحكم للماء المحيط بالعينة ، وكذلك RWM.

الشكل 1: صورة قبل الجراحة للعظم الصدغي لخنزير غينيا. تظهر الفقاعة الطبلية والقناة السمعية الخارجية وقناة الوجه (*) في هذه الصورة قبل الجراحة للعظم الصدغي لخنزير غينيا. شريط المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: الصور أثناء العملية. صور أثناء العملية توضح العلاقة بين غشاء النافذة المستديرة والسنب (*) ، القوقعة (**) ، الركابي (†) ، والقناة السمعية الداخلية غير المضغوطة (‡). تشير المناطق المظللة إلى أجزاء من العينة التي سيتم إزالتها. (أ) تجويف الأذن الوسطى لخنزير غينيا بعد إزالة الغشاء الطبلي والعصب الوجهي (الخطوة 2.3). (ب) تجويف الأذن الوسطى بعد تخفيف الضغط عن القناة الطبلية الموترة (الخطوة 2.6). (C) المنظر القاعدي ل RWM بعد فغر القوقعة وإزالة محتويات الأذن الداخلية (الخطوة 2.11). (د) منظر RWM بعد إزالة الركابي وتحديد الدهليز (الخطوة 2.13). شريط المقياس = أ ، ب (1 سم) ؛ C ، D (5 مم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: عينة RWM النهائية والأنسجة. (أ) خنزير غينيا RWM العينة الإجمالية ذات الحلقة العظمية. شريط المقياس = 1 سم. (ب) توضح أنسجة غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا المزروع بنية سليمة ثلاثية الطبقات. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: جهاز الموائع الدقيقة لتجارب النقل عبر الغشائي. أ: رسم تخطيطي لجهاز الموائع الدقيقة المستخدم في تجارب النقل عبر الغشائي. (ب، ج) جهاز الموائع الدقيقة المطبوعة للتجارب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تحميل محتويات غرفة أخذ العينات على تجربة توصيل الجسيمات النانوية الأساسية الحديدية لمدة 5 ساعات. (أ) تظهر غرفة تحميل RWM السليمة انخفاضا تدريجيا في كثافة اللون مع انخفاض تركيز الجسيمات النانوية. (ب) تظهر غرفة أخذ العينات من RWM سليمة تلوينا مستقرا بمرور الوقت ، بما يتفق مع المستويات المنخفضة لتوصيل الجسيمات النانوية. (C) توضح غرفة التحميل ل RWM المثقبة انخفاضا سريعا في كثافة اللون حيث تتوازن المحتويات مع غرفة أخذ العينات. (د) تظهر غرفة أخذ العينات من RWM المثقوبة زيادة تدريجية في اللون بمرور الوقت ، بما يتفق مع المستويات العالية لتوصيل الجسيمات النانوية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: نتائج النقل التمثيلي لتوصيل الجسيمات النانوية. نتائج النقل التمثيلية لتوصيل الجسيمات النانوية (لب Fe3O4 مع طلاء البولي إيثيلين جلايكول ، متوسط نصف قطر 77 نانومتر) عبر خنزير غينيا RWM ، سواء سليمة أو مع ثقوب (متوسط ± SD ، n ≥ 3 تجارب RWM). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات للقيام بها.